用液氮冷冻保存犊牛睾丸原质细胞的试验

犊牛睾丸细胞作为多种病增殖的基质,己经应用在疫苗生产中,并有广泛的开发前景,但是由于产犊季节的不均衡,给生产带来了困难,为了使生产不受犊牛睾丸来源不足的影响,我厂自1994年起,做了用液氮冷冻保存犊牛宰丸原质细胞的试验,取得了令人满意的结果。     

利用血清冷冻保存犊牛睾丸原代细胞试验

在不利用冷冻保护剂的条件下,用犊牛血清对经胰酶消化分散的犊牛睾丸原代细胞进行超低温冷冻保存试验。结果表明,解冻后细胞成活率达75.73%以上,培养时可有效形成单层细胞,满足常规试验要求。复苏后的犊牛睾丸原代细胞于体外培养时存在贴壁迟缓,前期生长速度较慢等现象,且要求pH值低于7.0。     

冷冻保存新生牛睾丸组织中支持细胞的分离纯化

睾丸支持细胞(sertoli cells,SCs)是生精上皮中的多功能体细胞,其分离培养对体外探讨精子发生机理至关重要。因牛新鲜睾丸组织取材不便,本试验在前期基础上探讨了从冷冻保存的新生牛睾丸组织中分离纯化SCs的可行性。将冻存的1日龄牛睾丸组织复苏,进行形态学检查和SCs分离培养。石蜡切片苏木精-伊红(HE)染色显示,曲细精索及睾丸间质保存完好。二步酶消化结果显示,生精上皮解离良好。利用差异贴壁法将原代细胞纯化后扩大培养,绝大多数细胞呈不规则多边形,3d即可生长至汇合。RT-PCR分析显示,贴壁细胞表达SCs阳性分子标记胶质细胞源神经营养因子(GDNF)和雄性激素结合蛋白(ABP)而不表达精原细胞分子标记PLZF。流式细胞术检测显示,所获细胞中ABP和GDNF阳性细胞数分别为99.7%和99.8%。以上结果表明,从冻存的新生牛睾丸组织中可获高纯度的SCs。本试验结果为后续相关试验奠定了基础。     

用液氮冷冻保存犊牛睾丸原质细胞

进行了液氮冷冻保存犊牛睾丸原质细胞的试验.共制备了3批冷冻细胞,每批均包括原质细胞、原代细胞和次代细胞,并将其分别放入I号冷冻液和II号冷冻液中冻存.试验表明,用冻存方法保存犊牛睾丸原质细胞是切实可行的,而且用I号冷冻液冻存细胞的复活率明显高于II号冷冻液.     

牦牛与犏牛睾丸支持细胞分离培养及生物学特性比较分析

旨在建立牦牛与犏牛睾丸支持细胞分离培养及鉴定方案,比较两种牛睾丸支持细胞的生物学特性.本研究分别采集24月龄的3头健康公牦牛与3头F1代公犏牛睾丸组织作为2个样品组,其中每组3个生物学重复,分别通过混合酶消化、差速贴壁和饥饿处理分离得到两种牛的睾丸支持细胞,采用DMEM高糖及DMEM/F12培养基培养睾丸支持细胞,筛选...     

鸡睾丸细胞分离方法与培养的研究

近年来,随着对睾丸细胞研究的进一步深入,睾丸细胞的起源及其生成精子的机制已经明了,并且对它们的分离和体外培养也已取得了阶段性的进展。但这些研究多限于一些哺乳类动物,尤其以啮齿类动物居多[1]。而在禽类方面的研究还处于启蒙阶段。本研究旨在通过对鸡睾丸细胞几种分离方     

