木纳格葡萄谷胱甘肽-S-转移酶VvGST1基因克隆与序列分析

【目的】克隆木纳格葡萄果实中谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione-S-transferase, GST)基因VvGST1全长并研究其序列特征,为该基因在葡萄果实抗病作用和功能的研究奠定基础。【方法】根据已有的基因序列,设计3’和5’端RACE引物,利用RT-PCR和RACE技术克隆VvGST1基因cDNA全长。【结果】该基因序列全长719 bp,均为开放阅读框(ORF),共编码221个氨基酸。该基因编码蛋白相对分子质量为25.55 kDa;理论等电点pI值为6.32;分子式为C₁₁₇₈H₁₇₉₉N₂₉₃O₃₂₁S₁₁;不稳定指数为39.22;该蛋白质是稳定的亲水性蛋白,不含跨膜结构域,没有预测到信号肽,可能存在于细胞基质中,是典型的基质蛋白。VvGST1氨基酸序列与棉花、桃、西梅、樱桃、李子、板栗等植物聚为一类,其中与棉花属亲缘关系最近。【结论】获得了木纳格葡萄谷胱甘肽-S-转移酶VvGST1基因全长编码序列,探明了该序列的结构特征。     

烟夜蛾谷胱甘肽S-转移酶基因的克隆与时空表达分析

用RT-PCR方法,从烟夜蛾(Helicoverpa assulta (Guenée))成虫腹部克隆获得了1个谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferases,GSTs)基因的完整开放阅读框cDNA序列.该基因的开放阅读框全长636 bp,编码211个氨基酸残基,推测编码蛋白的分子量为24.2 kD,等电点为6.66.将该基因推导的氨基酸序列与其他物种的GSTs进行同源性和系统发育分析,发现该基因编码的蛋白属于昆虫特异性Epsilon家族成员,将该基因命名为HaGSTe2(GenBank登录号:GQ856239).HaGSTe2在雌、雄虫触角、喙、去除触角和喙的头、胸、腹、足和翅中均有表达,而且在卵、幼虫和蛹中也有表达.     

扶桑绵粉蚧谷胱甘肽S-转移酶基因的克隆及不同发育阶段的表达分析

【目的】扶桑绵粉蚧是我国重要的入侵生物,其繁殖能力强,能危害棉花、扶桑、向日葵、南瓜、番茄等多种我国重要的经济作物。克隆扶桑绵粉蚧谷胱甘肽S-转移酶（GSTs）基因,可为揭示扶桑绵粉蚧GSTs的生理功能提供参考。【方法】利用RT-PCR和RACE技术克隆扶桑绵粉蚧谷胱甘肽S-转移酶基因全长,并采用生物信息学方法分析其结构特征,用实时荧光定量PCR的方法研究其各个虫态的表达谱。【结果】克隆了扶桑绵粉蚧谷胱甘肽S-转移酶基因全长序列,该基因的开放阅读框包含651 bp的片段,编码217个氨基酸。DNA编码区由4个内含子和5个外显子组成,内含子的长度分别为90,123,67和70 bp;分隔的5个外显子的长度分别为18,50,96,80和500 bp。功能域分析结果显示,该蛋白在N末端和C末端均有GST的类似结构位点。多序列比对及系统进化树构建结果表明,该蛋白属Zeta家族GSTs,将其命名为PsGSTzl。PsGSTzl mRNA在扶桑绵粉蚧的不同虫态中都有表达,在1龄幼虫中的表达量最高。【结论】成功克隆的PsGSTzl基因在不同虫态中差异表达,为进一步揭示该基因在虫体的代谢作用奠定了基础。     

