大豆铁蛋白cDNA的克隆及植物表达载体的构建

以大豆为材料,利用RT-PCR法扩增得到大小约750bp的片段,将这个片段连接到克隆载体pBlueskript SK＋上进行测序,结果证明,此片段就是大豆的铁蛋白基因。将此片段再正向插入到植物表达载体pBI121的CaMV35s启动子和NOS终止子之间,构建了植物表达载体pBIFe,并成功地将该载体导入根癌农杆菌EHA105。此项工作为获得表达铁蛋白的转基因植物奠定了基础。     

大豆llS球蛋白Gy5（A3B4）cDNA的克隆及植物表达载体的构建

从大豆(花生豆1号)未成熟种子中提取总RNA，逆转录形成cDNA第一条链。根据genebank中大豆llS球蛋白Gy5的cDNA序列设计引物，用PCR方法扩增Gy5的cDNA序列，克隆到pUC19质粒载休上，并测定其全序列。用限制性内切酶PstI和EcoRI酶切重组质粒，将目的片段与质粒pCAMBIA1301连接，构建成植物表述载体并转化到农杆菌中，以便于以后的研究利用。     

Patatin启动子驱动的人胰岛素原基因的植物表达载体的构建

使用马铃薯的偏爱密码子设计合成人胰岛素原基因,以植物表达载体pCAMBIA1301为基础,构建由patatin启动子调控的人胰岛素原基因植物表达载体p1301Ph,并将导入根癌农杆菌LBA4404中,经PCR鉴定证明,此基因已整合到农杆菌Ti上。表达载体的建立为日后转基因工作奠定了基础。     

大豆11S球蛋白Gy5(A3B4)cDNA的克隆及植物表达载体的构建

从大豆(花生豆1号)未成熟种子中提取总RNA,逆转录形成cDNA第一条链.根据genebank中大豆11S球蛋白Gy5的cDNA序列设计引物,用PCR方法扩增Gy5的cDNA序列,克隆到pUC19质粒载体上,并测定其全序列.用限制性内切酶PstI和EcoRI酶切重组质粒,将目的片段与质粒pCAMBIA1301连接,构建成植物表述载体并转化到农杆菌中,以便于以后的研究利用.     

大豆主要过敏原Gly m Bd 30K基因的克隆及其原核表达载体的构建

利用RT-PCR克隆大豆主要过敏原Gly m Bd 30K的全长基因,根据序列设计带有酶切位点的特异性引物,扩增大豆GlY m Bd 30K的完整开放阅读框,与pET一28a载体连接,构建原核表达载体.结果表明:克隆了大豆主要过敏原Gly m Bd 30K基因,且构建了其原核表达载体.该基因含有长度为1 140 bp的开放阅读框,编码379个氨基酸.该蛋白质的相对分子质量为42 758,等电点为5.08.序列同源性分析发现其与数据库中已知的Gly m Bd30K基因同源性很高,因此认为其是大豆的过敏原基因,在GenBank数据库中的登录号为EU883600.克隆的大豆主要过敏原Gly m Bd 30K基因及构建的原核表达载体,为大豆主要过敏原Gly m Bd 30K的重组表达和免疫活性鉴定等奠定基础.     

干旱诱导基因GmNF⁃YA7克隆及植物表达载体构建

为了鉴定大豆核因子YA(Nuclear Factor YA,NF?YA)与非生物胁迫的关系,本研究检测大豆干旱胁迫下GmNF?YA7和GmNF?YA8的表达量情况,克隆GmNF?YA7基因并构建植物表达载体,同时获得其转基因工程菌株.qRT?PCR结果显示,GmNF?YA7和GmNF?YA8均可以被干旱胁迫诱导表达,且...     

芥菜型油菜BjuA03.TTG2基因启动子克隆及表达载体构建

为进一步分析芥菜型油菜BjuA03.TTG2启动子在调控该基因表达中的作用,本研究以含有该基因的BAC单克隆质粒DNA为模板,通过普通PCR获得BjuA03.TTG2上游1 839 bp的DNA序列。利用PlantCARE在线分析软件分析BjuA03.TTG2启动子序列,含有许多与应答相关的顺式作用元件,如激素、光、低温等。根据BjuA03.TTG2启动子顺式作用元件的位置设计引物,采用5’端系列缺失分析法,利用PCR方法对BjuA03.TTG2基因上游启动子序列进行特异扩增,分别克隆了1 839、1 497、1 165、863、627、377和297 bp的启动子片段并构建到pCAMBIA1304植物表达载体中。鉴定结果说明7个BjuA03.TTG2启动子不同区段与GUS融合的植物表达载体构建成功。研究结果为进一步分析BjuA03.TTG2启动子的功能作用提供前期基础。     