蒙古马睾丸支持细胞的体外分离培养与鉴定

为研究一种简单快速分离蒙古马睾丸支持细胞并保证其活性的基本方法,本试验采集2岁蒙古马睾丸组织于低温环境下进行机械分离,将1~3 g睾丸组织剪碎,采用重力沉淀法去除游离的红细胞和间质细胞;使用0.1%胶原酶Ⅳ和0.25%胰蛋白酶+EDTA逐步进行组织消化,并用含有10%胎牛血清的培养基进行细胞培养;在接种后采用差异贴壁法分离纯化支持细胞,使用Tris-HCl低渗法去除杂质细胞,并采用碱性磷酸酶（AKP）染色、HE染色、实时荧光定量PCR方法进行鉴定。结果显示,支持细胞贴壁性能较强,培养24 h后大多数细胞开始贴壁,细胞形状呈椭圆形;培养48 h后胞质增多,折光性变强;培养3~4 d细胞胞质展开紧密连接,此时细胞呈三角形,有明显的核仁,培养6~7 d细胞生长状态进入稳定期。实时荧光定量PCR结果显示,GATA4和GDNF基因在培养细胞中极显著表达（P<0.01）,AKP染色支持细胞呈阴性表达,表明分离培养的细胞确为支持细胞。本试验使用机械分离法与两步酶消化法处理组织,可快速高效地获得睾丸支持细胞,成功构建了蒙古马睾丸支持细胞体外培养方法。     

小鼠睾丸支持细胞的分离培养及其影响因素

为了简化小鼠睾丸支持细胞的分离方法,提高支持细胞的获取量,试验取初生6 d的昆明白小鼠睾丸,去除白膜,剪碎后用0.25%胰蛋白酶消化,制成细胞悬液并分装于25 cm2的培养瓶中,置于37℃、5%CO2的培养箱中孵育48 h,取出后冲洗2次,换液并继续培养。结果表明:支持细胞数占培养细胞总数的90%以上。     

牛精原干细胞的分离和纯化及体外培养的一般特性

采用两步酶消化法制备5月龄的牛生殖细胞悬液,用Percoll不连续密度梯度法分离精原细胞,接种于含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中,37℃,5%CO2饱和湿度培养,观察培养细胞的生长和形态变化。结果5月龄牛的曲细精管主要包含细胞为精原细胞、Sertoli细胞,每克睾丸实质收获生精上皮细胞总数平均为3.18×106个细胞,精原细胞纯化后纯度达69.27%,精原细胞主要分布于27%~35%的Percoll梯度中。牛精原干细胞体外培养6~7 d后开始分裂,20 d后精原干细胞形成小集落。结果表明用两步酶消化、Percoll不连续密度梯度法分离的精原细胞能满足体外培养的需要,可以存活并发生增殖。     

牛卵泡卵母细胞冷冻保存后发育潜力的研究

对用３种不同方法（Ａ法：１．０ｍｏｌ／Ｌ甘油平衡，从２０℃开始以１℃／ｍｉｎ的速度降至－℃，植冰，１０ｍｉｎ后以０．３℃／ｍｉｎ降至－３０℃，再以０．１℃／ｍｉｎ降至－３３℃，投入液氮；Ｂ法：１．６ｍｏｌ／Ｌ丙二醇＋０．ｌｍｏ１／Ｌ蔗糖平衡，５℃冰箱中保存１５ｍｉｎ，从Ｏ℃开始按Ａ法中的程序降温；Ｃ法：即玻璃化法）冷冻保存的牛ＧＶ期卵母细胞的发育潜力进行了研究。解冻后，Ｃ组卵母细胞形态正常率显著高于Ａ、Ｂ两组。３种方法冷冻的卵母细胞成熟培养后，平均卵丘扩展率为６０％，其中Ｃ组最高（６９．９％）。卵丘扩展的卵母细胞中，７９．３％发生ＧＶＢＤ，但大多数没有达到ＭＩ期。３组冷冻卵母细胞的体外成熟率、体外受精率分别为１４．２％、８．３％、２０．０％和１０．０％、７．１％、１２．１％，其中Ａ组中有１枚卵裂。     