苹果CAX基因家族生物信息学和表达分析

[目的] CAX(Ca2+/H+exchanger antiporter)是一类重要的跨膜转运蛋白,在植物体内阳离子转运上起着非常重要的作用.本文对苹果MdCAXs基因进行了生物信息学和组织特异性表达分析,以期为该类基因的功能研究奠定基础.[方法]利用生物信息学的方法对苹果MdCAXs基因家族染色体定位、蛋白质等电点、亲疏水性、跨膜区域、亚细胞定位及保守结构域进行了预测和分析,同时还分析了MdCAXs基因与其他物种CAXs基因的进化关系.采用实时荧光定量PCR法对苹果MdCAXs基因在不同盐处理下根、茎、叶中的表达变化进行分析.[结果]苹果MdCAXs家族包含8个成员,分别属于CAXsⅠ型中的A亚型和B亚型,编码436～817个氨基酸,等电点4.97～7.12,且都为疏水性蛋白;所有MdCAXs基因编码的氨基酸都有11个及以上的跨膜区域,含有CAXs基因5个典型的功能域:N-端自抑制区域(NRR)、C-端功能区域、Ca2+功能域(CaD)、C功能域和D功能域.亚细胞定位预测MdCAXs主要是定位在质膜和内质网上.苹果MdCAXs基因具有组织特异性表达特点,不同种类盐处理根、茎、叶中表达发生不同程度的变化,反映了MdCAXs存在功能上的差异,对不同阳离子有特异性的应答反应.[结论]苹果MdCAXs是一类跨膜转运蛋白,具有植物CAXs基因典型的结构特征,根、茎、叶对不同的盐离子具有不同的表达响应.     

抗性和敏感小菜蛾谷胱甘肽-S-转移酶和谷胱甘肽的比较

研究了抗性和敏感小菜蛾谷胱甘肽 - S-转移酶 ( GSTs)在不同发育期的变化及有机磷类杀虫剂对虫体谷胱甘肽 ( GSH)质量摩尔浓度的影响 .结果表明 :抗性和敏感小菜蛾 GSTs比活力在各发育期中变化不大 ,但虫体 GSTs总活力随虫体生长发育而显著增加 ,在 4龄和蛹期达到最大值 .抗性小菜蛾 GSTs活力明显高于敏感小菜蛾 .甲胺磷和水胺硫磷对敏感小菜蛾幼虫 GSH影响不明显 ,但可导致抗性小菜蛾 GSH质量摩尔浓度的显著降低 .因此可以认为 ,GSTs活力增高和 GSH的结合作用应是小菜蛾对有机磷类杀虫剂抗性的重要机制 .     

拟环纹豹蛛谷胱甘肽S-转移酶基因的克隆及表达分析

为研究拟环纹豹蛛谷胱甘肽S-转移酶(GST)基因碱基序列及其对镉胁迫的响应,本研究在转录组测序的基础上,通过RT-PCR克隆了拟环纹豹蛛的GST基因(PpGST),用生物信息学方法对其序列特征进行分析,并采用荧光定量PCR检测了镉胁迫下PpGST基因的相对表达量。结果表明,克隆获得的PpGST(GenBank登录号为KY454857)基因编码区长654 bp,可编码1个217个氨基酸的蛋白质,该蛋白质理论分子量为24 900,等电点为5.98,具有GST蛋白家族保守的N端结构域和C端结构域,与温室拟肥腹蛛(Parasteatoda tepidariorum)GST蛋白Delta型有较高的相似性(65%)。荧光定量PCR分析结果显示,镉胁迫下PpGST基因的表达量显著增加(P0.05),暗示其在抵御镉胁迫中可能发挥了重要作用。     

藏药喜马拉雅紫茉莉谷胱甘肽-S-转移酶基因的克隆及表达分析

谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione-S-transferase,GST)是参与谷胱甘肽催化反应的关键酶,在生物解毒、应激耐受和次级代谢等多个方面发挥生物学功能.本研究以藏药喜马拉雅紫茉莉为材料,基于前期转录组数据,从cDNA中克隆出谷胱甘肽-S-转移酶(GST)基因MhGSTL3,该基因开放阅读框(ORF)全...     

