滨麦蔗糖:果聚糖6-果糖基转移酶(6-SFT)基因全长cDNA的克隆与生物信息学分析

为了挖掘和利用滨麦(Leymus mollis,2n=4x=28,JJNN)的优良基因,以拓宽小麦非生物胁迫抗性基因资源,以滨麦为材料,利用RT-PCR结合RACE技术从滨麦叶片中克隆到6-SFT基因cDNA的全长序列,并对其进行生物信息学分析。结果表明,其cDNA全长为2 086bp,开放阅读框为1 866bp(命名为Lm-6-SFT),编码621个氨基酸;其推导的蛋白分子量为69.1kDa,理论等电点(pI)为5.18,属于酸性蛋白。保守结构域分析表明,该基因推导的氨基酸序列含有SDPDG、RDP和EC结构域。多序列比对及进化树分析表明,滨麦6-SFT与冰草6-SFT在氨基酸水平具有高度的序列相似性。     

侵染福建省甘蔗的高梁花叶病毒全长基因的分析

从福建农林大学甘蔗综合研究所培育的甘蔗品种福农95-1702中,采集表现花叶症状的甘蔗病叶,根据NCBI上已登录的甘蔗花叶病毒全长基因序列设计引物,利用RT-PCR和RACE技术进行全长基因克隆。结果表明,病毒分离物FJ10为高梁花叶病毒,全长不包括poly(A),有9 375 bp。整个基因只有一个开放读码框,编码成由3 071个氨基酸组成的多聚蛋白,FJ10含有一些与其它马铃薯Y病毒属病毒共有的氨基酸序列。序列分析结果表明,FJ10分离物与美国的分离物SrMV-H同源性最高,核苷酸序列同源性达91.2%,编码的多聚蛋白氨基酸序列同源性达96%,与来自中国浙江的甘蔗分离物核苷酸序列同源性为82%,氨基酸序列的同源性达89.6%。     

茶氨酸合成酶基因的全长cDNA克隆及序列分析

采用SMART RACE技术成功克隆了安吉白茶茶氨酸合成酶基因（TS）的全长cDNA序列,并将其登录Genbank,登录号为JN226569。TS基因的cDNA全长为1503bp,开放阅读框（ORF）为1071bp,编码356个氨基酸。经生物信息学分析,TS蛋白的氨基酸残基数为356,分子量为39250.3Da,理论等电点（PI）为5.79,其氨基酸序列中可能不存在卷曲螺旋结构。TS蛋白不存在信号肽序列,不发生跨膜运动,属于亲水性的非分泌蛋白,其磷酸化位点有26个。通过亚细胞定位预测,安吉白茶TS蛋白是一种细胞质蛋白。克隆茶氨酸合成酶基因的全长cDNA序列,对于利用生物技术手段改良茶树品种,以调控茶树中茶氨酸的含量具有重要意义。     

木奈果实中花青素合成酶基因PsANS的克隆及原核表达分析

根据NCBI数据库中已知的蔷薇科植物花青素合成酶基因序列设计特异引物,从本实验室已经构建好的木奈成熟果实均一化全长cDNA文库中筛选分离得到了一个编码花青素合成酶的cDNA:基因命名为PsANS,登录号:JN560957。该cDNA长1 478 bp,包含137 bp 5’非编码区,267 bp 3’非编码区,开放阅读框长度为1 074 bp。PsANS编码358个氨基酸,分子量为40.41 ku,理论等电点为5.35。经BLAST分析对比发现,PsANS氨基酸序列与甜樱桃、苹果和草莓的ANS氨基酸同源性都很高,分别为98%、93%和89%。将PsANS亚克隆到原核表达载体pGEX-6P-1和pET-32a上,在大肠杆菌BL21中经1mmol/L ITPG诱导表达获得了木奈PsANS融合表达蛋白,其分子量大小与预期的一致,进一步确认本试验克隆得到的PsANS为木奈花青素合成酶基因。     

