牛布鲁氏菌间接ELISA抗体检测方法的建立

【目的】建立高通量牛布鲁氏菌间接ELISA诊断方法,为科学高效诊断牛布鲁氏菌病提供技术手段。【方法】以提纯的猪布鲁氏菌S2株脂多糖(LPS)作为包被抗原,采用棋盘滴定法确定了抗原包被浓度、包被液、抗原包被时间、封闭液、样品稀释液、血清稀释倍数、兔抗牛酶标抗体稀释液、兔抗牛酶标抗体稀释浓度、最佳TMB底物反应时间等参数,初步建立了牛布鲁氏菌间接ELSIA方法。并用上述条件初步建立的方法对176份牛布鲁氏菌病阳性血清和132份牛布鲁氏菌病阴性血清进行检测。检测结果经SPSS17.0软件分析,构建受试者工作特征曲线(ROC)及曲线下面积,确定敏感性和特异性;通过Youden指数确定阴阳性判定的临界点。使用质控阴、阳性血清评价试剂盒的批内和批间重复性。用本研究建立的ELISA试剂盒及商品化试剂盒同时对临床上1 200份牛血清样本进行比对检测,比较其符合率。【结果】通过棋盘法确定的试剂盒中各组分的最佳条件为:抗原包被浓度为10μg·m L-1,最适包被液为碳酸盐缓冲液,最佳包被时间为2—8℃、16 h,最适血清稀释度为1﹕50,最佳封闭液为含有3%明胶的PBST,最佳样品稀释液为含有0.5%蔗糖的PBST,最佳兔抗牛酶标抗体稀释液为含有5%马血清的PBST,最佳兔抗牛酶标抗体工作浓度为1﹕20 000,最佳TMB底物反应时间为15 min。按上述条件建立的间接ELISA方法检测176份牛布鲁氏菌病阳性血清和132份牛布鲁氏菌阴性血清,并统计结果后使用SPSS17.0软件分析该方法受试者工作特征曲线(ROC)线下面积为0.98。最佳判定临界点为样本OD值/阳性OD值(S/P)×100%=20%。在此临界值上时,敏感性为97.7%,特异性为95.5%。对1 200份临床样本的比对检测显示,本研究建立的间接ELISA方法与进口商品化试剂盒的总符合率为96.25%。【结论】建立了特异性和敏感性良好的牛布鲁氏菌间接ELISA抗体检测方法。     

检测牛轮状病毒抗体间接ELISA方法的建立与应用

以田间分离的轮状病毒CHLY(G6型)作为抗原,建立了犊牛轮状病毒(BRV)抗体检测与监测的间接ELISA方法.田间监测牛轮状病毒感染率为32.91%(26/79),疫苗源性抗体高峰出现在二次免疫后第40天至第60天,抗体持续期为3个月.该方法可用于粪便、血清样品的检测,具有特异性强、快速简便等优点,适合于对轮状病毒特异性抗体的动态监测和批量检测.     

家畜布鲁氏菌BP26基因的原核表达及间接ELISA检测方法的建立

利用原核表达的布鲁氏菌BP26蛋白作为标准抗原蛋白,建立布鲁氏菌病抗体检测方法。本试验从布鲁氏菌S2疫苗株通过PCR扩增获得BP26基因,构建融合表达质粒pET-28a-BP26后并转化BL21宿主菌,IPTG诱导表达,应用Western blot鉴定表达产物,并以纯化的重组蛋白作为包被抗原,通过优化反应条件,建立布鲁氏菌病抗体ELISA检测方法。结果表明,通过反应条件优化确定抗原的适宜包被浓度为5μg/mL,血清适宜稀释度为1∶20,二抗的适宜工作浓度为1∶20 000;通过敏感性试验结果表明,当血清稀释至1∶1 280时,仍检测为阳性;通过批间、批内重复性试验,变异系数均小于10%,表明本检测方法具有较高的重复性。用该方法对100份临床样本进行检测,并与试管凝集试验(SAT)进行相符性验证,符合率为94%,为布鲁氏菌病临床血清抗体检测及流行病学调查提供了技术手段。     

