动物可食性组织中克拉维酸残留HPLC-MS/MS检测方法

【目的】建立动物可食性组织中克拉维酸残留检测的高效液相色谱-串联质谱方法。【方法】1 g组织样品用3 mL 0.01 mol•L-1乙酸铵和3 mL乙腈提取后,经二氯甲烷反相提取净化,取水相定容到4 mL,正己烷除脂后上机检测。流动相为乙腈和0.1%甲酸水,梯度洗脱,经Luna 5μ C8色谱柱分离,采用电喷雾电离,多反应监测负离子模式对克拉维酸进行定量分析。【结果】采用基质匹配法对组织中克拉维酸的含量进行标准校正,克拉维酸质量浓度在5—500 μg•L-1范围内与峰面积间呈现良好的线性关系（r＞0.999）;组织中加标样品的检出限（按信噪比S/N≥3计）为10 μg•kg-1,定量限（按信噪比S/N≥10计）为20 μg•kg-1。在定量限、1/2最高残留限量、最高残留限量、2倍最高残留限量4个添加水平下,组织中克拉维酸的平均回收率为76.39%—89.26%,日间相对标准偏差为1.89%—6.20%。【结论】该方法可用于动物可食性组织中克拉维酸残留的分析检测。     

不同装烟方式对烤烟烘烤烟叶品质和安全性的影响

【目的】探讨装烟方式和烤烟中烟叶品质形成的机理,进一步提高烤烟烘烤烟叶质量和安全性。【方法】研究普通挂竿（T1）、密集挂竿（T2）和散叶插扦（T3）烘烤过程中烟叶水分、类胡萝卜素和叶表提取物组分含量的变化,分析烤后烟叶主要化学成分、中性香味物质、烟气有害成分含量及感官质量的差异。【结果】烘烤中T3处理烟叶失水较慢,48—72 h与T2处理差异显著（P＜0.05）。T3处理烘烤中烟叶β-胡萝卜素与叶黄素含量降幅分别为62.91%和69.45%,大于T1（57.59%、65.19%）和T2处理（57.59%、60.31%）,烤后烟叶含量最低。T1和T3处理烤后烟叶腺毛分泌物含量较高,损失率分别为8.82%和10.52%,T2处理含量最低,损失率为54.05%;T3处理烤后烟叶表面烷烃类含量最高,损失率为13.80%,T2处理最低,损失率为58.91%。T3处理烤后烟叶糖碱比值（10.67）较适宜,感官评吸分值（60.75分）和中性香味物质含量最高（1 186.65 μg•g-1）。不同处理烤后烟叶烟气羰基化合物含量大小表现为：T3（1 034.08 μg•cig-1）＜T1（1 144.76 μg•cig-1）＜T2（1 251.19 μg•cig-1）,其中T1和T2差异显著（P＜0.05）;烟气酚类物质含量大小表现为：T3（149.93 μg•cig-1）＜T2（157.71 μg•cig-1）＜T1（175.60 μg•cig-1）。T3处理巴豆醛、CO和苯并[a]芘含量最低;T2和T3处理HCN含量较低,且显著低于T1处理（P＜0.05）。【结论】与T1和T2相比,T3处理烘烤中烟叶失水较慢,类胡萝卜素降解较充分,烤后烟叶化学成分更协调,香味物质含量和感官评价分值较高,烟气有害成分含量较低,烤后烟叶质量综合评价最佳。     

中华猕猴桃褐斑病病原鉴定及抑菌药剂筛选

【目的】确定引起中华猕猴桃褐斑病病原菌种类,研究常用杀菌剂对该病原菌菌丝生长的抑制作用。【方法】对病原菌进行分离、纯化、致病性测定以及形态学、分子生物学鉴定,确定病原菌种类;选用常用的18种杀菌剂分别对病原菌进行抑菌效果测定,并建立毒力回归方程;筛选出有效的抑菌药剂,为防治该病的发生提供理论依据。【结果】从不同病斑上分离出了3个纯化菌株,其形态特征相同。通过病原菌rDNA-ITS克隆测序、比对分析,3个菌株为同一致病菌,应用BLASTn比对结合形态学特征确定该致病菌为链格孢（Alternaria alternata (Fr.:Fr.) Keissler）。在10 μg•mL-1含药PDA平板上,7种杀菌剂对链格孢菌菌株的抑菌率均大于80%,分别为400 g•L-1氟硅唑、500 g•L-1异菌脲、80%戊唑醇、10%多抗霉素B、12.5%烯唑醇、33.5%喹啉酮和10%苯醚甲环唑。【结论】确定中华猕猴桃褐斑病由链格孢引起,400 g•L-1氟硅唑、500 g•L-1异菌脲、10%多抗霉素B和10%苯醚甲环唑对链格孢抑菌效果较强。     

