转EGFP基因猪羊水干细胞的体外分化

目的：获得转EGFP基因猪羊水干细胞并监测其自我更新、增殖和多向分化潜能。方法：利用羊水干细胞培养技术体系,从胎龄30 d猪胎儿羊水中分离培养羊水干细胞,通过脂质体介导转染技术,将EGFP基因导入羊水干细胞,诱导转基因羊水干细胞贴壁分化,观察其体外增殖、分化特点。采用RT-PCR技术检测干细胞和分化细胞表面标志或相关基因。结果：成功分离培养出羊水干细胞,获得转EGFP基因羊水干细胞,羊水干细胞在表达EGFP的同时仍具有多向分化潜能。羊水干细胞中β-Actin、NogoA、DCX、CyclinD2、CD133、Hes1、Oct4、Desmin、CD-90、Nanog和Sox2表达阳性;体外诱导的羊水干细胞可以分化为星形胶质细胞(表达GFAP)、少突胶质细胞(表达GalC)和神经元细胞(表达NF、NSE和MAP2);能分化为脂肪细胞（表达LPL和PPARγ-D）、成骨细胞（表达Osteonectin和Osteocalcin）、肌细胞（表达myf-6和myoD）和内皮细胞（表达CD31、CD34、CD144 和eNOS）。结论：从猪胎儿羊水分离羊水干细胞具有可行性和有效性,转EGFP基因羊水干细胞具有自我更新、增殖和多向分化潜能,可以用EGFP对羊水干细胞进行标记、追踪。     

人源羊水干细胞的培养、鉴定及影响因素分析

取人羊水标本进行羊水干细胞原代,分离培养,并探讨人羊水标本性状等因素对原代分离培养的影响.结果表明,分离的羊水干细胞表达Oct-4等胚胎干细胞和CD29等成体干细胞的特异基因,细胞生长迅速,增殖能力较强,并可分化为Nestin阳性的神经细胞和α-actia阳性的心肌细胞.同时,在羊水干细胞原代培养时,羊水标本性状在一定程度上影响细胞的贴壁数量及贴壁时间.羊水标本细胞的贴壁时间孕中期(4.7±0.6)d与孕晚期(6±0.5)d有明显差异(P<0.05),孕晚期贴壁时间较长.羊水中血液污染程度对贴壁时间有明显影响,重度污染组(10.8±0.3)d与无污染组(6±0.5)d、轻度污染组(6.3±0.6)d贴壁时间差异均显著(P<0.05).羊水体积对原代细胞的贴壁数量和细胞贴壁时间有一定影响,羊水体积增大贴壁时间延长,但差异不显著,而贴壁细胞数量随羊水体积增加而增加,各组之间差异显著(P<0.05).实验系统地检测了羊水干细胞原代培养的影响因素,为羊水干细胞研究提供了可以借鉴的资料,同时分离得到的羊水干细胞,具有分化为神经细胞和心肌细胞的潜能,有望作为种子细胞进行临床应用.     

优化的小鼠STO细胞系重编程多功能干细胞的建立

研究鼠胚成纤维细胞系STO (SIM-6-thiogunanie-oualiain)诱导为多功能干细胞(induced pluripotent stem cells),(STO-iPSCs).通过磷酸钙法将连接有Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc 4个转录因子的慢病毒载体FUW-OSKM转染293FT细胞包装病毒,然后用病毒感染STO细胞,以干细胞培养条件培养.挑取诱导15d的克隆并在有饲养层和无饲养层的培养体系中培养.对获取的STO-iPSCs进行生物学特性分析,具有典型胚胎干细胞的形态特征,碱性磷酸酶染色呈阳性;qPCR结果表明,表达很高的原癌基因Nanog和Oct4 mRNAs;免疫细胞化学表明,表达胚胎干细胞特异性标志Nanog和Oct4,并且能够体外诱导分化为神经细胞.实验获得了STO-iPSCs,建立了STO-iPSCs无饲养层培养体系.     

胎猪胰腺干细胞的分离与鉴定

从胎猪胰腺分离得到一株细胞，该细胞经免疫组化检测表达PDX-1，GLUT-2，PCNA，Glucagon，somatostatin，polypeptide，弱表达nestin，目前细胞已传至58代。其在体外的生长行为有类似间充质干细胞样生长形态，经诱导后可分化为具有三维立体结构的类胰岛细胞团。成团后细胞强表达insulin、ck-19等标志，放免测定显示诱导成团后细胞胰岛素分泌量增加，显著高于未诱导细胞（P<0.05）。说明胰腺内存在着多潜能干细胞，本方法分离到胎猪胰腺干细胞，经诱导分化可形成有功能的胰岛样细胞团并释放胰岛素,有望为进一步研究异种胰腺干细胞移植治疗糖尿病提供材料。     

猪转录因子Nanog高效表达、多克隆抗体制备及其应用

多能转录因子Nanog可维持干细胞的自我更新和多向分化潜能.为深入研究猪(Sus scrofa)Nanog在多能性调控网络的作用,本研究制备了鼠抗猪源Nanog多克隆抗体.首先,从猪肾脏中克隆Nanog基因CDS,再将CDS连接到pET32a质粒上,构建重组表达载体pET32a-Nanog.将重组载体转化大肠杆菌(Escherichia coli) Rosetta (DE3),经异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-d-thiogalactoside,IPTG)诱导表达,优化最佳诱导时间、温度和IPTG浓度等表达条件,获得分子量为57 kD的Nanog重组蛋白.将纯化的Nanog蛋白,免疫C57BL/6小鼠(Mus musculus),6周后获得阳性抗血清,通过Western blot和免疫荧光检测其抗体效价及其特异性.结果显示,在28℃、8 mmol/L IPTG、诱导2.5 h的条件下,可获得高效Nanog重组表达;制备的鼠抗猪Nanog多克隆抗体能特异性识别猪诱导多能干细胞表达的Nanog蛋白.研究结果为猪多能性干细胞的研究提供了有力工具.     

