松材线虫mapk基因克隆及RNAi效应分析

促分裂原活化蛋白激酶(Mitogen Activated Protein Kinase)在线虫生长发育过程中具有重要作用。本研究利用RACE方法克隆了松材线虫mapk基因,其基因全长1 744 bp,5'UTR长243 bp,3'UTR长81 bp,含有一个1 098 bp的开放读码框,包括6个外显子和5个内含子,为单拷贝基因,其预测的蛋白序列与其他线虫的序列相似性为77.66%~84.01%。通过体外转录合成341 bp的dsRNA,将松材线虫的幼虫浸泡在1.5 mg·mL-1dsRNA中24 h后,mapk表达量下降约85%,松材线虫的死亡率约为对照的4.2倍,经dsRNA浸泡的成虫,繁殖能力下降约50%,表明mapk基因的沉默可能抑制松材线虫的繁殖能力。     

禾谷孢囊线虫(Heterodera avenae)纤维素结合 蛋白基因(Ha-cbp-1)的克隆和序列分析

 禾谷孢囊线虫(Heterodera avenae)是中国小麦上的重要病原线虫。纤维素结合蛋白基因是一种重要的植物线虫寄生和致病相关基因。用同源克隆的方法从禾谷孢囊线虫寄生前二龄幼虫中克隆出一种纤维素结合蛋白新基因Ha-cbp-1（GenBank 注册号GQ178086）cDNA序列。Ha-cbp-1基因cDNA包含1个开放阅读框,编码131个氨基酸残基的蛋白质,预测蛋白由1个长度为18氨基酸残基的信号肽和1个纤维素结合区域（CBD）组成。Ha-cbp-1的基因组DNA序列含有2个内含子。预测的禾谷孢囊线虫纤维素结合蛋白（HA-CBP-1）序列与大豆孢囊线虫纤维素结合蛋白（HG-CBP-1）序列有60%的同一性和76%的相似性,与甜菜孢囊线虫纤维素结合蛋白（HS-CBP-1）序列有60%的同一性和75%的相似性。本研究首次从禾谷孢囊线虫中成功克隆出CBP蛋白基因。     

昆虫病原线虫发育相关基因的差异表达

以共生细菌致病杆菌上清过滤液诱导小卷蛾斯氏线虫A24的感染期线虫恢复发育,并利用RNA连接酶介导的RACE技术构建了其全长cDNA文库。通过PCR扩增、反向Northern杂交筛选差异表达的基因,获得48个差异表达的克隆。对差异表达基因进行测序和生物信息学分析,获得34个有效序列,这些序列按照蛋白质功能包括多个核糖体大小亚基蛋白、延伸因子、丝氨酸蛋白酶抑制剂、细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶、ATP依赖性Clp蛋白酶、酯酶、热休克蛋白、协同转运蛋白、脂蛋白、载体蛋白合成酶、Ngg1相互作用因子等。通过诱导感染期昆虫病原线虫恢复发育,并构建其cDNA文库,筛选出一批与感染期线虫发育相关的候选基因。     

松材线虫fem-1基因的克隆与表达特性研究

 松材线虫病是世界性的检疫病害,严重威胁松林等森林资源和生态安全。有研究表明,Feminization(fem)基因家族在秀丽隐杆线虫中参与性别决定和分化。本研究克隆了松材线虫fem-1基因,并对其表达特征和调控功能进行研究。结果表明,该基因cDNA全长为856 bp,包含681 bp的开放阅读框,编码226个氨基酸,进化分析显示与秀丽隐杆线虫位于同一进化分支。荧光定量PCR以及原位杂交结果显示, fem-1基因在松材线虫各个发育阶段均有表达,其中在2龄虫期表达水平最高;在卵期至3龄虫期阶段于虫体中后部表达,而发育后期,多位于皮下细胞中表达,肠道、性腺等部位极少出现杂交反应。利用RNA干扰技术沉默fem-1基因后,线虫种群雌雄比例出现下降,说明fem-1基因可能参与松材线虫性别分化和决定过程。研究结果有助于了解松材线虫性别决定相关基因表达特性与功能,为深入研究松材线虫发育生物学提供一定的理论依据。     