Pen a 1表位抗原多克隆抗体的制备及鉴定

【目的】建立一种识别、检测致敏蛋白的新方法。【方法】Pen a 1为虾中主要的致敏蛋白,从其5个主要IgE结合区中选择一段具有代表性的（85—105位）含21个氨基酸的多肽序列,进行化学合成,将多肽分别与匙孔血蓝蛋白（KLH）和牛血清白蛋白（BSA）偶联,制得免疫原和包被原,免疫原免疫新西兰纯种白兔得到多克隆抗体。以刀额新对虾蛋白、卵清蛋白、花生蛋白和牛奶蛋白为样品,免疫印迹鉴定多克隆抗体对刀额新对虾中Pen a 1蛋白的特异性。【结果】经Ellman试剂测定多肽与KLH、BSA的偶联比分别为 12﹕1和8﹕1。间接非竞争ELISA测定多克隆抗体的效价达1.024×106,间接竞争ELISA(icELISA)测定该多克隆抗体对多肽的IC50和IC10分别为0.4324 μg•mL-1和0.0004 μg•mL-1,表明多克隆抗体对多肽具有较强的灵敏性。免疫印迹试验结果表明,此多克隆抗体仅可识别刀额新对虾蛋白中的Pen a 1蛋白,对所选其它物种蛋白无响应。【结论】通过人工合成多肽制备的抗体可用于目标致敏蛋白质的检测分析,该方法快捷灵敏,且具有较高的特异性。     

非变性原位杂交技术在芝麻染色体识别上的探索与应用

【目的】研究和确定芝麻ND-FISH最优试验条件,并对其在芝麻染色体识别中的可行性进行探索。【方法】以寡聚核苷酸(AC)8为探针,研究不同洗脱强度、酶解时间和杂交时间对ND-FISH的影响,确定芝麻ND-FISH最优试验方案。【结果】芝麻ND-FISH最优方案：制片在浓度100 μg•mL-1 RNase A酶解1 h,探针浓度6 µL（20 ng•µL-1）,杂交4 h,4 × SSC/0.2% Tween 20溶液洗脱10 min;18条染色体存在(AC)8杂交信号,其中,14条染色体上存在较强杂交信号,4条染色体上有较弱杂交信号,结合染色体长度及臂比,18条染色体可有效识别。【结论】利用ND-FISH技术、以(AC)8为探针成功识别栽培芝麻的18条染色体。     

CO2浓度和抗药性对褐飞虱刺吸取食行为的影响

【目的】明确CO2浓度升高是否影响褐飞虱的取食行为以及抗药褐飞虱品系的刺吸行为是否与敏感品系存在差异,从而为预测CO2浓度升高条件下不同抗药性褐飞虱对水稻的致害性提供依据。【方法】采用刺吸电位技术（EPG）观察褐飞虱抗、感噻嗪酮品系（抗性水平相差约480倍）对当前（390 μL•L-1）和升高CO2浓度（780 μL•L-1）下生长水稻的口针刺吸行为,用双因素方差分析比较CO2浓度和抗药性2因素对口针刺吸显示的6种波形持续时间和频次的差异。【结果】CO2浓度加倍倾向于缩短感噻嗪酮褐飞虱在韧皮部摄取汁液的总时间,与抗药性互作显著影响开始刺探行为的频次：CO2浓度加倍条件下（780 μL•L-1）抗性褐飞虱开始刺探的频次低于当前CO2浓度下（390 μL•L-1）。抗噻嗪酮褐飞虱口针朝维管束移动和在木质部摄取汁液的时间延长,但在韧皮部内部活动的时间缩短;口针在韧皮部内部活动的频次增多,但在韧皮部和木质部摄取汁液的频次减少。【结论】抗噻嗪酮褐飞虱对水稻的致害性明显强于感噻嗪酮褐飞虱;CO2浓度升高可能使感噻嗪酮褐飞虱对水稻的致害性减弱,但对抗噻嗪酮褐飞虱没有显著影响。     