LH抗体间接ELISA检测方法的建立

以高纯度的促黄体素（LH）作为包被抗原,建立了检测LH抗体的间接ELISA法,该法的最适抗原包被浓度为1μg/mL,最佳酶标山羊抗小鼠抗体稀释度为1∶1500.该法只与LH阳性小鼠血清呈现阳性反应,而与LH阴性小鼠血清和小鼠促卵泡素（FSH）阳性血清呈现阴性反应.结果表明,该法具有良好的特异性和重复性,可用于LH免疫后抗体水平检测.     

大豆花叶病毒间接ELISA检测方法的建立及应用

为快速有效地检测大豆花叶病毒(Soybean Mosaic Virus,SMV),本研究利用已制备的大豆花叶病毒衣壳蛋白(Coat Protein,CP)及其单克隆抗体,通过优化ELISA条件为:检测材料抗原包被酶标板37℃1 h,检测抗体工作浓度125 ng/mL,孵育60 min,酶标抗体工作浓度100 ng/mL,孵育30 min;SMV CP蛋白最低检测限为3.23 ng/mL;该方法重复性变异系数小于3%,重复性良好;运用上述检测条件与RTPCR检测方法对田间样品进行随机检测,结果显示一致率高达94%。SMV间接ELISA检测方法的成功建立,为SMV快速检测试剂盒及试纸条的研发奠定了基础。     

检测禽霍乱抗体间接ELISA法的建立

以方阵滴定法选择出最适ＥＬＩＳＡ反应条件,用系列稀释法测定２１份血清样品的禽霍乱抗体ＥＬＩＳＡ效价（ＥＴ）,并与相应血清样品１：２００倍稀释的Ｐ／Ｎ值配对,作线性回归分析,得到回归方程ｙ＝２１９．６７３ａ－１８３．５７０（ｒ＝０．９４４）和标准曲线,从而建立起快速定量测定禽霍乱抗体的间接ＥＬＩＳＡ方法－阳阴比值ＥＬＩＳＡ效价法（Ｐ／ＮＩ－ＥＴ法）利用该法,血清样品只需作１：２００倍稀释,测定其Ｐ／     

绵羊肺炎支原体间接ELISA检测方法的建立及应用

利用绵羊肺炎支原体标准株Y98制备抗原,经超声破碎后作为包被抗原建立了间接ELISA检测方法用于检测绵羊肺炎支原体血清抗体.经方正滴定确定了抗原包被质量浓度为2.5μg.mL-1,血清样品稀释倍数为1∶64,兔抗羊IgG辣根过氧化物酶结合物最佳稀释倍数为1∶40000,抗原抗体最佳结合时间为1 h.试验结果确定的判定标准为:样品D490 nm(P)与标准阴性血清D490 nm(N)之比,即P/N≥3.0为阳性,P/N≤2.5为阴性,介于二者之间的为可疑.试验证明该方法具有良好的稳定性、重复性和特异性,并且与间接血凝试验相比较其敏感性高于后者.     

重组牛分枝杆菌CFP-10蛋白间接ELISA检测方法的建立

[目的]建立检测牛分枝杆菌的间接ELISA方法,快速区分致病性与非致病性牛分枝杆菌,为净化牛结核病提供技术支撑.[方法]以体外扩增表达并纯化的重组牛分枝杆菌CFP-10蛋白为包被抗原,建立检测牛分枝杆菌的间接ELISA,并应用方阵法优化间接ELISA的检测条件.[结果]重组CFP-10蛋白间接ELISA的最佳检测条件为：以8μg/mL重组CFP-10蛋白包为被抗原,37℃下包被1h,再以5％脱脂奶封闭1h,血清（一抗）经1∶200倍稀释后作用1h,然后以1：500倍稀释的辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG（二抗）作用1h.该间接ELISA的阴阳临界值为0.281,仅与牛分枝杆菌呈阳性反应,与牛布鲁氏杆菌、牛口蹄疫病毒无交叉反应;其敏感性能检测1：320倍稀释的血清,批内与批间的变异系数均小于5.0％.[结论]建立的重组牛分枝杆菌CFP-10蛋白间接ELISA具有特异、敏感等优点,临床上可用于致病性牛分枝杆菌的检测.     

