斜纹夜蛾精氨酸激酶基因的克隆及mRNA表达分析

利用RT-PCR和RACE技术获得了斜纹夜蛾精氨酸激酶基因的全长cDNA,命名为SlAK,其GenBank登录号为HQ840714。序列分析结果表明:该cDNA全长1373 bp,其中5′和3′UTR的长度分别为65和240 bp;其开放阅读框位于66～1133 bp,编码355个氨基酸。同源性分析结果显示,精氨酸激酶基因蛋白序列享有较高的同源性,该序列具有精氨酸激酶典型的酶活性部位氨基酸序列CPTNLGT、酶活性位点氨基酸和能形成离子耦合结构的氨基酸。SlAK基因在斜纹夜蛾幼虫的头部、中肠、脂肪体和体壁内均有表达,以在中肠内的表达水平最高;SlAK基因在斜纹夜蛾幼虫不同发育期的表达量不同,mRNA表达水平在3龄达到最高峰。     

斜纹夜蛾精氨酸激酶基因的克隆及mRNA表达分析

利用RT-PCR和RACE技术获得了斜纹夜蛾精氨酸激酶基因的全长cDNA,命名为SlAK,其GenBank登录号为HQ840714。序列分析结果表明:该cDNA全长1373 bp,其中5′和3′UTR的长度分别为65和240 bp;其开放阅读框位于66～1133 bp,编码355个氨基酸。同源性分析结果显示,精氨酸激酶基因蛋白序列享有较高的同源性,该序列具有精氨酸激酶典型的酶活性部位氨基酸序列CPTNLGT、酶活性位点氨基酸和能形成离子耦合结构的氨基酸。SlAK基因在斜纹夜蛾幼虫的头部、中肠、脂肪体和体壁内均有表达,以在中肠内的表达水平最高;SlAK基因在斜纹夜蛾幼虫不同发育期的表达量不同,mRNA表达水平在3龄达到最高峰。     

斜纹夜蛾普通气味结合蛋白基因SlitGOBP1的克隆及序列分析

通过PCR扩增结合RACE技术克隆获得斜纹夜蛾 Spodoptera litura 普通气味结合蛋白1(GOBP1)基因(Slit-GOBP1)全序列.序列测定和结构分析表明,SlitGOBP1阅读框全长为495 bp,编码164个氨基酸残基,预测相对分子质量和等电点分别为19 270和5.29,与已报道的10种鳞翅目昆虫GOBP1相似性为90%～41%.cDNA序列GenBank 登录号为EF159978.SlitGOBP1 序列中有6个保守的半胱氨酸位点,具有GOBP1的典型特征.SlitGOBP1编码的蛋白呈酸性,整个分子呈亲水性,在第40～60位和100位以后的氨基酸表现亲脂性,蛋白质二级结构主要由α螺旋构成.氨基酸序列系统进化树分析表明,昆虫间GOBP1分子具有明显的保守性,SlitGOBP1与夜蛾科的烟青虫 Helicoverpa assulta、烟芽夜蛾Heliothis virescens 和棉铃虫Helicoverpa armigera GOBP1属于一个分支,相似性分别为78.1%、87.6%和79.9%.这些结果为进一步了解斜纹夜蛾感受环境信息分子机制,研制昆虫行为调节剂提供了基础.     

山茶花翻译控制肿瘤蛋白CjTCTP基因的电子克隆及生物信息学分析

采用电子克隆方法从山茶花的EST数据库中获得了一条TCTP基因,并命名为CjTCTP,使用生物信息学方法对该基因编码蛋白从氨基酸组成、理化性质、跨膜结构域、疏水性/亲水性、信号肽、亚细胞定位、高级结构及功能域和进化树等方面进行了预测和分析。结果表明:山茶花CjTCTP基因全长706bp,包含507bp的完整开放阅读框,编码168个氨基酸;编码蛋白含有TCTP1及TCTP2保守域,是TCTP superfamily家族;从信号肽的预测可知,该蛋白不存在信号肽,可能为可溶性蛋白;亚细胞定位显示其可能位于细胞质中;同源性分析表明,该蛋白序列与拟南芥、橡胶树、玉米等物种TCTP蛋白序列的相似度达80%以上。     

斜纹夜蛾信息素结合蛋白cDNA片段的克隆及序列分析

利用反转录多聚酶链式反应(RT-PCR)技术从斜纹夜蛾(Spodoptera litura(Fabricius))雄蛾触角扩增得到2个分别为275 bp和281 bp的信息素结合蛋白(PBP)cDNA片段:SlitPBP1和SlitPBP2,其分别由92个氨基酸残基和94个氨基酸残基组成,并且具有5个保守的半胱氨酸位点(全序列应有6个).通过在GenBank中进行序列的同源性比较,表明这2个序列与已知几种夜蛾科昆虫的PBP氨基酸序列具较高的同源性.     