谷胱甘肽转移酶与植物对除草剂的抗性

谷胱甘肽转移酶与植物对除草剂的抗性华南农业大学生物系刘伟邱银清侯任昭一、化学除草面临的问题１９４２年Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ和Ｈｉｔｃｈｃｏｃｋ发现了２，４Ｄ的杀草活性，使人类与杂草上万年的斗争有了重大的突破，并导致了农田化学除草技术的迅猛发展，使杂草及...     

苹果NADP依赖的苹果酸酶基因克隆、序列和表达分析

【目的】克隆苹果（Malus×domestica B.）中苹果酸代谢的关键酶基因MdNADP-ME,进行序列特征分析,研究MdNADP-ME在苹果中组织表达的情况。【方法】利用RT-PCR技术获得苹果MdNADP-ME1,2,3全长的cDNA序列。对该序列进行生物信息学分析,采用荧光实时定量PCR技术研究MdNADP-ME1,2,3的组织表达。【结果】测序结果显示,获得的3个NADP-苹果酸酶基因（MdNADP-ME1、MdNADP-ME2 和 MdNADP-ME3; GenBank 登录号为JX971883、JX971884和JX971885）,其ORF分别为1 512、1 782和1 926 bp,推测其分别编码503、593和641个氨基酸的多肽。氨基酸序列和结构分析显示,这3个基因均含有5个保守的氨基酸区域（motif I-V）,含有2个功能结构域：malic和NAD_bind_1_malic_enz。进化树分析结果显示,MdNADP-ME1 和MdNADP-ME2属于双子叶植物细胞质NADP-ME型,MdNADP-ME3属于双子叶植物质体NADP-ME型。荧光实时定量PCR结果表明,MdNADP-ME1-3在被检测的组织中均有表达,但表达差异明显。【结论】MdNADP-ME1-3属于植物NADP-ME家族,结构高度保守,并且在苹果的不同组织中有不同表达模式。     

柽柳谷胱甘肽转移酶基因(ThGSTZ1)转入酵母的抗逆能力分析

[目的]研究盐、重金属、低温和高温胁迫下,柽柳GST基因（命名为ThGSTZ1）的抗性作用。[方法]将ThGSTZl基因构建到酵母表达载体pYES2中,转入酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）获得重组型酵母,同时以转化空载体pYES2的重组酵母作为阴性对照;对2种重组酵母分别进行LiCl、NaCl、KCI、CdCl2、ZnCl2、MgCl2、-20和53qC胁迫处理,比较2种酵母的成活率。[结果]ThGSTZ1能有效的提高酵母的抗盐碱及极端温度的能力,表明ThGSTZ1可能参与柽柳的逆境胁迫应答过程。[结论]GST基因具有参与多种胁迫响应和调节的功能。     

苹果LysM基因家族的生物信息学及表达分析

【目的】在苹果全基因组中鉴定LysM,通过基因聚类分析、染色体定位、结构分析以及组织表达分析,为苹果LysM的功能研究和利用奠定基础。【方法】利用已公布的苹果基因组数据库GDR和FEM-IASMA,鉴定苹果LysM基因家族成员,并对其进行编号。MdLysM蛋白氨基酸序列的基本信息通过ExPASy Proteomics Server进行预测,亚细胞定位的预测利用WoLF PSORT进行。采用MEGA5软件构建了进化树。应用Plaza程序绘制基因结构,染色体定位信息取自GMDO,鉴定出的39个基因的染色体定位作图使用MapInspector完成;另外,通过实时荧光定量RT-PCR对各基因的组织表达特性进行分析,差异显著性分析通过SPSS完成。【结果】系统地鉴定了39个苹果LysM家族成员。这39个MdLysM蛋白包含241至1 119个不等的氨基酸残基,等电点分布在4.70-9.60范围内。亚细胞定位结果表明,苹果LysM蛋白在细胞核、细胞质、叶绿体、液泡、胞外基质中均有分布。根据聚类分析可将这些基因分为A、B和C 3组,且A组又可进一步被分为Ⅰ、Ⅱ 和 Ⅲ 3个亚族,说明它们的功能可能已经发生了分化。MdLysM蛋白结构域的预测结果及基因结构分析结果均与进化树聚类结果吻合。染色体定位表明,MdLysM分布在苹果17条染色体中的13条上,且此家族的基因在13条染色体上的分布为非均匀的,其中以4号染色体上分布最多,达到了9个,而1、5、7和8号染色体上则未见分布。在苹果LysM家族中鉴定出了10对和1组旁系同源基因,MdLysM基因间存在串联重复和片段重复,它们是苹果LysM家族扩张的主要动力。对39个基因在根、茎、叶、花、果5个组织器官中的实时荧光定量RT-PCR结果显示,5个器官中均能检测到MdLysM的表达,这些基因的组织表达模式具有多样性,表明它们在不同组织中可能扮演不同的角色。【结论】苹果LysM基因家族拥有39个成员,进化上可分为3组,基因结构的复杂程度与进化树聚类存在联系。39个基因分布于13条染色体上,存在重复事件。这些信息为今后苹果LysM基因家族的功能研究奠定了基础。     