奶牛孕酮间接竞争ELISA检测方法的建立

[目的]为孕酮检测试剂盒的研制奠定基础。[方法]采用二环己基碳化二亚胺法制备检测抗原,建立了检测奶牛孕酮含量的间接竞争ELISA方法。[结果]检测奶牛孕酮的间接竞争ELISA的最佳反应条件确定为:最佳包被浓度为100 ng/ml,碳酸盐缓冲液的包被效果较好,以4℃过夜+37℃2 h佳,最佳封闭液为2%山羊血清,酶标抗体的工作浓度为0.13μg/ml。建立的标准曲线方程为y=-1.844 4x-0.140 1(R2=0.981 7),检测范围为0~20 ng/ml,最低检测限为0.58 ng/ml。该标准曲线的批内变异系数和批间变异系数分别为2.22%和2.37%。[结论]该研究建立了定量检测奶牛孕酮的间接竞争ELISA方法。     

猪副粘病毒间接ELISA方法的建立

以临床分离的猪副粘病毒作为抗原,通过SPF鸡胚进行病毒培养和增殖,再经过差速离心纯化后作为ELISA包被抗原,建立了猪副粘病毒全病毒间接ELISA诊断方法。试验表明:此方法具有敏感性高、特异性好的优点,为快速诊断新型猪传染病——猪副粘病毒(PPMV)感染提供了便利的途径。     

牛种布鲁氏菌SP41基因的克隆及序列分析

根据GenBank上发表的牛种布鲁氏菌SP41基因序列,设计合成了一对特异性引物。从牛A19疫苗中提取全基因组DNA作为模板,PCR扩增出SP41基因,连入pEASY-T3载体,测序结果表明,扩增的片段含有1 302个核苷酸,编码433个氨基酸的成熟蛋白,与已报道的布鲁氏菌2308、A-13334、S19、9-941序列的氨基酸同源性为100%;与布鲁氏菌ATCC、CCM4915、M28、M5-90、NI的氨基酸同源性为99.8%。布鲁氏菌SP41基因的克隆,为获得重组SP41蛋白及对其结构和功能的研究奠定了基础。     

流产布鲁氏菌BCSP31基因在大肠杆菌中的可溶性高效表达

设计1对引物,突变除去布鲁氏菌BCSP31(细胞表面蛋白31)基因的N端信号肽氨基酸序列,经NotⅠ和EcoRⅠ酶切后与相同处理的表达载体pGEX-4T-1连接,转化BL21(DE3)感受态细胞。酶切及PCR扩增鉴定,获得阳性克隆,测序证明其阅读框完全正确。用IPTG诱导表达构建成功的阳性克隆,对产物进行SDS-PAGE和Western-blotting检测,发现表达产物出现预期分子量57 kD的融合蛋白,该蛋白能与牛流产布鲁氏菌阳性血清发生反应,进一步证明目的蛋白主要以可溶性形式存在,表达量约占总蛋白的40%,应用GST琼脂糖凝胶FF纯化可得到纯度较高的表达产物。     

