Pen a1抗原表位187-202关键氨基酸的筛选和鉴定

【目的】Pen a1是虾中主要的过敏原蛋白,其抗原表位与致敏作用有关。对Pen a1的一个抗原表位187—202中氨基酸的出现频率及保守性进行分析后合成突变肽,并检测该突变肽与表位抗体的结合能力,筛选关键氨基酸,为研究虾致敏机理及脱敏方法提供理论依据。【方法】利用MEGA5软件对Pen a1蛋白5个表位及其氨基酸的组成与出现频率进行分析,选出这些表位中出现频率大的氨基酸;对过敏原数据库中所有致敏食物原肌球蛋白的氨基酸序列的保守性进行分析,筛选出保守性高的氨基酸。两种方法筛选出的共有氨基酸为潜在的关键氨基酸。用丙氨酸分别替代这些潜在的氨基酸形成突变肽。利用固相合成法分别合成原表位肽及突变肽。并将原表位肽作为免疫原免疫新西兰大白兔,获得表位多克隆抗体。利用间接ELISA方法及竞争性Dot-blot方法检测突变的表位肽与表位抗体IgE结合能力,筛选出结合能力明显下降的突变肽,其中替换的氨基酸即为该表位的关键氨基酸。【结果】谷氨酸（E）、亮氨酸（L）、精氨酸（R）、谷氨酰胺（Q）、缬氨酸（V）、丝氨酸（S）、天冬氨酸（D）在表位中出现频率较大,并高于在Pen a1整体蛋白中出现的概率,为活性氨基酸。将序列在187—202的表位中氨基酸组成及出现频率进行统计,推测E、V、L可能为该表位的关键氨基酸。将SDAP数据库中致敏食物原肌球蛋白序列与Pen a1氨基酸序列用DNAMAN软件进行多序列比对,K、L、E、V、G在所有比对的序列中都存在,表明这5个氨基酸为保守氨基酸。选择共有的E、V、L为可能的关键氨基酸,用丙氨酸替代表位中E、V、L分别合成1、2和3号突变肽。用竞争性Dot-blot检测突变肽结合抗体能力,以提取纯化的虾致敏蛋白为包被原,用突变肽抑制虾蛋白结合抗体,发现原表位肽抑制作用明显,1号突变肽的抑制作用与原表位肽相似,2、3号肽的抑制作用明显低于原表位肽。谷氨酸突变的1号突变肽对表位活性并没有较大影响,说明谷氨酸不是该表位的关键氨基酸;而2、3号突变肽与抗体的结合能力明显降低,即亮氨酸和缬氨酸是该表位的关键氨基酸。同时,利用间接ELISA方法,将原表位肽和突变肽与兔血清反应,比较OD450值。结果显示,1号突变肽致敏性降低,OD450值约为对照的1/2.1,2号突变肽OD450值降低为对照的1/2.6,3号突变肽OD450值降低为对照的1/3.2。说明突变表位与表位抗体结合能力均有不同程度的降低。结合竞争Dot-blot试验结果,亮氨酸和缬氨酸为该抗原表位的关键氨基酸。【结论】建立了一种关键氨基酸的筛选和鉴定的方法。亮氨酸和缬氨酸被丙氨酸取代后,其与表位对应抗体的结合能力发生明显下降,是Pen a1中表位187—202的关键氨基酸。这种筛选关键氨基酸的方法可以用于其它抗原表位的关键氨基酸的确定及氨基酸对表位致敏性的影响,深入研究过敏原脱敏机理;同时也可用于基因工程或氨基酸修饰中降低过敏原致敏性。     

睾酮多克隆抗体的制备及免疫学检测方法的建立

采用优化的碳化二亚胺法制备睾酮(TES)人工抗原,免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,建立间接竞争ELISA标准曲线.标准曲线在PBS中的线性检测范围为0.096～92.200 ng/mL,相关系数R2=-0.972 2,半数抑制浓度(IC50)为2.800 ng/mL,最低检测限(LOD)为0.035 ng/mL;抗体与去甲睾酮的交叉反应率为22.3％,与其他检测化合物的交叉反应很小或忽略不计.羊尿20倍稀释后进行添加回收试验,其添加值与检测值的相关系数为0.985 2.因此,该免疫学方法可用于动物尿液中睾酮残留水平的定量分析.     