茶树八氢番茄红素脱氢酶cDNA全长克隆与表达分析

八氢番茄红素脱氢酶是类胡萝卜素生物合成途径的关键酶之一。本实验采用3’/5’RACE和RTPCR技术成功扩增出茶树八氢番茄红素脱氢酶基因（PDS）的3’端和5’端序列,序列拼接获得全长cDNA序列,命名为CsPDS,并将其登录至GenBank,登录号KF646537。经生物信息学分析,所得基因cDNA序列全长为2295 bp,开放阅读框（ORF）1749 bp,编码582个氨基酸,预测分子量约为64.86 kDa,理论等电点（PI）为6.77,属于亲水性蛋白。该基因编码的氨基酸序列与柿树PDS序列的同源性达到87%,多序列比对表明茶树PDS具有高度保守区域,基于邻接法的进化树显示与柿树、葡萄的亲缘关系最近。实时荧光定量PCR分析结果显示,CsPDS在‘黄金芽’体内表达没有受抑制,表明‘黄金芽’黄色白化可能不是在CsPDS基因转录水平异常而引起。     

甜菜BvCK2基因全长cDNA的克隆和序列分析

甜菜M14品系在细胞胚胎学和遗传学特征上具有鲜明的无融合生殖现象.为了寻找在这一特殊的生殖过程中的相关基因及其调控作用,实验通过同源克隆及cDNA末端快速扩增(RACE)的方法,首次从甜菜M14品系中克隆了与生殖相关的基因ByCK2(Beta vulgaris casein kinase 2)的全长cDNA序列,长度为1 501 bp,开放阅读框为1002 bp,编码333个氨基酸.根据氨基酸序列计算蛋白分子量为39.28kDa,pI=8.16.同源比对表明,ByCK2与烟草CK2(GenBank No.A1437635)的相似度为64.22%,与百合CK2(GenBank No.AF517838)的相似度为65.18%.通过细胞内定位分析,BvCK2所编码的蛋白主要存在于细胞核中.     

野生香蕉几丁质酶基因的克隆与序列分析

以野生香蕉叶片为试材,采用RT-PCR结合RACE法,通过T/A克隆测序,获得野生香蕉几丁质酶基因全长序列,并在GenBank登录(登录号为:FJ858155)。野生香蕉几丁质酶基因(ChiⅠ1)全长1115bp,包含924bp的ORF、14bp的5'非编码区、177bp的3'非编码区及17bp3'poly(A)尾。该基因开放阅读框编码307个氨基酸,分子量为32424.1u,预测的理论等电点为6.28,其结构包括信号肽、几丁质结合区、糖苷水解酶区。蛋白结构分析结果表明,该基因编码蛋白为跨膜蛋白,存在于胞外。野生香蕉几丁质酶基因(ChiⅠ1)属于酸性几丁质酶classⅠb,与大蕉几丁质酶classⅠb相似性仅为59.4%。结构分析结果表明,该基因可能具有几丁质酶/溶菌酶特点,且在过敏反应中起重要作用。     

大豆胞囊线虫热激蛋白基因Hsp70的克隆与原核表达

采用RT-PCR技术结合基因组步移技术,从大豆胞囊线虫(Heterodera glycines)中克隆了热激蛋白70基因(Hsp70)的全长cDNA序列(Hg-Hsp-70),全长1 953 bp,GenBank登录号为FJ816100.1。碱基序列分析结果表明,该序列含有9个外显子与8个内含子,与其它线虫具有较高的同源性。氨基酸序列分析表明,该基因编码650个氨基酸,相对分子量为70.7 kD,具有2个Hsp70基因家族的签名序列,与其它线虫的该基因氨基酸序列具有很高的同源性。构建了原核表达载体Hsp70pEASY-E1,采用IPTG诱导蛋白表达,SDS-PAGE电泳结果表明,当IPTG终浓度为0.2～1.2 mmol.L-1时均能显著诱导表达;以终浓度0.8 mmol.L-1的IPTG诱导5 h蛋白表达量达到最大值。     

茶树亲环素基因cDNA全长的分析鉴定与原核表达

通过对茶树新梢cDNA文库大量随机测序,获得了一个编码亲环素的全长基因,在GenBank登录,登录号为DQ904327。茶树亲环素基因cDNA全长949 bp,其中开放阅读框全长495 bp,编码蛋白质含有164个氨基酸,分子量约为17.47 kD,等电点约为8.54,它具备5’端非编码区的“CAAT”标志及3’端非编码区的”AATAAA”poly-A加尾信号。其推测的氨基酸序列经与26条其他生物亲环素蛋白氨基酸序列进行CLUSTAL W多序列联配并以Neighbor-Joining法进行进化树构建后,发现与水稻和小麦的相似性较高,达到85%以上。根据亲环素基因开放阅读框序列设计引物,构建了原核表达载体pET/Csin-Cyp,并在大肠杆菌BL21(DE3)中成功诱导出了一个分子量为23 kD的亲环素融合蛋白。     