一株中等毒力牛种布鲁氏菌的鉴定和毒力测定

【目的】对初步鉴定的牛种布鲁氏菌分离株（B. abortus 343）进行全面的生物学特性检定,为深入研究布鲁氏菌病提供参考菌株。【方法】将B. abortus 343划线培养及梯度稀释,使其形成单个菌落,观察菌落形态。挑取单个菌落进行革兰氏染色和柯氏染色,观察其染色特点;分别接种1.5×106 CFU到含硫瑾（1﹕25 000）或含碱性复红（1﹕25 000）的TSA平板上,观察其生长状态;将接种有B. abortus 343的TSA平板分别置于普通培养箱和CO2培养箱37℃培养72 h,观察其对CO2的依赖性;通过醋酸铅试纸条测定B. abortus 343代谢过程中是否释放H2S。通过平板凝集试验测定布鲁氏菌单相特异性血清（ 牛种布鲁氏菌单因子血清A、羊种布鲁氏菌单因子血清M 和 布鲁氏菌粗糙型血清R ）与B. abortus 343抗原的反应性;利用布鲁氏菌AMOS-PCR种属分型等方法对B. abortus 343进行了PCR种属特性鉴定;将B. abortus 343免疫小鼠,分别测定其抗血清与光滑型和粗糙型抗原的反应性;通过小鼠和豚鼠感染试验,全面评价该分离株的毒力;分别以1×105 CFU感染6周龄Balb/c小鼠,测定B. abortus 343在小鼠体内存活时间;以1×109 CFU感染Hartley豚鼠,2周后测定试验豚鼠每克脾脏含菌量;分别以10 000、1 000、100、25 CFU/只4种不同剂量感染豚鼠,初步测定分离株对豚鼠的最小感染量（MID）,在此基础上,进一步以40、60和90 CFU/只测定MID。【结果】分离株B. abortus 343 为光滑型牛种布鲁氏菌,菌落逆光观察微带蓝绿色乳光;革兰氏染色为阴性,柯氏染色为红色,H2S试验阳性。该菌能在含硫瑾和碱性复红的培养基上生长,不依赖于CO2。B. abortus 343抗原能与A因子血清呈明显凝集反应,免疫小鼠后能产生特异性抗体。以1×105 CFU感染6周龄Balb/c小鼠,可在小鼠体内存活29周;以1×109 CFU感染350-400 g雌性豚鼠,14 d后豚鼠每克脾脏含菌量2.4×105-1.2×106;以1×105 CFU感染豚鼠1个月后,所有试验豚鼠均能产生特异性光滑型抗体,试管凝集效价为320-1 280;B. abortus 343对豚鼠的最小感染量约为40 CFU。【结论】鉴定了一株中等毒力牛种布鲁氏菌（B. abortus 343）,为深入研究布鲁氏菌病提供了参考菌株,丰富了布鲁氏菌菌种资源。     

牛布鲁氏菌Wbkc基因原核表达及抗原性分析

克隆牛布鲁氏菌的甲酰基转移酶基因（Wbkc）,在大肠杆菌中表达/纯化,并对甲酰基转移酶的抗原性进行分析。以牛布鲁氏菌的染色体DNA为模板,扩增Wbkc基因,双酶切后克隆至pET-28a上,在大肠杆菌BL21中诱导表达,His Trap FF层析柱纯化,Western blot鉴定甲酰基转移酶的抗原性。提取的重组质粒经PCR鉴定、双酶切鉴定和测序分析确定目的基因成功插入到了克隆载体中。SDS-PAGE分析证明,表达产物为相对分子质量29 000的融合蛋白。Western blot结果表明,表达的蛋白具有特异的免疫反应原性。     

检测和鉴别流产布鲁氏菌与猪布鲁氏菌的复合PCR方法的建立

将GenBank上登录的流产布鲁氏菌（Br.abortus）和猪布鲁氏菌（Br.suis）外膜蛋白omp2基因序列进行比对,设计了流产布鲁氏菌特异性引物对A1/A2、猪布鲁氏菌特异性引物对S1／S2,分别用引物A1/A2和S1／S2进行PCR,进而将引物A1、A2、S1、S2置于同一体系内进行复合PCR,建立了一种能区分流产布鲁氏菌和猪布鲁氏菌的复合PCR鉴别诊断方法。应用该方法从流产布鲁氏菌和猪布鲁氏菌染色体基因组中扩增出了大小分别为424bp和535bp的1条特异性片段,从两种染色体基因组混合物中扩增出了大小为424bp和535bp的2条特异性片段。但对大肠杆菌、结核杆菌、坏死杆菌、棒状杆菌染色体基因组进行PCR扩增时均为阴性。该方法可以检测出10个菌／50阻L体系。本研究建立的复合PCR可以有效检测布鲁氏菌感染并把流产布鲁氏菌和猪布鲁氏菌区分开。     