苹果LIM基因家族生物信息学及表达分析

【目的】在苹果全基因组中鉴定LIM,通过分析启动子作用元件、保守结构域、基因聚类、基因结构、染色体定位以及组织表达模式,为研究和利用苹果LIM奠定基础。【方法】利用苹果基因组数据库GDR和PLAZA,获得苹果LIM家族成员并进行编号。苹果LIM蛋白氨基酸序列的基本信息通过ExPASy Proteomics Server进行预测,利用Cell-PLoc进行亚细胞定位预测,利用CD-Search Tool进行LIM结构域分析,采用MEGA 7软件构建进化树,采用GSDS绘制基因结构,并利用TBtools软件对鉴定得到的MdLIM进行染色体定位,通过实时荧光定量RT-PCR对MdLIM的组织表达进行分析,并利用SPSS 18.0软件分析差异显著性。【结果】共鉴定得到11个苹果LIM家族成员,这些MdLIM蛋白包含96—222个不等的氨基酸残基,等电点分布在6.14—9.01。亚细胞定位结果显示,MdLIM蛋白在细胞核中均有分布。启动子作用元件分析表明,11个MdLIM启动子上分布有响应激素、环境适应性和逆境诱导的元件。蛋白保守结构域分析表明,11个MdLIM蛋白中除MdLIM8具有单LIM结构域外,其余10个均具有双LIM结构域。根据聚类分析结果可将MdLIM分为4组。染色体定位结果显示,MdLIM分布在苹果17条染色体中的7条,且MdLIM在7条染色体上的分布不均匀。花、叶、果皮和茎中的实时荧光定量RT-PCR结果显示,4个组织中均能检测到MdLIM的表达,且表达量具有一定差异。【结论】苹果LIM基因家族包括11个成员,进化上可分为4组,11个基因分布于7条染色体上,在不同组织中的表达具有多样性和特异性。     

Bioinformatics and Expression Analysis of the LIM Gene Family in Apple

【Objective】 In order to lay a basis for the further functional research and application of MdLIM genes, this study were carried out to analyze the bioinformatics (e.g promoter action element, conserved domain, gene clustering, gene structure, chromosome localization) and expression of the LIM gene family in apple. 【Method】Based on the apple genome database GDR and PLAZA, the members of LIM gene were identified. The MdLIM amino acid sequence prediction, subcellular localization prediction, LIM domain analysis, and phylogenetic tree the gene structure were completed by ExPASy Proteomics Server, Cell-PLoc, CD-Search Tool, MEGA7, and GSDS, respectively. In addition, the expression pattern of MdLIM genes in different tissues and in peels with different degree of fruit russeting in samples was analyzed by real-time qRT-PCR.【Result】A total of eleven MdLIM genes were identified from apple genome. These MdLIM proteins contained 96-222 amino acid residues with isoelectric points ranging from 6.14 to 9.01. The results of subcellular localization showed that the apple LIM proteins were distributed in the nucleus. Analysis of promoter showed these 11 MdLIM genes contained cis-acting elements related to hormone responses, environmental adaptability and adversity induction. Conserved domains showed that ten MdLIM proteins had double LIM domains except MdLIM8. According to the phylogeny relationship, MdLIM genes were divided into four categories. The expression patterns of the 11 MdLIM genes in flowers, leaves, fruit peels and stems were determined by real-time RT-PCR, and the results showed that their diverse and specific expression could be detected in all of the four tissues, suggesting that they might play different roles in different tissues. 【Conclusion】Eleven MdLIM genes were identified from the whole genome of apple, and they could be divided into four groups, and distributed on 7 chromosomes with diverse and specific tissues expression patterns.     