NO对缺氮胁迫下棉花幼苗生理生长的调控效应

【目的】探讨外源一氧化氮（Nitric oxide,NO）对氮素胁迫下棉花幼苗生长和叶片生理性状的影响,为NO的供体硝普钠（Sodium nitroprusside,SNP）调控棉花生长发育提供理论依据。【方法】采用水培处理,设置两个对照：以全营养素Hoagland营养液培养棉花幼苗为对照1（CK1）,缺氮Hoagland营养液培养棉花幼苗为对照2（CK2）。在CK2的基础上,利用SNP处理棉花幼苗,设置5个处理,每个处理SNP浓度分别为50、100、200、500和1 000 μmol•L-1,研究NO对氮胁迫下棉花幼苗生理生长的调控效应。【结果】氮素胁迫对棉花幼苗产生抑制作用,导致棉苗的光合系统及蛋白质、脯氨酸含量产生变化。低浓度外源NO能明显促进氮素胁迫下棉花幼苗的生长,显著提高叶绿素、脯氨酸及可溶性蛋白含量,其中以100 μmol•L-1 SNP缓解胁迫效果最好。而高浓度的外源NO则加剧氮素胁迫对棉苗的抑制。【结论】低浓度外源NO（SNP:50—100 μmol•L-1）的确能缓解氮素胁迫对棉花幼苗造成的伤害,提高棉花幼苗对氮素胁迫的耐性。     

高效液相体积排阻色谱法测定稻米支链淀粉链长的相对分子质量分布

【目的】建立稻米支链淀粉链长相对分子质量分布的高效液相体积排阻色谱法（high performance size exclusion chromatography, HPSEC）的测定方法。【方法】先采用丁醇沉降法分离提纯稻米支链淀粉,纯化后的支链淀粉经异淀粉酶酶解切开分支糖苷键,然后运用HPSEC测定其相对分子质量分布。建立了稻米支链淀粉链长相对分子质量分布的HPSEC分析方法：Shodex SB-G、Shodex SB-803（1 000—100 000）、Shodex SB-802.5（300—10 000）3根凝胶色谱柱串连,柱温40℃;流动相为0.1 mol•L-1 Tris+0.1 mol•L-1 NaCl,pH=7.40,流速0.5 mL•min-1;采用示差折光检测器（Differential refractive index detector, RI）,检测器温度为37℃;待测样品浓度为5 mg•mL-1,进样量20 μL。【结果】本法提纯的稻米支链淀粉：淀粉含量为99.4%、蛋白残余为0.02%、支链淀粉碘复合物最大吸收峰为517 nm,为高纯度支链淀粉。供试大米样品脱分支支链淀粉的平均聚合度（DP）分布在2—120,无杂峰干扰。【结论】试验结果和方法验证表明本方法数据可靠、重复性好、简单易行。     

绿盲蝽水溶性海藻糖酶ALTre-1基因原核表达、 纯化与酶学特性

【目的】在前期克隆了绿盲蝽水溶性海藻糖酶（ALTre-1）基因的基础上,以获得具有酶活性的重组蛋白,明确酶促反应的最佳pH值及最适温度,为绿盲蝽海藻糖酶分子调控机制及其抑制剂的应用研究奠定基础。【方法】将含有绿盲蝽ALTre-1基因的T载体经Nde I和Not I双酶切,构建ALTre-1基因原核表达载体（pET28a-ALTre-1）,表达载体经诱导表达和蛋白纯化,获得ALTre-1功能区纯化蛋白。在蛋白浓度为0.3 mg•mL-1的条件下,以海藻糖为底物,对纯化得到的重组Tre-1蛋白进行活性检测,确定其酶促反应的最佳pH值和最佳温度。【结果】ALTre-1基因在大肠杆菌中BL21中能够高效表达,纯化获得的重组蛋白在试验条件下有较高的海藻糖酶水解活性（（184.83±13.39）nmol•μg-1•min-1）。重组ALTre-1蛋白活性最适pH值为7.0（酶活性为（202.04±13.76）nmol•μg-1•min-1）,表明重组ALTre-1蛋白是1个在中性环境中具有最佳活性的海藻糖酶,同时重组ALTre-1蛋白酶活性最适温度为55℃（酶活性为（228.59±4.62）nmol•μg-1•min-1）。【结论】本研究克隆得到了ALTre-1全长基因,获得了具有海藻糖酶活的重组蛋白,该重组蛋白在pH 7.0、温度55℃条件下酶活性最高。     