龙眼胚性愈伤组织2个乙烯受体基因的克隆及序列分析

以龙眼胚性愈伤组织为材料,采用同源克隆和RACE方法分离得到两个乙烯受体基因的cDNA序列,即DL-ETR1和DL-ERS1,并在GenBank登录(检索号分别为FJ513322和FJ513323)。DL-ETR1全长为2611bp,包含长2223bp的完整的开放阅读框(ORF)以及388bp的3-UTR,3'poly(A)尾长24bp;DL-ERS1全长为2259bp,包含一个1929bp的ORF及330bp的3-UTR,3'poly(A)尾长17bp。两者根据核苷酸序列推测的蛋白质具有61.62%的同源性,在N端的同源性较C端高,DL-ERS1比DL-ETR1少104个氨基酸,DL-ERS1的蛋白在C端缺乏信号接受域,HisKA、ATPase_c以及GAF是它们共有的结构域,同属ETR1亚类乙烯受体。     

茶毛虫NPV的P24、Rr1、Lef1基因及其分子进化分析

克隆和测定了茶毛虫核型多角体病毒(EupsNPV)全长5942bp的EcoRI-XhoI基因组DNA片段。序列分析表明该片段包含5个完整的开放阅读框(ORF),分别编码P24、Rr1、38.7K、Lef1和Ep-ld124。通过对上述5个基因与其它已知杆状病毒的同源基因的分析比较,以及对P24、Rr1和Lef1的分子进化树分析,表明EupsNPV是一种与已知杆状病毒都有较大差异的病毒种类,属于NPVII组病毒。结果还表明EupsNPV与茶尺蠖(Ectropisobliqua)核多角体病毒(EcobSNPV)的亲缘关系最为接近。本文报道的序列的EMBL登录号为AJ920288。     

茶尺蠖类免疫球蛋白基因EoHML的克隆和表达分析

类免疫球蛋白（Hemolin）是一种鳞翅目昆虫特有的免疫相关蛋白,也是唯一的无脊椎动物免疫球蛋白家族成员。本实验应用RACE技术获得了茶尺蠖（Ectropis obliqua Prout）类免疫球蛋白基因的全长cDNA序列,命名为EoHML（GenBank登录号：KM885983）,并分析了相关生物信息学特性,检测了病毒感染后基因的表达水平。结果表明,EoHML基因序列全长1β772βbp,包含1β239βbp的开放阅读框,编码412个氨基酸,预测蛋白分子量大小为45.8βkD,等电点（pI）为8.297,属于典型的分泌型蛋白,且具有昆虫Hemolin基因保守的4个Ig功能区和2个N-glycosylation位点。系统进化分析表明,该蛋白与目前已知的类免疫球蛋白氨基酸序列的亲缘关系都较远,与烟草天蛾（Manduca sexta）类免疫球蛋白氨基酸序列相似度最高,为53%。荧光定量检测结果表明,茶尺蠖核型多角体病毒（EoNPV）感染茶尺蠖幼虫后该基因表达量显著升高,最高表达量是正常对照的36.5倍,表明茶尺蠖EoHML基因可能参与了茶尺蠖对EoNPV的免疫代谢反应。     

外源茉莉酸甲酯诱导茶树挥发物对昆虫寄生选择行为的影响

研究了应用外源 MJA 喷雾法或暴露法处理茶树后诱导的挥发性有机化合物对单白绵绒茧蜂和茶尺蠖成虫的行为选择,以及对单白绵绒茧蜂对茶尺蠖幼虫寄生率影响的研究。结果表明,外源 MJA 喷雾法或暴露法处理茶树,其诱导挥发性有机化合物对单白绵绒茧蜂成虫具有很强的引诱作用,对茶尺蠖成虫引诱作用不明显,在茶园中,显著提高单白绵绒茧蜂对茶尺蠖幼虫的寄生率。     

茶尺蠖病原真菌的分离鉴定及其特性

茶尺蠖(Ectropis oblique Prout)是华东茶区的主要害虫,近年来安徽茶园中的茶尺蠖普遍被真菌感染,经分离鉴定为圆孢虫疫霉(Erynia radieans(Brefeld)Humber et al)。它在该地区的大面积流行,有效地抑制了茶尺蠖的种群数量。本文对真菌的形态特征、精细结构、生物学特性、人工培养和引起流行病的因子进行了分析讨论。     