斜纹夜蛾信息素结合蛋白cDNA片段的克隆及序列分析

利用反转录多聚酶链式反应(RT-PCR)技术从斜纹夜蛾(Spodoptera litura(Fabricius))雄蛾触角扩增得到2个分别为275 bp和281 bp的信息素结合蛋白(PBP)cDNA片段:SlitPBP1和SlitPBP2,其分别由92个氨基酸残基和94个氨基酸残基组成,并且具有5个保守的半胱氨酸位点(全序列应有6个).通过在GenBank中进行序列的同源性比较,表明这2个序列与已知几种夜蛾科昆虫的PBP氨基酸序列具较高的同源性.     

斜纹夜蛾蛋白二硫键异构酶基因的发育表达分析

[目的]分析斜纹夜蛾蛋白二硫键异构酶基因(SlitPDI)的序列特征和发育表达模式,为解析SlitPDI蛋白在斜纹夜蛾生长发育过程中的生理功能提供依据.[方法]采用DNASTAR对SlitPDI基因序列特征和进化关系进行分析,并以实时荧光定量PCR研究SlitPDI基因在斜纹夜蛾2龄、4龄、6龄幼虫及蛹和新羽化雌、雄成虫共6个不同发育时期的相对表达量.[结果]SlitPDI基因编码494个氨基酸,预测该蛋白分子量约55.3 kD,理论等电点(pI)为4.52.氨基酸序列分析结果表明,SlitPDI蛋白序列具有PDI家族的典型特征:在序列的N端及C端均具有二硫键/巯基氧化还原位点-CGHC-.系统发育进化树分析结果表明,SlitPDI蛋白与意大利蜜蜂(Apis mellifera)的PDI蛋白序列一致性最低,为50.2%;与家蚕(Bombyx mori)的PDI蛋白序列一致性最高,为83.4%.斜纹夜蛾不同发育时期的实时荧光定量PCR分析结果表明,SlitPDI基因在4龄幼虫中的表达量最高,其表达量是基准含量2龄幼虫的1.27倍;在刚羽化雌、雄成虫的表达量也较高,分别为基准含量2龄幼虫的1.03和1.12倍.[结论]SlitPDI蛋白属于I类PDI家族蛋白,SlitPDI基因在斜纹夜蛾4龄幼虫和新羽化成虫中的表达量相对较高.     

斜纹夜蛾触角气味结合蛋白基因SlitGOBP2的克隆与序列分析

应用RT-PCR扩增结合RACE技术克隆获得斜纹夜蛾触角普通气味结合蛋白2(GOBP2)基因Slit-GOBP2全序列.SlitGOBP2的阅读框全长489 bp,编码162个氨基酸残基,预测分子质量和等电点分别为18.16 ku和5.43.cDNA和氨基酸序列GenBank登录号分别为EFl59979和ABM54824.SlitGOBP2氨基酸序列含6个保守的半胱氨酸位点,具有GOBP2的典型特征,与16种鳞翅目昆虫GOBP2同源性为94%～75%;编码蛋白呈酸性,整个分子呈亲水性,在第40～60位和100位以后的氨基酸表现亲脂性,蛋白质二级结构主要由a螺旋构成.氨基酸序列系统进化树分析表明,SlitGOBP2与草地夜蛾Spodoptera frugiperda和甘蓝夜蛾Marnestra brassicae的GOBP2同属于一个分支,一致性分别为94.4%和92.0%.昆虫GOBP2分子在体现保守性的同时也体现了进化性.     

斜纹夜蛾核型多角体病毒多角体基因的克隆

在以５种限制性内切酶对ＳＩＮＰＶ基因组作酶解分析的基础上，以ＡｃＮＰＶ多角体基因的部分编码序列作探针，对其进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析，发现ＸｂａⅠ酶切的２．９ｋｂ片段含有全部或部分ＳＩＮＰＶ多角体基因，并将该片段克隆至ｐｕｃ１８载体上。     