苹果WRKY基因家族生物信息学及表达分析

【目的】鉴定苹果（Malus domesticaBorkh.）基因组上132个WRKY基因,为研究苹果WRKY转录因子在非生物和生物胁迫以及生长和发育过程中的调控作用奠定相关理论基础,也为进一步分析苹果WRKY基因提供信息。【方法】利用HMMER 3.0软件,通过WRKY保守域全蛋白序列PF03106用于鉴定苹果WRKY基因。采用WebLogo 3、DNAMAN 5.0、MapInspect、MEME和MEGA5.1等软件对其蛋白序列进行生物信息学分析。采用RT-PCR技术检测苹果WRKY基因的组织表达情况。【结果】鉴定得到132个苹果WRKY基因。分组鉴定和进化树分析结果显示,苹果WRKY蛋白分为I、II和III类型,I组共有24个成员可进一步分为I-C和I-N亚组,其锌指结构是C₂H₂类型（CX₄CX_22-23HXH）。II组含有1个WRKY区域共有79个成员,可进一步分为II-a、II-b、II-c、II-d和II-e亚组,分别有8、12、31、14和14个成员,其锌指结构为C₂H₂类型（CX_4-5CX₂₃HXH）。III组共有29个成员,其锌指结构为C₂HC类型（CX₇CX_23-24HXC）;WRKY结构域分析显示,其高度保守,绝大多数都含有WRKYGQK七肽和锌指结构;染色体定位分析显示,苹果WRKY分布于苹果17条染色体中,呈不均匀分布。染色体1和9上分布最多,为13个;其次是染色体12,分布12个;染色体2、5和14分布最少,为4个;基因结构分析表明,MdWRKY基因家族多数由2-5个外显子组成,基因结构进化高度保守;保守元件分析表明,MdWRKY基因家族包含10个保守元件：元件1-6为WRKY盒;元件7-10为未知盒。MdWRKY基因家族都包含有WRKY盒,I组中含有2个WRKY盒,II-a和II-b亚组中含有未知元件8,III组中含有未知元件7和9。半定量结果显示,12个MdWRKY均在根、茎、叶、花和果中表达,且呈现出多种相对表达模式。【结论】苹果WRKY基因家族结构高度保守,可能参与调控苹果生长和发育等过程。     

梁平柚葡萄糖基转移酶基因的克隆及原核表达

基于GenBank公布的葡萄糖基转移酶(LGT)基因的核苷酸序列,设计并合成特异性引物,以梁平柚成年树幼叶总RNA为模板,通过RT-PCR方法扩增葡萄糖基转移酶基因,将该基因片段克隆到原核表达载体pET-28a(+)上,构建了该基因的融合表达载体pET28a-CmLGT,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中.经1.0mmol/LIPTG诱导表达获得大小约为62Kd的目的融合蛋白.     