茶尺蠖幼虫取食提高茶树儿茶素代谢响应强度

研究了茶尺蠖幼虫为害茶树叶片对儿茶素合成途径的影响。采用3龄茶尺蠖幼虫取食茶树新梢芽下第二叶,测定了儿茶素合成相关基因的表达水平和儿茶素含量。研究结果表明,与对照相比,茶尺蠖幼虫为害后3、6、12βh显著诱导了CsANR基因的相对表达水平,且在为害后3βh和12βh达到了极显著差异。CsLAR基因在茶尺蠖为害后6βh和12βh,与对照具有显著差异。茶尺蠖幼虫为害后24βh显著诱导了没食子酸、没食子儿茶素、表儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯和表儿茶素没食子酸酯含量的升高,而茶尺蠖为害后48βh仅没食子酸和没食子儿茶素的含量显著高于对照;儿茶素、表没食子儿茶素和没食子儿茶素没食子酸酯在茶尺蠖为害后24βh和48βh均没有被显著诱导。上述结果表明茶尺蠖幼虫为害提高了茶树儿茶素合成途径的代谢强度和儿茶素类化合物的积累。     

基于化学生态学构建茶园害虫无公害防治技术体系

系统介绍了茶树害虫性信息素、虫害诱导茶树挥发物的生态功能、外源诱导茶树抗虫性以及非寄主次生代谢产物对茶尺蠖和假眼小绿叶蝉的行为调控效果四个方面的主要研究进展与应用,并在此基础上对茶园害虫的无公害防治体系进行了构建和展望。     

叶面分离Bt及对茶树主要害虫高毒力菌株的筛选

通过分离培养基和分离方法的筛选,得到了从叶面分离Bt的有效方法。用此法从25种植物叶面分离出54株Bt,利用茶尺蠖、茶小绿叶蝉和茶橙瘿螨作为靶标昆虫,筛选对茶树主要害虫有毒力菌株,得到了对鳞翅目有效的菌株10株,对同翅目有效的菌株4株,但所有测试菌株均对茶橙瘿螨无效。     

临安茶区茶尺蠖暴发因子分析

近半个世纪茶尺蠖在临安茶区呈间断性暴发,本文根据生产中监测数据和调查考证情况,分析每次茶尺蠖暴发与气候、茶园生产管理的改变和迁徙等因子的关联性,找到关联的主要影响因素,可以指导生产中及时采取绿色防控技术措施,控制茶尺蠖暴发成灾。     

茶皂素对雷公藤乳油防治茶尺蠖幼虫的增效作用

测定了茶皂素对雷公藤乳油防治茶尺蠖幼虫的增效作用。结果表明,用1、2、4mg/ml茶皂素浸叶处理,对茶尺蠖2龄幼虫的毒杀作用不明显,第7天的毒杀效果只有27.03%~37.84%。用雷公藤乳油0.8、1.6、3.2、6.4mg/ml和12.8mg/ml浸叶处理,对茶尺蠖2龄幼虫的毒杀效果在第7天分别为27.27%、33.78%、40.54%、56.76%和63.51%。在0.8mg/ml浓度的雷公藤乳油中加入4mg/ml的茶皂素,对茶尺蠖幼虫的毒杀作用(84.42%)显著高于加1mg/ml茶皂素的毒杀效果(68.83%);而加入2mg/ml和4mg/ml的防效差异不显著。向不同浓度的雷公藤乳油中加入2mg/ml茶皂素,对茶尺蠖2龄幼虫的共毒系数在第1、3、5、7天分别为667.68、981.61、1706.15和1209.76,即增效5.68~11.10倍,达到相同的使用效果可减少雷公藤用量85%以上。对茶尺蠖4龄幼虫增效1.00~6.91倍,减少雷公藤用量50%以上。     

TA-BR生物药肥的研制及在茶叶生产中的应用

茶树喷施生物药肥后,质量和产量均明显提高,鲜叶亩产量增幅为6.76%~26.90%,酚氨比明显降低,水浸出物、水溶性糖及维生素C均有所增加。同时,生物药肥对茶毛虫、茶尺蠖和茶蚕等茶树主要鳞翅目害虫的防治效果可达90%以上,对天敌安全。