斜纹夜蛾普通气味结合蛋白ⅠcDNA的克隆及在原核细胞中的表达

 【目的】克隆、序列分析和原核表达编码斜纹夜蛾（Spodoptera litura）GOBPⅠ（SlGOBPⅠ）的cDNA。【方法】采用同源克隆结合RACE的方法克隆SlGOBPⅠ基因的cDNA序列,并在 pET-32a/BL21（DE3）系统中进行原核表达。【结果】从斜纹夜蛾触角中克隆了GOBPⅠ的cDNA序列（GenBank登录号为EU086372）,序列分析表明,SlGOBPⅠ开放阅读框序列为495 bp,编码164个氨基酸,分子量为19.3 kD,等电点为5.54。SlGOBPⅠ具有昆虫气味结合蛋白的典型特征,即氨基酸序列中具有 6个半胱氨酸残基,呈酸性。SlGOBPⅠ氨基酸序列与鳞翅目昆虫的气味结合蛋白氨基酸序列具有较高的相似性,表明SlGOBPⅠ属于GOBP家族。将SlGOBPⅠ编码序列,克隆到表达载体pET-32 a上,构建原核表达载体pET-SlGOBPⅠ,在表达宿主菌BL21（DE3）中,经IPTG诱导成功表达了相对分子质量为32.0 kD的可溶性融合蛋白,利用Ni2+-NTA亲和柱一步纯化了SlGOBPⅠ融合蛋白,以此融合蛋白免疫新西兰大白兔制备了SlGOBPⅠ的抗血清,ELISA滴度为1﹕5 000,Western印迹检测结果显示,SlGOBPⅠ抗血清与表达的融合蛋白质呈阳性反应,表明所表达的融合蛋白保持原有的免疫原性。【结论】克隆、分析和表达了编码斜纹夜蛾气味结合蛋白GOBPⅠcDNA 序列,为今后深入研究斜纹夜蛾GOBPⅠ基因的结构和功能奠定了基础。     

家蚕TCTP基因的克隆、分析及其表达

 【目的】在家蚕基因表达谱研究中鉴定了近4万个特异的SAGE标签，为了研究这些标签所对应基因的功能，选择了其中一个SAGE标签，探索这个SAGE标签对应的基因序列，表达特征以及相关的功能。【方法】在SAGE结合GLGI结果的基础上，利用5’RACE获得基因的全长，根据不同物种间该基因的同源性来构建系统发生树，通过PCR检测该基因在家蚕不同时期、不同组织中的表达特征，并在原核表达系统中表达该基因。【结果】从cDNA中获得了家蚕TCTP基因的全长序列，构建了不同物种间TCTP的系统发生树，PCR结果表明TCTP基因在家蚕的各个时期、各个组织中都稳定的表达，并且成功的在原核表达系统中表达了该基因。【结论】从cDNA中获得了TCTP基因的全长序列，并且成功在原核系统中表达，证明了通过笔者的实验方法能够获得新的基因；系统发生树显示亲缘性越近的物种TCTP间的同源性越高；家蚕TCTP基因在家蚕生命的各个时期、各个组织都有重要的生物学功能；这些工作为进一步研究其具体功能奠定了基础。     

斜纹夜蛾的抗药性及其治理策略

分析了斜纹夜蛾的抗药性特点、现状及其抗药性机理,提出了斜纹夜蛾的抗药性治理策略。     

斜纹夜蛾抗溴氰菊酯品系的相对适合度和抗性遗传方式研究

通过构建种群生命表,观察比较了斜纹夜蛾Spodoptera litura(Fab.)对溴氰菊酯抗性品系(R)和敏感性品系(S)的一系列生长发育和繁殖特征,以种群数量趋势指数来确定各个品系的生物适合度;并采用剂量对数-死亡机率值回归线(LD-P线)分析法,研究了斜纹夜蛾对溴氰菊酯的抗性遗传规律。结果表明,抗性品系(R)在产卵量、孵化率、幼虫历期和蛹重等方面与敏感品系(S)相比,表现出一定程度的生长发育和繁殖上的不利性,抗性品系的相对适合度是敏感品系的0.58。斜纹夜蛾对溴氰菊酯的抗性为常染色体多基因遗传;正、反交后代的显性度分别为0.47和0.45,抗性遗传为不完全显性。     

南昌地区斜纹夜蛾种群的抗性水平及与两种解毒酶的关系

采用生测与生物化学的方法测定了南昌地区斜纹夜蛾种群对多类杀虫剂的抗性水平及其体内两种解毒酶(细胞色素P450单加氧酶与酯酶)的活性。结果表明,江西南昌地区的斜纹夜蛾田间种群对拟除虫菊酯类杀虫剂产生了高水平的抗性,对有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂产生了中等水平的抗性,而对氟虫腈、阿维菌素和氟铃脲等药剂尚未产生明显抗性。与敏感品系相比,南昌地区斜纹夜蛾种群的细胞色素P450单加氧酶和酯酶活性都有明显的提高。     