越橘谷胱甘肽巯基转移酶基因的克隆及表达

以越橘(Vaccinium L.)品种"北陆"为试材,采用反转录PCR克隆技术成功克隆越橘谷胱甘肽巯基转移酶基因c DNA全长序列,获得一个完整的编码区c DNA序列,长为690 bp,编码229个氨基酸,将其命名为VcGSTU1(Gen Bank登录号KT601064)。经与谷胱甘肽巯基转移酶家族其他成员的氨基酸序列比对和系统进化分析,初步确定VcGSTU1属于谷胱甘肽巯基转移酶Tau家族。生物信息学分析表明,该蛋白不稳定指数为28.80,属于稳定蛋白。预测该蛋白分子量为25.499 ku,等电位点为5.68。蛋白质序列同源比对发现其含有完整的GST-N-Tau和GST-C-Tau结构域。利用反转录PCR和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)2种方法分析谷胱甘肽巯基转移酶的表达模式,该基因在越橘的根、茎、叶芽、叶、花芽、绿果、粉果、蓝果、蓝果果皮、蓝果种子中均有表达,且在蓝果种子中相对表达量最高。     

牡丹ACS基因克隆及序列分析

ACC合成酶(ACS)是乙烯生物合成的关键酶。为了明确牡丹ACC合成酶基因的结构,基于报道的牡丹ACScDNA(DQ337250)序列,设计一对特异性PCR扩增引物,以洛阳红牡丹(Paeonia suffuticosa Andr.)新鲜叶片总DNA为模板,用高保真DNA聚合酶KOD-Plus成功地扩增出长度约为2 200bp的PCR产物;用pMD18-T载体对PCR产物进行了克隆,测序结果表明,牡丹ACS基因序列全长2 251bp,含4个外显子和3个内含子,剪接位点均为保守的5′供位GU与3′受位AG模式,4个外显子分别居于1-174、267-398、483-643、1 240-2 251bp;序列已提交至GenBank数据库,其登录号为FJ769773;牡丹ACS蛋白由492个氨基酸组成,与苹果、枇杷、西洋梨、天竺葵等ACS的相似性达74%～76%;生物信息学分析预测牡丹ACS蛋白的分子量为54.9kD,等电点为6.8,是一个定位于细胞质的不稳定的非分泌亲水蛋白。     

红肉苹果分裂素响应基因MdMYB308的克隆与表达分析

【目的】细胞分裂素是调控植物花青苷合成的重要激素,从新疆红肉苹果杂种一代优系‘紫红3号’中克隆得到分裂素响应基因Md MYB308,研究其在细胞分裂素调控苹果花青苷合成中的作用,为进一步完善红肉苹果育种的理论与技术体系提供参考。【方法】以红肉苹果‘紫红3号’(新疆红肉苹果与‘富士’杂交1代)的红色幼嫩叶片为外植体诱导的红色愈伤组织为试材,设计引物利用PCR克隆Md MYB308,对其进行生物信息学分析;并用不同浓度细胞分裂素处理,采用荧光定量PCR分析Md MYB308及花青苷合成相关基因的表达;通过酵母双杂交试验、荧光双分子互补试验验证Md MYB308与Mdb HLH3的互作关系。【结果】在‘紫红3号’中克隆获得Md MYB308全长,其包含768 bp完整的开放阅读框,编码255个氨基酸,预测其编码蛋白质分子量为28.37 kD,等电点为8.94;系统进化树分析表明,Md MYB308与At MYB4、Fa MYB1、At MYBL2在同一个进化枝上,氨基酸序列比对发现,Md MYB308蛋白存在EAR抑制序列;提高6-BA浓度有利于苹果愈伤组织花青苷的累积,与无细胞分裂素处理相比,1 mg·L~(-1) 6-BA处理愈伤花青苷合成结构基因Md CHS、Md DFR、Md UFGT与转录基因Md MYB10、Mdb HLH3的表达量升高,而Md MYB308表达被抑制;酵母双杂交与荧光双分子互补试验表明,Md MYB308与Mdb HLH3能相互作用。【结论】细胞分裂素(6-BA)可能通过抑制Md MYB308的表达影响Md MYB308与Mdb HLH3的结合从而促进花青苷的累积。