人胎儿骨髓间充质干细胞分离培养与生物学特性研究

摘要 目的 人胎儿骨髓间充质干细胞（BMMSCs）的群体倍增次数（70～80次）是成体BMMSCs (30～40次）的两倍,分化能力优于成体干细胞,尤其是前3月龄胎儿BMMSCs,最接近胚胎干细胞,端粒酶活性高,生长速度快,分化能力强,可能是组织工程和再生医学研究理想的种子细胞。本研究的目的是建立２～３月龄流产人胎儿BMMSCs体外分离方法, 筛选其体外培养体系,鉴定其生物学特性及安全性,为体外诱导分化和组织工程研究提供种子细胞。方法 实验于2005-04/12在国家干细胞工程技术研究中心陕西分中心完成。采取纵向剪开骨髓腔涮洗细胞和全骨髓培养法分离２～３月龄流产胎儿BMMSCs, MTT法筛选基础培养液和血清浓度并制作生长曲线,流式细胞仪和免疫组织化学法鉴定细胞抗原标志,并通过核型分析和成瘤实验评估细胞的安全性。结果 沿长轴剪开骨髓腔涮洗细胞法是获得２～３月龄人流产胎儿四肢长骨骨髓的实用方法。在本实验范围内α-MEM+20%FBS是体外培养2～3月龄流产胎儿BMMSCs的最佳体系。分离的第３代BMMSCs除表达成体BMMSCs表面抗原标志外还表达Oct4、SSEA3和SSEA4,第6、12和24代细胞在对数增长期的群体倍增时间分别为34h、36h和40h,且均为二倍体核型、不成瘤。结论 2～3月龄人流产胎儿BMMSCs在体外容易分离和培养,表达部分胚胎干细胞抗原标志,生长速度快,传代次数多,安全性良好,可以成为人类组织工程和再生医学研究理想的种子细胞。     

猪成熟脂肪细胞分离培养及去分化研究

成熟脂肪去分化技术可为研究脂肪细胞分化提供均一的前体脂肪细胞。本研究分离培养了猪成熟脂肪细胞,并去分化为前体脂肪细胞。本实验采用Ⅱ胶原酶消化后离心分离1~3日龄仔猪(Susscrofa)皮下脂肪组织,天花板法培养获得成熟脂肪细胞。显微镜下观察脂肪细胞去分化形态学变化,并在成脂诱导培养液的作用下诱导再分化。采用油红O染色法检测分化不同时期细胞脂滴聚集效率,脂滴的累积随诱导的进行不断增加。RT-PCR检测成熟脂肪细胞标志基因过氧化物酶体增殖物活化受体(PPARγ)和和脂肪酸结合蛋白4(FABP4)的mRNA相对表达量,分化早期基因表达水平较低,其表达水平在分化过程中持续增高,在分化后期PPARγ相对表达量与诱导分化前增加了2.8倍,FABP4增加了约62倍(差异显著P<0.05)。说明去分化获得的前体脂肪细胞在成脂诱导培养液作用下,可有效地分化为成熟脂肪细胞。本研究优化了猪成熟脂肪细胞分离和培养体系,并通过去分化获得具有再分化能力的前体脂肪细胞,为进一步深入研究猪脂肪细胞分化与代谢提供技术平台。     

猪诱导多能干细胞多能性相关基因启动子区域甲基化检测

DNA甲基化是一种十分重要的表观遗传修饰,与转座元件沉默、基因组印记以及X染色体失活等多种生物学过程相关。胚胎特异性转录因子的表达可以将已经分化的小鼠(Mus musculus)成纤维细胞重编程为诱导多能干细胞(iPSCs)。由于在重编程过程中还伴随着一系列的表观遗传修饰变化,iPSCs可作为研究表观遗传特点的有利工具,用来研究表观遗传修饰的相互作用及其动态学过程。本研究中,从35 d的猪(Sus scrofa)胎儿分离出胎儿成纤维细胞(PFF),使用经典的4因子组合,即Oct4、Sox2、Klf4和cMyc将PFF重编程为iPSCs,并进行了多能标记的染色,结果表明,所得到的克隆呈现OCT4、SOX2、NANOG和SSEA1阳性结果。采用亚硫酸氢盐测序法对内源性多能性相关基因Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc的启动子区域甲基化进行了检测,发现其启动子甲基化程度很低,表明体细胞重编程为iPSCs的过程伴随着多能基因启动子甲基化程度的降低,为理解iPS重编程中多能性相关基因的DNA去甲基化过程和了解控制多能性相关基因的表观遗传调节提供基础。