定向偶联制备三肽囊素人工抗原及其多克隆抗体的研制

为研制三肽囊素(Bursin,KHG-NH2,BS)抗体,采用EDC法将三肽囊素分子赖氨酰(K)上的氨基与载体蛋白(BSA、OVA)定向偶联,分别制备免疫抗原(BSA-KHG-NH2)和检测抗原(OVA-KHG-NH2)。以BSA-KHG-NH2免疫5只BALB/c小鼠,经4次免疫后,均产生了较高的抗体水平,其中5号小鼠血清抗体效价达1∶125 000。免疫小鼠血清多克隆抗体与检测抗原的结合不仅能被三肽囊素阻断,而且能被GKHG-NH2四肽特异性阻断,但不能被KHGK四肽阻断,表明本试验制备的三肽囊素人工抗原是由载体蛋白的羧基与三肽囊素分子赖氨酰(K)上的氨基定向偶联而成。利用小鼠多克隆抗体建立了三肽囊素间接竞争ELISA检测方法,线性范围为15～1 000 ng/mL,IC50为160 ng/mL。     

鼠源莱克多巴胺多克隆抗体的制备

本研究根据莱克多巴胺(RAC)的结构特性,采用碳化二亚胺-N-羟基琥珀酰亚胺(EDC-NHS)法将RAC与牛血清白蛋白(BSA)偶联,经紫外光谱扫描鉴定,成功合成了免疫抗原(RAC-BSA),用合成的免疫抗原免疫小鼠获得了高效价的鼠源多克隆抗体,效价均达1:32 000以上。该研究方法和结果为动物源食品中RAC残留的检测奠定了基础。     

磺胺二甲基嘧啶人工抗原合成及多克隆抗体制备

磺胺二甲基嘧啶(SM2)为只具有反应原性而无免疫原性的半抗原。本试验将SM2重氮化后分别连接人血清白蛋白(HSA)、卵清蛋白(OVA),合成人工抗原,经紫外光谱扫描验证偶联结果,计算结合比分别为4∶1、3∶1。用偶联物SM2-HSA免疫新西兰白兔,以SM2-OVA为包被原,4次免疫后ELISA方法测定抗血清效价为1∶12 800。表明抗原合成成功,这为小分子药物残留的免疫学检测奠定了技术基础。     

恩诺沙星人工抗原及多克隆抗体的制备

[目的]制备恩诺沙星人工抗原及多克隆抗体。[方法]采用活性酯法合成恩诺沙星的人工抗原,并通过紫外光谱扫描和SDS-PAGE电泳对其进行鉴定。利用免疫原(ENR-BSA)免疫新西兰大白兔,制备抗恩诺沙星的高亲和力和高特异性的多克隆抗体。[结果]恩诺沙星成功地偶联到载体蛋白上。通过动物免疫,获得了高效价的抗血清,最高效价达到1∶100 000,说明人工抗原成功地诱导机体产生免疫应答。[结论]恩诺沙星的人工抗原合成路线简单易行,可为进一步建立恩诺沙星的免疫检测方法奠定了基础。     

四环素全抗原的合成及多克隆抗体的制备

利用Mannich反应合成四环素(Tc)与BSA(牛血清白蛋白)的完全抗原,由紫外光谱确定是否偶联成功;同理,制备四环素OVA抗原作为包被抗原,以制备的完全抗原TC-BSA免疫清洁级新西兰兔制备多克隆抗体,运用间接ELISA法测定血清抗体效价。试验结果表明,紫外光谱确定偶联成功,血清抗体效价为105,间接竞争法测定抗体50%抑制率(IC50)检测限为200ng/mL,最低检测限量可达到20ng/mL,特异性好。     

磺胺母核抗原合成及多克隆抗体的制备

制备磺胺类药物母核结构的半抗原(H),通过免疫家兔得到多克隆抗体,为制备针对多种磺胺类药物的单抗和磺胺药检测免疫胶体金试纸条研制奠定基础。以对乙酰氨基苯磺酰氯(ASC)和对氨基苯甲酸甲酯(PA-BA)合成磺胺母核的半抗原(H);以牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)为载体,采用混合酸酐法,合成了免疫原H-BSA和包被原H-OVA通过紫外光谱定性证明偶联物偶联成功与否,以H-BSA免疫家兔,制备多克隆抗体,ELISA法对其特异性及效价进行检测。成功合成了磺胺母核人工抗原即免疫原H-BSA和包被原H-OVA,二者的蛋白浓度分别为8.46 mg/mL和10.53 mg/mL,结合比分别为13∶1和9∶1;制备的多克隆抗体特异性良好,血清效价为1∶256 000。     