松材线虫伴生细菌宏基因组fosmid文库构建及特征分析

 松材线虫是松材线虫病的病原,且与其伴生细菌之间存在互作。为研究松材线虫和伴生细菌的互作关系,本研究用Nycodenz介质离心和SDS裂解法富集松材线虫的伴生细菌,以酚/氯仿抽提法提取DNA,构建了松材线虫伴生细菌fosmid宏基因组文库。文库克隆的插入片段大小分布在30~45kb,平均长度为40kb。该文库包含19200个克隆,共计包含7680000kb DNA。文库稳定性检测表明插入的DNA片段能够在fosmid质粒中稳定遗传,没有发现插入片段丢失或重排。随机挑选96个克隆进行末端测序,BLAST分析表明:该文库中松材线虫序列占5.2%,细菌序列占64.6%,无同源序列14.6%。对伴生细菌多样性分析表明:Stenotrophomonas为优势种群,Sphingomonas、Cupriavidus和Pseudomonas为次优势种群。该文库的建立为揭示松材线虫与其伴生细菌的互作关系及伴生细菌的生态功能奠定了基础。     

松材线虫Hsp70基因的克隆与原核表达

 热激蛋白70(Hsp70)是已知热休克蛋白家族中最重要的-种, 它在细胞内的大量表达可以明显改善细胞的生存能力, 提高对环境胁迫或伤害的耐受性。采用RACE-PCR技术, 从松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)中克隆了Hsp70基因的全长cDNA序列(共2 061 bp)(GenBank登录号为:DQ785812)。其编码-个分子量为70 kD的642个氨基酸的蛋白序列, 含有3段Hsp70家族的签名序列。同源性分析表明, 氨基酸序列与其它真核生物的Hsp70序列具有很高的相似性, 并与秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)热激蛋白70家族中的hsp-1基因编码的氨基酸序列更为相似。因此, 将克隆的松材线虫Hsp70基因命名为Bx-hsp-1。构建了-个原核表达载体Bx70pEASY-E1, 当IPTG终浓度为0.4~0.8 mmol/L时, 能诱导表达融合蛋白。Bx-hsp-1基因的克隆和表达, 将为松材线虫的生态适应性机理研究奠定基础。     

链孢粘帚霉寄生核盘菌菌核相关基因的EST生物信息学分析

链孢粘帚霉Gliocladium catenulatum是一种重要的菌寄生真菌,为了明确该菌与寄主核盘菌Sclerotinia sclerotiorum互作中参与菌寄生过程的功能基因,本实验室前期采用抑制消减杂交技术(SSH)构建了消减cDNA文库.本文从该库里随机挑选420个阳性克隆进行测序分析,结果表明克隆片段大小在200～600bp的序列占81.07%.去除载体和小于100bp的序列,获得391条有效序列,其平均长度为409bp.通过序列拼接得到181个单值基因(unigenes),其中包括27个重叠群(contigs)和154个单拷贝的ESTs(singletons).将得到的ESTs与NCBI非冗余蛋白数据库(NR)进行BLASTx分析,结果显示有38个基因的编码蛋白与已知功能的蛋白有较高的相似性,其中包括可能与生物防治功能相关的内切葡聚糖酶、脂滴包被蛋白、MFS转运蛋白、过氧化物酶等;有39条序列在NCBI数据库中未找到相似序列,可能为新基因;其他基因的编码蛋白与数据库中功能未知蛋白相似性高.本研究为明确与重寄生功能相关的基因奠定了基础.     

中华卵索线虫β-actin基因的克隆与分析

利用RACE技术克隆中华卵索线虫Ovomermis sinensisβ-actin基因,RT-PCR方法检测该基因在中华卵索线虫不同发育时期的表达情况。结果首次获得了中华卵索线虫β-actin基因全长cDNA序列。该基因cDNA全长1636bp,其中ORF长1131bp,编码376个氨基酸;5′UTR长137bp;3′UTR长367bp。由该cDNA推导的蛋白质序列与秀丽隐杆线虫Caenorhabditis elegans、人类等物种的β-actin蛋白序列相似性均在95%以上。系统进化树显示其系统发育关系与传统的分类关系基本一致。β-actin基因在不同发育时期的线虫中持续恒量表达。由此推断中华卵索线虫β-actin基因具有高度保守性,可以作为生物物种进化的分子标志,且能较好反映物种间的系统发生关系,是量化实验的理想内标参照。     