灰树花gpd-GF启动子的克隆与表达载体的构建

根据已经报道有强启动子活性的香菇gpd启动子设计引物,从灰树花基因组PCR扩增获得大小分别为1018,615bp的2个片段gpd-GF1和gpd-GF2,通过DNA序列测定得知二者的大小分别为1018,615bp,经NCB1中的BLASTN比较,gpd-GF1,gpd-GF2与已报道的香菇中克隆的gLeGPD基因上游序列的同源性分别为96%,98%,通过启动子预测软件分析,结果表明,gpd-GF1和gpd-GF2含有多个顺式作用元件如TATA box,GAtA box,CAAT box等,初步证实 gpd-GF1,gpd-GF2可能有较强的启动子活性。将gpd-GF1,gpd-GF2分别与切除CaMV35S启动子的pCAMB1A1301大片段进行亚克隆,构建成表达载体pCBgpdGF1和pCBgodGF2。     

大豆酰基载体蛋白硫酯酶基因及其启动子表达方式的初步分析

利用实时定量PCR方法,检测大豆酰基载体蛋白硫酯酶(acyl-ACP thioesterase)基因在大豆各组织中的表达方式,结果显示该基因在大豆根、茎、叶、花中的表达活性低,而种子中的表达活性较高。利用PCR方法,克隆大豆acyl-ACP thioesterase基因5’端上游2 057 bp序列,命名为AP。在线启动子预测软件分析结果表明AP序列中含有多种典型的种子特异表达元件,如RY repeat、SEF1 motif、SEF3 motif、SEF4 motif、E-box、ACGT等顺式作用元件,推测大豆acyl-ACP thioesterase基因启动子具有种子特异表达活性。     

PSAG12序列克隆及PSAG12-ipt嵌合基因植物表达载体的构建

通过聚合酶链式反应技术，成功克隆了拟南芥SAG12基因5′端2130bp的非编码序列PSAG12。结构分析结果表明，该序列由55bp的5′－UTR和－1－－2075的5′端非转录序列构成，－1－－1345为拟贰芥SAG12基因启动子功能区，具有－1181－－1345增强子序列和衰老特异表达关键序列－571－－603，但无典型的TATA box、CATT box和转录起始位点帽子结构序列，成功构建了PSAG12－ipt嵌合基因植物表达载体pAGT，为通过基因转移技术人为控制植物叶片细胞分裂素含量，延迟叶片衰老打下了基础。     

番茄中一个F-box/FBA基因的表达分析及载体构建

通过生物信息学分析从番茄基因数据库中筛选出一条全长cDNA序列,命名为SlFbf（GenBank登录号:AK326236.1）。通过设计特异引物克隆该基因。SlFbf全长1 464 bp,编码381个氨基酸,N端含有F-box结构域,C端含有FBA₁结构域,在基因组序列中无内含子。半定量及定量RT-PCR分析结果表明,该基因在番茄的根、茎、叶、花蕾、花、青果、黄果及红果中均有表达,且在开花当天的雄蕊中表达最强,推测该基因在雄蕊发育中起着重要作用。同时构建了番茄SlFbf基因的正、反义植物表达载体,为深入研究该基因功能奠定了基础。     

大豆GmPM13基因的克隆及原核表达

通过对大豆(Glycine max)油体钙蛋白(caleosin)基因GmPM13的克隆及原核表达,为今后利用基因工程方法检测转GmPM13基因提供抗体。运用RT-PCR技术克隆得到大豆油体钙蛋白GmPM13基因,构建原核表达载体,命名为p ET-28a-pm13。并转化到Ecdi和Rosetta中,经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后,SDS-PAGE分析GmPM13蛋白的表达情况。大豆GmPM13基因全长c DNA序列为738 bp,包括一个720 bp的开放阅读框,编码239个氨基酸,油体钙蛋白的分子量为27.1 k Da,诱导表达产物的大小与预计蛋白大小相符。在28℃,1.5 mol·L~(-1)IPTG浓度下,诱导12 h蛋白的表达量最高,占总蛋白的39.25%。     

PRSV-CP基因小hpRNA植物表达载体的构建

将获自海南(prsv-cp hno1～4)、云南(prsv-cp yunnan)和广西(prsv-cp guanxi)的番木瓜环斑病毒株系外壳蛋白(PRSV-CP)基因序列与DQ340771、X97251(来自中国台湾的PRSV株系)以及AY162218、AY231130、DQ374153、S46722、X97251(分别来自泰国、墨两哥、巴西、美国的PRSV株系)等外壳蛋白(CP)基因序列进行比对,在CP基因高保守区设计靶向目标序列进行亚克隆,获得长度为50bp的DNA片段,并通过一步套叠PCR把50 bp 正向片段和反向片段与拟南芥内含子拼接,成功构建了小hpRNA结构的植物表达载体,为进一步培育安全性好、抗谱广的番木瓜转基因新种质奠定了基础.     