中国马铃薯疮痂病菌快速PCR检测技术

【目的】马铃薯疮痂病菌具有明显的组成多样性,通过筛选不同疮痂病菌的通用探针引物,建立针对该类病原菌的定性检测方法。【方法】以目前中国存在的不同致病种的代表菌株CPS-1（Streptomyces scabies）、CPS-2（S. galilaeus）、CPS-3（S. acidiscabies）、CPS-4（S. turgidiscabies）为材料,根据NCBI GenBank中已登记的疮痂病菌特有毒素合成基因簇中的基因txtA、txtB、txtC（P450）、txtD（nos）等序列设计引物,对不同菌株的基因组扩增,选择特异性和稳定性较高的引物作为探针引物,经温度梯度筛选优化反应体系后建立成熟的检测技术。【结果】获得的通用检测引物B1/B2对所有致病菌株均表现较好的特异性,可稳定扩出目的条带,而非致病菌株均无条带。利用孢子稀释法验证建立的检测方法对菌株DNA的灵敏度为20 pg•μL-1,对孢子的检测阈值约为4.0 CFU/μL。对测试样品基因组扩增结果表明,疮痂病原链霉菌、病薯样品组织、病田土样均检测到目的条带,而非疮痂病原链霉菌、健康薯块组织、非病田土样和其它菌株均未扩出目的条带,说明该方法的特异性较好。【结论】建立了马铃薯疮痂病菌的定性检测方法,可实现对菌株、病组织和土壤样品的快速检测。     

四环素类药物多残留酶联免疫检测方法

 【目的】构建一种四环素类药物多残留酶联免疫检测试剂盒。【方法】将四环素类药物与载体蛋白相连作为抗原免疫动物,获得了抗四环素类药物的抗体,建立了动物性食品中四环素类药物残留的ELISA检测方法,并将该试剂盒的检测性能与进口试剂盒比较,对实际样品的测定结果与高效液相-串联质谱法比较。【结果】人工抗原中四环素与蛋白质分子的结合比约为15﹕1,血清效价达到1﹕2 000倍以上,50%抑制浓度(IC50)为3 μg?L-1左右,7种四环素类药物交叉反应率在58%～100%之间,牛奶和鸡肉中四环素类药物的检测限分别为6.6 μg?L-1和6.5 μg?kg-1, 在鸡肉中四环素、土霉素和金霉素的回收率在40%～120%之间。【结论】试剂盒的最低检测限为0.3 μg?L-1,检测范围为0.3～30 μg?L-1,可同时测定兽医常用的四环素、金霉素、土霉素和多西环素4种药物残留。灵敏度、精密度和准确度均能满足兽药残留检测要求。     