虫酰肼对斜纹夜蛾幼虫多巴脱羧酶基因表达的影响

【目的】克隆斜纹夜蛾（Spodoptera litura）多巴脱羧酶（dopa decarboxylase,DDC）基因cDNA全长,研究虫酰肼对表皮形成过程中多巴脱羧酶基因表达的影响。【方法】通过RT-PCR和RACE技术克隆得到斜纹夜蛾多巴脱羧酶基因的cDNA全长;通过生物信息学工具对斜纹夜蛾多巴脱羧酶基因的DNA序列及其编码的蛋白质序列进行分析;采用饲料浸毒法测定虫酰肼对斜纹夜蛾不同龄期幼虫的毒力;利用荧光实时定量PCR检测用亚致死剂量虫酰肼处理的斜纹夜蛾幼虫DDC基因的表达水平。【结果】克隆了斜纹夜蛾多巴脱羧酶基因的cDNA全长,开放阅读框为1 263 bp,编码420个氨基酸,5′端非编码区长105 bp,3′端非编码区长79 bp。克隆得到的cDNA全长提交至GenBank,登录号为KF620492。多重序列比对及系统进化树显示斜纹夜蛾DDC基因推导的氨基酸序列与鳞翅目昆虫的DDC序列具有很高的相似性。利用SWISS-MODEL在线工具进行同源建模,成功预测斜纹夜蛾DDC三维结构,其与果蝇属（Drosophila）的多巴脱羧酶空间结构具有很高的相似性,功能结构域具有良好的保守性。测定虫酰肼对斜纹夜蛾3、4、5和6龄幼虫的毒力,其LC50分别为33.32、40.28、71.20和71.97 mg•L-1。DDC转录表达结果显示,用虫酰肼分别处理12-48 h,4个亚致死剂量（7.50、16.24、28.34和45.63 mg•L-1）诱导的DDC表达水平均显著高于对照,随着处理时间的延长激活作用呈现出先上升后下降的趋势,其中16.24 mg•L-1亚致死剂量在24、36和48 h诱导表达水平最高,各处理36 h表达水平最高。处理60 h,4个亚致死剂量的表达水平均显著低于对照。这一结果说明虫酰肼进入虫体后先启动基因表达,而后抑制表达,影响昆虫正常蜕皮。【结论】克隆得到斜纹夜蛾多巴脱羧酶基因cDNA全长,虫酰肼干扰昆虫幼虫蜕皮与其影响表皮形成过程中多巴脱羧酶基因的表达有关。     

2个新的鳞翅目OR83b类化感蛋白基因的克隆和序列分析

【目的】分离和克隆昆虫触角中一类非常保守的嗅觉受体蛋白基因全序列。【方法】采用简并引物反转录多聚酶链式反应(RT-PCR)和cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆基因,用生物信息学方法对获得的cDNA全序列及推导的氨基酸序列进行分析。【结果】从甜菜夜蛾(Spodoptera exigua Hübner)和斜纹夜蛾[Spodoptera litura(Fabricius)]雄蛾触角中扩增得到2个分别为1906bp和2483bp的OR83类化感蛋白基因的cDNA,开放阅读框(ORF)编码473个氨基酸,命名为SexiOR2和SlitOR2。通过在GenBank中进行序列的同源性比较,发现这2个鳞翅目化感蛋白新序列与已知蛾类昆虫的OR83b类化感蛋白氨基酸序列具较高的同源性。【结论】明确了所获得的2个鳞翅目蛋白新序列属于OR83b类化感蛋白。     

水稻干尖线虫翻译控制肿瘤蛋白基因的克隆及表达分析

根据转录组测序结果,结合RT–PCR及RACE技术,从水稻干尖线虫中克隆出翻译控制肿瘤蛋白(The translationally controlled tumor protein,TCTP)基因Ab–TCTP。该基因序列全长810 bp,开放阅读框长度为546 bp,编码181个氨基酸,预测蛋白相对分子质量为20 930,等电点为4.68;Ab–TCTP蛋白属于稳定性蛋白,没有信号肽和跨膜区域,亚细胞定位于细胞核中;该蛋白功能区域的氨基酸序列较为保守,含有TCTP保守结构域,属于TCTP超家族(TCTP superfamily)。多序列比对分析结果表明,Ab–TCTP蛋白与秀丽隐杆线虫TCTP蛋白(XP_003112086.1)的覆盖度为100%,相似度为78%。系统进化树分析结果表明,该蛋白与秀丽隐杆线虫TCTP蛋白(XP_003112086.1)在同一分支上,亲缘关系较近。原位杂交试验结果显示,杂交处理后的线虫在其食道腺附近颜色加深,TCTP基因主要在水稻干尖线虫的食道腺附近表达。利用鱼藤酮对水稻干尖线虫进行药剂处理试验,24 h时LC50值为2.20μg/m L。实时荧光定量PCR结果显示,鱼藤酮处理12 h和24 h后,TCTP基因的表达均上调,且处理24 h时的表达量大于处理12 h时的表达量。推测该基因参与了水稻干尖线虫的应激反应。     