大豆脯氨酸生物合成相关基因Glyma01g24530的功能预测及表达分析

干旱胁迫下的脯氨酸积累在许多植物中都存在,人们普遍认为脯氨酸含量的提高促进了植物对干旱胁迫的抵抗能力。拟南芥中研究发现,△1-吡咯啉-5-羧酸合成酶基因P5CS1是一种限速酶用来催化脯氨酸生物合成,对脯氨酸非常重要。本研究通过生物信息学及荧光定量PCR对大豆中的P5CS1同源基因Glyma01g24530进行了初步的功能分析和表达模式验证。结果发现:Glyma01g24530具有保守的N端乙酰谷氨酸合成酶激酶结构域和N端乙酰谷氨酸合成酶激酶结构域,系统进化树显示与各植物中P5CS家族成员相似性很高,启动子顺式作用元件序列分析表明该基因存在逆境胁迫、光反应等元件。表达模式分析显示Glyma01g24530可以被干旱、盐诱导表达,并在多数组织中表达。     

番木瓜环斑病毒CP基因同源区段的克隆及植物表达载体的构建

采用RT-PCR技术对番木瓜环斑病毒CP基因的同源区段进行了克隆和鉴定分析。序列分析结果表明,获得PRSV-CP基因3′端的278bp DNA片段同源率最高。构建了目的基因包含278bp正义链、内含子(PDK内含子)及278bp反义链的RNA介导的植物表达载体p2301-CPU,并通过电激法导入农杆菌中。经PCR及酶切鉴定,证实质粒已被导入获得了农杆菌工程菌株。利用该植物表达载体对番木瓜的遗传转化工作目前正在进行中。     

大豆GmPR10基因启动子的克隆及序列分析

GmPR10基因是病程相关蛋白PR10(pathogenesis-related proteins 10)在大豆中的同源基因。为探明大豆GmPR10基因的表达调控规律,应用PCR技术从大豆抗疫霉根腐病品种绥农10号中克隆了GmPR10基因上游2 235 bp的启动子序列pGmPR10,定向替换pBI121载体的CaMV35S组成型启动子,构建植物表达载体pBI121/pGmPR10/GUS,并转化农杆菌侵染烟草叶盘。GUS染色结果表明,pGmPR10受聚乙二醇(PEG)、低温(4℃)、水杨酸(SA)、茉莉酸(JA)和脱落酸(ABA)诱导表达,因此推测GmPR10基因可能参与植物激素调节植物生长发育的过程,以及生物胁迫和非生物胁迫条件下植物对环境响应的过程。此外,利用PLACE和Plant CARE在线启动子预测工具分析pGmPR10,结果表明:pGmPR10含有启动子的一般结构TATA-box和CAAT-box,光应答元件,生长素和细胞分裂素响应元件,热激元件,低温应答元件,干旱应答元件以及ABA、SA、JA应答元件等。     

大豆对羟苯丙酮酸双加氧酶基因的克隆与表达分析

采用电子克隆与实验克隆结合的方法获得了大豆对羟苯丙酮酸双加氧酶基因的cDNA序列,GenBank登录号为EF608178.利用多种生物信息学工具分析了该cDNA序列及其编码的蛋白质序列,分析了其启动子特征和电子表达谱.结果表明:该cDNA序列含有1个编码443个氨基酸的完整的开放读码框,3'端具有2个加尾信号和polyA尾巴.启动子区除含有通用核心元件外,还含有许多与光反应有关的作用元件;不同物种之间对羟苯丙酮酸双加氧酶的氨基酸序列同源性较高;该基因在光合作用和贮藏器官中的表达量高.     

雄性不育及育性恢复基因表达载体的构建

将拟南芥花药特异表达启动子A6与核酸酶基因融合构建不育基因,与核酸酶Bamase特异抑制剂Barstar基因融合构建育性恢复基因,再分别与抗除草剂溴苯睛基因表达盒bxn串联,形成紧密连锁,分别构建植物雄性不育和育性恢复基因表达载体pwP一AN及pwp一AS,以抗澳苯睛基因作为转化和繁殖、制种过程的筛选标记。