动物尿液中苯乙醇胺A胶体金快速检测方法的建立

【目的】苯乙醇胺A为一种新型违禁添加剂,目前的检测方法繁琐耗时,故建立动物尿液中苯乙醇胺A胶体金免疫层析快速检测方法。【方法】通过苯乙醇胺A与溴代戊醛发生亲核取代反应,制备得到苯乙醇胺A半抗原,将苯乙醇胺A半抗原与载体蛋白偶联得到免疫原和包被原,经TNBS法测定半抗原与载体蛋白偶联比。用免疫原免疫BALB/c小鼠,制备特异性单克隆抗体,采用间接竞争ELISA方法测定单克隆抗体的灵敏度。选取与苯乙醇胺A结构类似的13种同类药物利用间接竞争ELISA方法进行单克隆抗体特异性的测定,计算交叉反应率。并通过胶体金、单克隆抗体-胶体金标记物、结合物释放垫、反应膜、样品吸收垫的制备以及试纸条的组装,建立了动物尿液中苯乙醇胺A胶体金快速检测方法,测定试纸条的检测限、假阳性率、假阴性率以及与ELISA方法的检测猪尿样品结果比较,验证试纸条的准确度,其中ELISA方法的标准品浓度分别为0、0.1、0.3、0.9、2.7、8.1 μg·L^-1,对猪尿样品的最低检测限为0.5 μg·L^-1,回收率为75%-105%。【结果】苯乙醇胺A半抗原制备结果显示从苯乙醇胺A的氨基端引入末端代醛基的连接臂,得到苯乙醇胺A衍生物,即苯乙醇胺A半抗原。TNBS法测定结果显示苯乙醇胺A-BSA和苯乙醇胺A-OVA成功偶联,苯乙醇胺A半抗原-BSA偶联比为11.38,苯乙醇胺A半抗原-OVA偶联比为10.66。间接ELISA检测结果显示MC-73杂交瘤细胞株的上清效价为1﹕2×10³,腹水效价为1﹕5×10⁷,较MC-33和MC-29的效价高,抗苯乙醇胺A单克隆抗体对苯乙醇胺A的IC₅₀为0.365 μg·L^-1,较MC-33和MC-29的IC₅₀低,得到MC-73单克隆抗体腹水灵敏度最高。苯乙醇胺A单克隆抗体与克仑特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇等共13种苯乙醇胺A的同类化合物的交叉反应率均小于1%,试纸条检测限为5 μg·L^-1,假阳性率为0,假阴性率为0。检测实际动物尿液样品时,试纸条与ELISA测定结果没有差异。【结论】成功研制出灵敏、特异、简便、快速的苯乙醇胺A胶体金免疫层析试纸条,可直接检测动物尿液,无需样品前处理,反应只需5 min即可得到检测结果。适合中国基层兽药检测实验室和企业大批量样品集中筛查及现场检测。     

单端孢酶烯3-O-乙酰转移酶编码基因Tri101的 原核表达及多克隆抗体制备

【目的】克隆Tri101并通过原核表达获得纯化蛋白,通过免疫SPF大白兔获得高效价、高灵敏度的多克隆抗体,为Tri101蛋白及转Tri101作物的检测提供抗体基础。【方法】以禾谷镰刀菌（Fusarium graminearium）F3210为材料,PCR法获得Tri101并连接至表达载体pET29a（+）,将重组表达载体转化大肠杆菌BL21（DE3）后利用IPTG进行诱导表达。利用纯化表达产物制备多克隆抗体。【结果】SDS-PAGE分析结果表明,Tri101在大肠杆菌BL21（DE3）中得到表达,重组蛋白大小为50 kD左右,以包涵体形式存在。利用HisTrap亲和柱纯化重组蛋白,最佳咪唑洗脱浓度为200 mmol•L-1。采用烟草蚀纹病毒蛋白酶切除重组蛋白中的His标签,酶切产物经HisTrap亲和柱再次纯化后免疫SPF大白兔,制备多克隆抗体。经ELISA法检测抗体效价为1﹕12 000,检测灵敏度为0.05×10-6 µg•mL-1。Western blotting结果证明制备的多克隆抗体对Tri101具有较好的专一性。【结论】通过Tri101的克隆及原核表达,获得了纯化的融合蛋白,通过免疫动物制备了兔源多克隆抗体,可用于Tri101蛋白及转Tri101小麦的检测。     