甲拌磷人工抗原的合成及多克隆抗体制备

以五硫化二磷与无水乙醇为原料,首先制得硫化物中间体,再添加甲醛和2-巯基乙醇进行反应,得到甲拌磷半抗原.在DMAP作为催化剂的条件下,甲拌磷半抗原与丁二酸酐反应,得到甲拌磷半抗原的衍生物.通过碳二亚胺法将甲拌磷半抗原衍生物分别与牛血清白蛋白(BSA)和鸡卵清白蛋白(OVA)共价偶联,得到免疫抗原和包被抗原.用免疫抗原免疫兔子获得了高效价的多克隆抗体,抗血清效价达到了1∶50 000.通过试验确立甲拌磷标准曲线,检测限为6.383μg/L,检测线性范围为6.383～10 000μg/L.     

克伦特罗多克隆抗体的制备与鉴定

以重氮法合成克伦特罗（CL）免疫抗原,以戊二醛法合成包被抗原。免疫新西兰兔制备克伦特罗抗体,建立了克伦特罗酶联免疫吸附分析法（ELISA）,标准曲线具有良好的线性关系,该抗体与沙丁胺醇、特布他林的交叉反应率分别为83.44%和80.23%。表明该抗体可以用于对β-兴奋剂类药物进行多残留快速检测。     

Prokaryotic Expression, Ascitic Polyclonal Antibody Preparation and Identification of Cashmere Goat Izumo1

Izumol is a novel member of the immunoglobulin superfamily locating on sperm, and is indispensable for sperm-egg fusion. According to its immunoglobulin-like domain in the extracellular region, Izumol was fractionated into 6 fragments (F0-F5) which were ligated with pGEX-4Tl to construct the prokaryotic expression vectors pGEX-Fn. The recombinant plasmids were transformed into Escherichia coli BL21 (DE3) and the GST-Fn fusion proteins were expressed successfully by induction with IPTG. GST-FO, a recombinant fusion protein of GST with the full length of extracellular region of mature cashmere goat Izumol, was purified by polyacrylamide gel slicing method and was used as an antigen to immunize the Kunming mouse to generate anti-GST-Izumo1 ascetic polyclonal antibody with intraperitoneal injection of SI80 cells. Subsequently, the anti-GST-Izumol polyclonal antibody was purified with miscellaneous antigen by glutaraldehyde cross-linking method. Western blotting analysis showed that the purified ascetic polyclonal antibody had high affinity to all 6 GST-Izumo1 fragment fusion proteins. Immunohistochemical analysis with this antibody displayed that the cashmere goat Izumol proteins were at the equatorial segment of sperm head surface. These results indicate that this polyclonal antibody has high specificity and lays the foundations for further study on the expression pattern of Izumol in cashmere goat testis and binding abilities of each extra-membrane fragment of Izumol to the egg surface.     