香蕉相似穿孔线虫Rs-flp-14基因克隆与特征分析

类FMRF酰胺多肽(FMR Famide-like peptides,FLPs)在控制寄生性线虫侵染、取食和繁殖过程中起着重要作用。在防治线虫时,FLPs信号系统经常成为药物的作用靶标。本研究以香蕉相似穿孔线虫(Radopholus similis)为材料,用RT-PCR和RACE方法,获得了类FMRF酰胺多肽flp-14基因的cDNA全长序列,命名为Rs-flp-14。此基因cDNA序列全长为569bp,包括一个357bp的开放阅读框(0RF),编码含119个氨基酸的蛋白,分子量与等电点分别为12.85KD和9.41。序列分析表明Rs-flp-14编码2个FLP肽(2xKHEYLRFG),N端具有27个氨基酸残基组成的信号肽。Southern杂交显示其为单拷贝基因。cDNA与基因组DNA重叠分析表明基因包含三个内含子,四个外显子。聚类分析表明该基因与猪蛔虫的As-flp-14同源,相似度最高(64%)。原位杂交结果显示Rs-flp-14基因表达位置在线虫的神经环部位。本研究结果将为研究该基因功能奠定基础,并为以FLPs为作用靶标的防治线虫药物提供理论依据。     

Bxy-egl-30调控松材线虫早期个体发育的生物学功能研究

“发育快，交配效率高”是松材线虫种群扩张和病害流行的基础。通过生物信息学分析、原位杂交和RNAi等技术，本研究明确了Bxy-egl-30在松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)个体生长发育过程中的功能。生物信息学分析结果表明Bxy-egl-30编码区长度为1 128 bp,编码375个氨基酸，属于EGL-30蛋白亚基家族。原位杂交结果显示Bxy-egl-30基因在松材线虫不同发育阶段的表达具有特异性，在胚胎期与幼虫期该基因广泛表达于性腺、肠道和附近的体壁细胞等部位；在成虫期，该基因在雌虫的阴户肌肉和雄虫的性腺部位集中表达。RT-qPCR结果显示Bxy-egl-30在二龄期表达量最高，胚胎期次之，三龄期、四龄期和成虫期表达量依次降低。浸泡Bxy-egl-30双链RNA后，松材线虫胚胎的孵化率下降了10.88%,二龄期、三龄期幼虫活力明显下降，每分钟头摆频率约下降4次。致病性接种实验结果显示松材线虫被Bxy-egl-30双链RNA干扰后致病性减弱，减缓了黑松的死亡时间，干扰组黑松的死亡时间比对照组晚9 d。本研究明确了Bxy-egl-30基因在松材线虫不同发育阶段...     

感染松材线虫病松树滑刃目线虫调查

 本研究首次在全国范围内调查感染松材线虫病松树体内滑刃目线虫的种群组成,包括种类记述和数量组成分析。结果表明:在300份样品中共分离得到10种滑刃目线虫,隶属于3科、4属,其中有2个国内新记录种;它们是松材线虫、拟松材线虫、霍夫曼尼伞滑刃线虫、薄荷滑刃线虫、大核滑刃线虫、小麦长尾线虫(国内新记录种)、爱尔密那长尾线虫(国内新记录种)、李氏长尾线虫、吴氏长尾线虫和外滑刃科线虫一种;描述并且图示比较它们的形态特征。种群数量组成分析表明:松材线虫在感病松树体内占据绝对的优势,削弱了松树线虫群落组成的多样性,即线虫群落结构趋向单一化。研究还表明,利用长尾属线虫的捕食习性来控制中国松材线虫病的流行与危害值得进一步探索与研究。     

黑松13个抗病家系对松材线虫的抗性反应及组织病理学观察

 为评估自日本引进的抗性黑松对松材线虫(Pine Wood Nematode,PWN)的抗病性,选用3个不同来源的PWN强毒和中强毒虫株采用皮接法接种,对1.5年生的黑松13个优良家系进行抗病性测定。结果表明,引进的黑松大部分家系对3个PWN虫株都表现出一定的抗病性,但针对不同虫株,抗病各家系间差异明显,其中有7个家系(3、4、5、6、9、11和12号)表现良好。同时,为探讨引进黑松家系感染PWN后的组织病理反应,对12号抗性家系进行组织病理学研究。观察表明,松材线虫在抗性黑松和普通黑松中的纵向扩散速度差别不明显,但其在抗性黑松内的横向扩散速度比在普通黑松内要慢,且抗性黑松体内木射线细胞和围绕树脂道泌脂细胞的薄壁细胞,出现病变要比普通黑松晚;在接种后同一时间取茎段的同一部位发现,抗性松苗组织解剖结构及细胞的病变和破坏程度要比普通松苗轻。     