甜菜夜蛾UAP的克隆、时空表达及RNAi研究

【目的】在昆虫中,几丁质的合成对于其生长发育至关重要,虽然几丁质合成通路在真菌中的研究比较深入,但是在昆虫中,目前大多数的研究都集中在海藻糖酶和几丁质合成酶方面,而对于通路上其他基因的研究却非常少。论文旨在阐明昆虫几丁质合成通路中的UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶（UAP）对甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）几丁质合成酶基因和害虫存活的影响。【方法】以甜菜夜蛾5龄第1天幼虫的cDNA为模板,通过简并引物扩增出甜菜夜蛾UAP基因（SeUAP）的中间片段,然后利用特异性引物和RACE技术扩增出3′和5′ race序列,拼接得到cDNA全长。随后提取甜菜夜蛾各组织和各龄期的总RNA,并通过RT-PCR方法分析SeUAP在各个组织和龄期的表达情况。最后通过向甜菜夜蛾5龄第1天的幼虫注射dsUAP观察其生长状况,检测RNAi的效率以及对几丁质合成通路下游基因的影响。【结果】获得全长为2 098 bp的SeUAP cDNA,编码一个491个氨基酸残基的蛋白,与双翅目昆虫致倦库蚊、埃及伊蚊、黑腹果蝇和冈比亚按蚊的UAP亲缘关系较近。该基因在表皮和卵巢中大量表达,在气管和中肠中的表达次之,在马氏管中表达微弱,在脂肪体中则基本检测不到其转录本的存在。该基因在甜菜夜蛾生长发育的各个阶段均有表达,在卵的整个阶段、L22（幼虫2龄第2天）、L31、L42、L51、P0、P5、P7以及A3这些天中的表达量较高,其余天数表达量较低,其表达的高峰主要出现在几丁质需求量较高的时期。RNAi结果表明,通过向甜菜夜蛾5龄第1天的幼虫注射5 µg dsRNA,导致部分甜菜夜蛾出现蛹期畸形及死亡,并出现两种畸形现象：（1）虫体腹部蛹壳已基本形成并已硬化,但头部蛹壳形成有障碍,化蛹时无法突破旧表皮;（2）虫体头部蛹壳形成正常,也能正常突破旧表皮,但蜕皮过程仅到此为止,无法正常进行下去。定量PCR结果显示SeUAP的沉默对几丁质合成酶A基因（SeCHSA）下调不明显,而对几丁质合成酶B（SeCHSB）的表达有明显下调作用。【结论】UAP可以影响几丁质合成通路的下游基因并对甜菜夜蛾幼虫-蛹的生长发育起一定作用。     

短枝型苹果MdRGL基因的克隆及原核表达分析

【目的】克隆短枝型苹果（Malus domestica Borkh.）的MdRGL基因,并对其进行生物信息学分析,构建该基因的原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达融合蛋白,为明确短枝型苹果MdRGL基因与短枝芽变特性之间的关系奠定基础。【方法】采用同源克隆法,以短枝型苹果叶片总RNA为模板,通过RT-PCR获得短枝型苹果MdRGL的cDNA片段,T/A克隆后进行序列测定。将克隆到的短枝型苹果MdRGL克隆到表达载体pGEX-4T-1上,构建融合表达载体pGEX-4T-MdRGL,转化到大肠杆菌BL21（DE3）并诱导表达。【结果】从短枝型苹果中克隆到5条MdRGL基因：MdRGL1a/b、MdRGL2a/b和MdRGL3b。序列分析表明,除MdRGL3b外,另外4条序列都具有DELLA和VHYNP结构域。利用所构建的原核表达载体,经IPTG诱导和SDS-PAGE电泳检测结果表明,表达蛋白与预期蛋白大小一致。【结论】短枝型苹果中DELLA蛋白的克隆和原核表达的成功,为进一步纯化和鉴定目的蛋白及研究其功能奠定了试验基础。