模拟胃液对Pena 1及其抗原表位免疫原性的影响

【目的】Pen a 1是虾中的主要过敏原,已知其5个抗原表位在过敏反应中起着决定性的作用。用全蛋白抗体和表位特异性抗体,检测Pen a 1经体外模拟胃液（simulated gastric fluid,SGF）消化后其抗原表位免疫原性的变化情况,为研究人体消化对Pen a 1的影响机理及脱敏食品的制备提供理论依据。【方法】以刀额新对虾(metapenaeus ensis）为原材料,提取纯化虾过敏原Pen a 1,采用Fmoc化学法合成Pen a 1抗原表位的5个多肽片段(No.1-No.5),分别与载体蛋白KLH和牛血清蛋白BSA偶联制备人工免疫原和包被原。用Pen a 1和制备的多肽免疫原免疫新西兰纯种白兔获得全白蛋抗体和特异性表位抗体。参照美国药典模拟人体胃液的条件消化处理Pen a 1,利用SDS-PAGE和Tricine-SDS-PAGE观察消化后Pen a 1分子量变化;通过免疫印迹(Western-blot)定性观察Pen a 1消化后生成的新蛋白片段与各抗体的结合情况;再经竞争抑制酶联免疫吸附试验（ci-ELISA）定量检测消化后的Pen a 1和表位多肽与各抗体结合能力,从而得出Pen a 1经SGF消化后各抗原表位免疫原性的变化程度。【结果】SDS-PAGE结果显示Pen a 1随SGF消化时间的延长逐渐被降解,在22 kD处生成一些较稳定的新蛋白片段,Tricine-SDS-PAGE结果表明在1.7-18 kD之间无新蛋白片段生成。Western-blot表明消化后分解生成的小分子蛋白与六种抗体发生不同程度结合,其中全蛋白抗体和No.4抗体几乎与生成的所有小分子蛋白结合,在22 kD左右处生成的稳定新蛋白片段均与No.3、4、5抗体有较强的结合,而与No.1、2抗体结合较弱甚至无结合,表明该蛋白携带No.3、4、5表位,而基本无No.1、2表位。ci-ELISA结果显示,Pen a 1经SGF消化后对全蛋白抗体和5个表位抗体的抑制率均显著下降,说明经过消化后Pena1及其抗原表位的免疫原性均明显降低,各抗原表位消化稳定性排序为No.4＞No.2>No.1>No.3＞No.5,其中No. 2、1、3之间无显著性差异;ci-ELISA检测表位多肽经消化后其免疫原性也显著下降,消化稳定性排序为No.1> No.2 >No.3＞No.4＞No.5,其中No.2、3、4之间无显著性差异。结合免疫印迹结果可知No.4抗原表位消化稳定性最高,但其表位多肽消化稳定性没有显著高于其它所有表位多肽,说明在消化过程中Pen a 1结构对该表位起到一定的保护作用,使其保持较高的消化稳定性;No.1、2、3次之,3个表位间无显著性差异;No.5消化稳定性最差,表明Pen a 1空间结构对其无明显保护作用。【结论】建立了一种用表位抗体检测过敏原经模拟消化后抗原表位消化稳定性的方法。Pen a 1经SGF消化后,免疫原性降低,分解生成部分较稳定的蛋白片段,但仍具有致敏性;5个抗原表位中No.4消化稳定最高,No.5最差。     

Preparation, Characterization, and Application of Antiharpin xoo Antibody

Polyclonal antiharpinxoo rabbit antibody has been prepared successfully using purified harpinxoo protein as an immunogen. The ELISA titer of the antiserum against harpinxoo was about 1：2 000. Western blot analysis showed that the antiserum could bind to the expression harpinxoo protein in particular, hrfl, encoding harpinxoo, is an expression in transgenic rice, detected by antiharpinxoo rabbit antibody. The rabbit antibody against harpinxoo can be used to study further about the biological function, harpinxoo localization, and hrfl gene expression in other plants.     

Prokaryotic Expression, Ascitic Polyclonal Antibody Preparation and Identification of Cashmere Goat Izumol

Izumol is a novel member of the immunoglobulin superfamily locating on sperm, and is indispensable for sperm-egg fusion. According to its immunoglobulin-like domain in the extracellular region, Izumol was fractionated into 6 fragments （F0-F5） which were ligated with pGEX-4T1 to construct the prokaryotic expression vectors pGEX-Fn. The recombinant plasmids were transformed into Escherichia coli BL21 （DE3） and the GST-Fn fusion proteins were expressed successfully by induction with IPTG. GST-F0, a recombinant fusion protein of GST with the full length of extracellular region of mature cashmere goat Izumol, was purified by polyacrylamide gel slicing method and was used as an antigen to immunize the Kunming mouse to generate anti-GST-Izumol ascetic polyclonal antibody with intraperitoneal injection of S 180 cells. Subsequently, the anti-GST-Izumol polyclonal antibody was purified with miscellaneous antigen by glutaraldehyde cross-linking method. Western blotting analysis showed that the purified ascetic polyclonal antibody had high affinity to all 6 GST-Izumol fragment fusion proteins. Immunohistochemical analysis with this antibody displayed that the cashmere goat Izumol proteins were at the equatorial segment of sperm head surface. These results indicate that this polyclonal antibody has high specificity and lays the foundations for further study on the expression pattern of Izumol in cashmere goat testis and binding abilities of each extra-membrane fragment of Izumol to the egg surface.     