稻瘟病菌附着胞差异表达基因文库的构建方法

 利用抑制性差减杂交方法构建了稻瘟病菌分生孢子接种24h所形成的附着胞差异表达基因文库。采用复印胶片诱导稻瘟病菌附着胞形成,在孢子浓度为1.0×10⁶个/mL时,附着胞的形成率达到96.5%。分别提取附着胞、菌丝和分生孢子RNA,反转录成cDNA并经Alu Ⅰ酶切、接头连接后,以附着胞cDNA片段为tester,菌丝及分生孢子cDNA为driver进行抑制性差减杂交,构建成差减文库。从文库中分离获得142个基因片段,通过RT-PCR方法鉴定其中的71个为差异表达基因,证实文库高效可靠。构建优质的稻瘟病菌附着胞差异表达基因差减文库,为深入了解附着胞形成过程中基因的表达及功能奠定了基础。     

辽宁省松材线虫病疫木上发现媒介天牛的天敌花绒寄甲

花绒寄甲作为天牛类害虫的重要天敌在我国广泛应用于生物防治,尤其在控制松材线虫最重要的传播媒介松褐天牛方面发挥了重要作用,它在自然界与不同种类的天牛长期协同进化,形成了不同生物型。本文在辽宁省抚顺松材线虫病疫区的疫木上调查发现了花绒寄甲越冬成虫,通过形态学和生物学观察,确定了该花绒寄甲为云杉花墨天牛生物型花绒寄甲。这是花绒寄甲作为云杉花墨天牛的自然天敌在我国首次被发现,这将对中国北方地区松材线虫病传播媒介的防治起到积极的推动作用。     

香蕉果实炭疽病病程相关基因cDNA片段克隆

 A suppression subtractive hybridization(SSH) cDNA library was constructed from 5 d lesion of banana fruit inoculated with Colletotrichum musae F1.70 cDNA clones selected randomly were sequenced and analysed.The result showed that 29 cDNA clones were related to disease resistance.They were chitinase,se-rine/threonine phosphate,Leucine-rich repeat(LRR),isoflavone reductase and so on.     

小麦丙氨酸氨基转移酶基因TaAlaAT1的克隆及表达特征分析

 在已构建的受条锈菌(Puccinia striiformis f.sp.tritici)诱导的小麦非亲和抑制差减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)文库中,筛选到1个与水稻丙氨酸氨基转移酶基因高度相似的表达序列标签(expressed sequence tag,EST),利用电子克隆与RT-PCR相结合的方法,从小麦中获得1个1563bp的cDNA序列,命名为TaAlaAT1。序列分析表明,TaAlaAT1包含1个完整的开放阅读框,长1440bp,推测编码479个氨基酸。该氨基酸序列具有氨基转移酶的保守特征,与水稻、葡萄、大豆、拟南芥、苜蓿等多种植物的丙氨酸氨基转移酶高度相似,其中与水稻的亲缘关系最近。半定量RT-PCR与实时定量PCR结果显示,TaAlaAT1在小麦与条锈菌互作的非亲和组合中总体呈上调表达,在亲和组合中呈下调表达,且在2个组合中的表达差异显著。推测TaAlaAT1参与了小麦对条锈菌的防御反应。     

爪哇根结线虫Mj-1-1基因的克隆、鉴定及RNAi表型分析

根据爪哇根结线虫食道腺内表达的EST序列,结合反式剪接序列SL1,从爪哇根结线虫中克隆了一个假定寄生基因Mj-1-1(KU358725),该基因的c DNA全长为573 bp,包含450 bp的开放阅读框(ORF),编码149个氨基酸。DNA全长为740 bp,包含2个内含子,长度分别为20 bp和111 bp。NCBI BLASTn比对表明,Mj-1-1与南方根结线虫的M.incognita zk1236.5(JQ284068)基因相似性最高,为97%。原位杂交表明Mj-1-1基因在爪哇根结线虫的背食道腺中表达,qRT-PCR结果表明Mj-1-1基因在爪哇根结线虫寄生性3龄幼虫阶段表达量最高。对爪哇根结线虫侵染前2龄幼虫的Mj-1-1基因进行沉默,调查发现,沉默Mj-1-1后,爪哇根结线虫对番茄的侵染力显著下降,表明Mj-1-1对爪哇根结线虫侵染和寄生具有重要的调控作用。