FSH对体外培养仔猪睾丸支持细胞cyclin D1 mRNA和 cyclin E1 mRNA表达的影响

【目的】确定FSH是否能调节支持细胞cyclin D1 mRNA和cyclin E1 mRNA的表达及可能的机制。【方法】以培养的仔猪睾丸支持细胞为试验材料,通过添加各种信号通路的抑制剂,应用实时荧光定量PCR 检测cyclin D1 mRNA和cyclin E1 mRNA的相对表达量。【结果】不同浓度的FSH（0—100 ng•mL-1）均可促进cyclin D1 mRNA和cyclin E1 mRNA的表达（P＜0.05）,在FSH浓度为50 ng•mL-1时两种基因的表达量最大（P＜0.05）;FSH（50 ng•mL-1）也以时间依赖的方式促进了cyclin D1 mRNA和cyclin E1 mRNA的表达（P＜0.05）,在作用30 min时其表达量达到高峰（P＜0.05）。不同浓度的Foskolin （0—20 μmol•L-1）均可以促进cyclin D1 mRNA和cyclin E1 mRNA的表达（P＜0.05）,但均低于FSH单独作用时两种基因的表达量;Rp-cAMP（0—40 μmol•L-1）、H-89（0—30 μmol•L-1）和Verapamil（0—100 μg•mL-1）以剂量依赖的方式抑制了FSH诱导的cyclin D1 mRNA和cyclin E1 mRNA的表达（P＜0.05）,而且Rp-cAMP和Verapamil联合作用对FSH的抑制效果高于单独的抑制效果（P＜0.05）,但低于两者之和。此外,不同浓度的U0126（0—10 μmol•L-1）降低了FSH诱导的cyclin D1 mRNA和cyclin E1 mRNA的表达（P＜0.05）,而Rp-cAMP、H-89、Verapamil和U0126单独作用时,cyclin D1 mRNA和cyclin E1 mRNA的表达与对照相比没有显著差异（P＞0.05）。【结论】FSH以剂量依赖和时间依赖的方式诱导了cyclin D1 mRNA和cyclin E1 mRNA的表达;cAMP-PKA、Ca2+和ERK1/2参与了FSH对cyclin D1 mRNA和cyclin E1 mRNA表达的调节。     

抗庆大霉素单克隆抗体的制备及其初步应用#br#

 【目的】制备抗庆大霉素(gentamicin,GM)的高亲和力特异性单克隆抗体,并鉴定其免疫学特性,为进一步研究GM快速检测试剂盒和试纸条打下基础。【方法】用EDC法将BSA和OVA分别和GM偶联作为免疫原或包被原,并经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定。用合成的BSA-GM免疫Balb/c小鼠,经过4次免疫后,用间接ELISA和阻断ELISA选择细胞融合备用鼠,选择高效价、敏感的小鼠进行抗原超强免疫;取其脾细胞应用杂交瘤技术与骨髓瘤细胞建立分泌GM 单克隆抗体(monoclonal antibody,mAb)的杂交瘤细胞株;用体内诱生腹水法制备GM mAb,对GM mAb的效价、敏感性和特异性等免疫学特性进行鉴定,;应用阻断ELISA试验原理组装GM-Kit,并对鲜奶中添加的GM标准样品进行测定。【结果】SDS-PAGE电泳鉴定表明BSA-GM人工抗原偶联成功;免疫的3只小鼠血清抗体效价均达到10-3;其中2号小鼠血清GM抑制效价较高且IC50最低,达17.28 ng•mL-1,融合后筛选出5E2-D7、1A3-A9、5E2-A12和2A6-B5共6株敏感特异的杂交瘤细胞,其细胞培养上清液效价分别为1﹕1600、1﹕800、1﹕800和1﹕800,腹水效价分别为1﹕2.05×107、1﹕5.12×106、1﹕2.56×106和1﹕2.56×106,5E2-D7株对GM的IC50为0.30 ng•mL-1,与链霉素、卡那霉素等其他氨基糖苷类抗生素无交叉反应性;检测鲜牛奶样的平均添加回收率分别为96.0%,平均变异系数均低于15%。【结论】本试验获得了高效价、敏感、特异的抗GM mAb,为GM残留检测奠定了坚实的基础。     

新孢子虫病rELISA抗体检测试剂盒的应用

[目的]研发一种成熟稳定的新孢子虫病rELISA抗体检测试剂盒.[方法]在新孢子虫病rELISA检测方法建立的基础上,组装检测新孢子虫病的rELISA抗体检测试剂盒,对试剂盒的敏感性、保存期、特异性和重复性进行评价,并与两种商品化试剂盒进行对比试验,应用自制的试剂盒检测来自新疆各地州新孢子虫疑似病例区血清,共1329份.[结果]成功组装了新孢子虫病rELISA抗体检测试剂盒,且该试剂盒敏感性高、保存期长、特异性强、重复性较好.与两种进口商品化诊断试剂盒比较,其符合率均在90;以上.在1 329样品血清中157份是阳性,其平均阳性率为11.8;.[结论]该试剂盒可以取代商品化试剂盒进行新孢子虫病诊断,为新孢子虫病的防治工作提供技术和产品支撑.