一种新的抗多环芳烃多克隆抗体的制备（英文）

为实现环境中多环芳烃(PAHs)污染物的快速检测,制备了抗多环芳烃多克隆抗体,用于多环芳烃免疫学检测试剂盒的研制。采用活性酯法将半抗原芘丁酸(1-PBA)分别于牛血清白蛋白(BSA)和卵清白蛋白(OVA)进行偶联,获得PBA-BSA和PBA-OVA偶联物,以PBA-BSA偶联物免疫新西兰大白兔,获得针对多环芳烃的抗血清。以PBA-OVA偶联物为包被原,间接ELISA法检测抗血清,效价为102 400,经纯化后得到多克隆抗体。采用间接竞争ELISA法绘制了针对芘的标准曲线,得到该方法的IC50值为0.06 mg/L,检出限为0.01 mg/L。与16种多环芳烃的交叉反应实验结果表明该抗体对高环PAHs的亲和力较高。反应体系中添加低于40%的甲醇对ELISA结果无影响。该抗体的制备及特性鉴定对后续多环芳烃酶联免疫试剂盒的开发奠定了技术基础。     

链球菌表面烯醇化酶重组蛋白多克隆抗体的制备

制备M6型GAS表面烯醇化酶抗体。皮下多点注射GAS表面烯醇化酶重组蛋白(rSEN)免疫家兔,采用亲和层析纯化免疫血清,通过SDS-PAGE、ELISA、Western-Blot等方法检测抗体的特异性,并初步用制备的抗体检测了M6血清型GAS表面烯醇化酶的表达。制备的抗体蛋白纯度较高,检测的特异性较强,用制备的抗体可以检测到活体菌表面的烯醇化酶。成功制备并纯化得到了GAS表面烯醇化酶多克隆抗体。     

犬血清IgG的纯化、抗体制备及其鉴定

[目的]探讨犬血清IgG的纯化方法。[方法]采用硫酸铵盐析法结合SephadexG-200凝胶柱层析提取纯化犬血清IgG,利用SDS-PAGE电泳和免疫印迹法鉴定所得产品的纯度和免疫活性。[结果]获得的纯化犬血清IgG的SDS-PAGE图谱中存在2条蛋白条带,表明获得了高纯度的犬血清IgG;重链分子量为58kD,轻链分子量为27kD,IgG分子量为170kD。特异性检测发现犬血清IgG重链和轻链都能与鼠抗犬血清IgG抗体结合,表明纯化犬血清IgG具有免疫原性和反应原性。[结论]硫酸铵盐析法结合SephadexG-200凝胶柱层析可获得纯度高、活性好的纯化犬血清IgG,为犬血清IgG相关的免疫学试验提供了高质量的免疫材料。     

利用PRNP-/-羊制备朊蛋白多克隆抗体及其特性分析

【目的】利用朊蛋白双基因敲除（PRNP-/-）羊制备朊蛋白多克隆抗体,并对其特性进行分析。【方法】构建山羊朊蛋白（PrP）原核表达载体,转入大肠杆菌并诱导表达,纯化获得羊PrP;将获得的PrP免疫PRNP-/-山羊,制备朊蛋白特异性的多克隆抗体;并对获得的朊蛋白多克隆抗体进行ELISA及Western-blot检测。【结果】获得了大量的朊蛋白特异性抗血清,间接ELASA检测抗血清中朊蛋白多克隆抗体的效价为25600;Western-blot检测显示所制备抗体不仅可以识别鼠、牛、羊脑组织内源性朊蛋白,而且能识别鼠脑组织内朊病毒。【结论】PRNP-/-转基因山羊可用于制备大量高亲和力朊蛋白多克隆抗体,获得的抗体可用于多种动物朊蛋白及朊病毒类疾病的检测。     

泉古菌Sulfolobus islandicus PCNA1的原核表达及其多克隆抗体的制备

泉古菌Sulfolobus islandicus中PCNA有3个同源类似蛋白,本研究选取PCNA1作为研究对象,为获得可溶性表达的PCNA1蛋白,制备多克隆抗体,深入了解PCNA1基因的功能,将PCNA1基因片段克隆到组氨酸标签融合的表达载体pET30a中,利用IPTG诱导,金属螯合亲和层析进行纯化分析表明,融合蛋白大部分可溶。紫外分光光度法测定纯化蛋白的纯度可达90%以上,浓度约为2 mg/mL。免疫家兔制备多克隆抗体,ELISA检测抗血清效价可达1∶10 000以上,Western印迹检测证明抗体特异性良好。