布鲁氏杆菌LPS抗原制备及其免疫原性测定

采用热酚水法提取布鲁氏杆菌脂多糖,分离、纯化并SDS-PAGE银染鉴定。纯化的细菌内毒素免疫小鼠,通过斑点ELISA测定血清抗体效价,检测细菌内毒素免疫原性。采用热酚法能获得较高纯度的细菌内毒素,其免疫原性较高,斑点ELISA测血清效价达到1∶1 000 000,与全菌免疫原性接近。本研究为制备布鲁氏杆菌单克隆抗体和建立布鲁氏杆菌病快速诊断方法奠定研究基础。     

标记抗体染色法检查布氏杆菌的研究

为了建立一种快速、简便、敏感、特异地检测动物病理材料中布氏杆菌的方法,选用四种标记抗体法,对5种共15个生物型的布氏杆菌,以及大量与流产有关或常常污染病理材料的对照细菌,分别进行了纯菌、感染实验动物及牦牛组织材料的染色检查,并与柯氏染色法及细菌分离培养法进行了比较。结果表明,四种方法对于各种材料中的布氏杆菌(粗糙型犬布氏菌除外)均呈阳性反应,而绝大多数对照菌均呈阴性反应。其中尤以SPA法染色背景更为清晰,非特异性反应更少。这些方法既简便、快速,检出率也较高。对于布氏杆菌病的诊断和疫情监测,是很有价值的。     

牛奶样品布氏杆菌套式PCR检测方法的建立

    为建立从奶品中监控布氏杆茵感染的方法,根据牛布氏杆菌omp25、omp31和16S rRNA基因序列设计内、外向引物,优化牛奶样品中布氏杆菌基因组DNA提取方法,建立牛奶样品布氏杆菌套式PCR方法结果显示,使用人工合成的两对F4/R2和F2D/R1U套式引物,通过两次扩增,可有效扩增出牛奶中污染布氏杆菌的16S rRNA的特异性DNA片段,其对牛奶样品中布氏杆菌检测下限达33CFUmL-1.该套式PCR与大肠杆菌、溶血性链球菌、沙门氏茵、克雷伯氏杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和螺旋杆菌等相关细菌DNA无交叉反应,显示高度的布氏杆菌特异性,其与布氏杆菌分离鉴定的符合率达100%本试验建立的布氏杆菌套式PCR检测方法具有较好的特异性和敏感性,适用于牛奶样品中布氏杆菌的实验室快速检测     

牛布鲁菌与牛分枝杆菌双重PCR方法的建立及应用

根据GenBank中已发表的流产布鲁菌种特异的omp25基因序列及牛分枝杆菌特异保守的16S rRNA加工蛋白rimM基因序列设计了2对特异性引物,通过对PCR条件的优化,建立了快速鉴别检测牛布鲁菌Brucella abortus和牛分枝杆菌Mycobacterium bovis的双重PCR方法.对建立的方法进行特异性和敏感性试验,结果显示,在牛布鲁菌和牛分枝杆菌中分别扩增出448、269 bp的特异性目的条带,作为对照的大肠杆菌Escherichia coli、沙门菌Salmo-nella typhimurium、八叠球菌Sarcina lutea、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus、巴氏杆菌Pasteurella multocida、军团菌Legionella pneumophila、枯草杆菌Bacillus subtilis及溶血性链球菌Streptococcus pneumonia均未扩增出任何条带.牛布鲁菌和牛分枝杆菌的DNA最低检出量均为10 pg;牛奶样品中人工污染的牛布鲁菌和牛分枝杆菌的检测敏感性分别为7.9×103CFU/mL、3 ng/mL.