鸡胚原始生殖细胞的冷冻保存和体外培养

采用Ficoll密度梯度离心,提取第19期(孵化72h)鸡受精蛋性腺中的原始生殖细胞(primordialgermcells,PGCs),用不同的冷冻保护液对PGCs采用提纯后直接冷冻保存和在培养体系中培养24h后再进行冷冻保存,7d后复苏,用台盼蓝染色检测其存活率,并用PAS染色对冷冻后的PGCs进行特异性鉴定。复苏后的PGCs在培养体系中培养5d后,更换为培养体系继续培养,进行体外分化试验。结果如下分离后直接进行冷冻保存的PGCs复苏后存活率最高为(85.93±1.24)%;复苏后的PGCs在培养体系中培养48h后进行了PAS染色鉴定,结果PGCs呈PAS阳性(细胞核不着色,细胞质呈红色),表明PGCs的染色特性没有因冷冻保存和体外培养而发生改变;复苏后的PGCs在培养体系中培养可形成细胞克隆,当把PGCs更换到培养体系培养5d后,PGCs克隆有的仍保持克隆状态,但体积缩小,克隆中细胞排列紧密,颜色较深,有的克隆由鸟巢状变为不规则形,且在克隆周围形成类神经细胞样细胞。而经体外培养后再进行冷冻保存的PGCs,复苏后存活率最高为(42.26±1.36)%。     

小鼠睾丸支持细胞分离培养及生物学特性鉴定

为了揭示睾丸支持细胞在精子发生及睾丸免疫豁免中的生物学作用,采用胰蛋白酶、胶原酶分步消化法和1/3浓度的Hank′s低渗液、50mmol/L Tris-HC(l pH7.1)液分别低渗处理及油红O脂质染色法对16～22d的幼鼠睾丸进行分离、纯化和生物学特性鉴定。结果表明:分离、纯化后的睾丸支持细胞损伤少、活率高、睾丸支持细胞占培养细胞总数的90%以上;根据形态学观察及油红O脂质染色法鉴定,睾丸支持细胞的生长状态良好,细胞突起很多,核仁清晰,胞质中可见大小不等的红色空泡状脂质小滴。     

梅花鹿鹿茸间充质层细胞的体外培养和冷冻保存

为了研究梅花鹿鹿茸间充质层细胞的生物学特性,取梅花鹿鹿茸生长顶端间充质层组织,分离间充质层细胞进行体外培养及冷冻保存。结果表明:在含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培养基中,鹿茸间充质层细胞能进行短期体外培养,培养的细胞呈成纤维细胞样,培养7 d可长至汇合。以含5%二甲基亚砜(DMSO)和10%FBS的DMEM为冻存液,经梯度降温后冻存,间充质层细胞复苏后存活率较高。在4℃条件下,间充质层组织在含10%FBS的DMEM中可保存7 d。     

新生牛生精上皮细胞体外培养的研究

两步酶消化法制备新生牛生精上皮细胞悬液,分离纯化、鉴定精原干细胞和支持细胞,冷冻保存支持细胞。以支持细胞为饲养层探索不同培养条件下精原干细胞的增殖情况,免疫组化鉴定。结果表明:10%DMSO与0.1mol/L的海藻糖组合作为冷冻保护剂,冷冻效果较好;血清浓度为2.5%、支持细胞密度为5×105个/mL时,新生牛精原干细胞较易形成集落;精原干细胞及其集落的AKP染色和C-kit免疫组化均呈阳性。     

睾丸支持细胞的功能、分离纯化及鉴定研究进展

支持细胞对维持精子形成过程中的微环境起决定作用,它可以通过分泌功能、细胞间连接形成的血睾屏障功能以及吞噬功能等来促进精子的形成过程,其发育异常会导致不同程度的雄性生殖缺陷。基于支持细胞在雄性动物生殖过程中的作用,体外培养高纯度支持细胞可成为研究睾丸两大核心功能-精子发生和性激素分泌功能相关调节机制重要的细胞模型。此外,体外培养睾丸支持细胞也可作为生殖毒理学等新兴热点领域的细胞模型,为评估和研究环境因素对雄性生殖的影响提供便利。因此,作者系统地归纳、总结了目前关于动物支持细胞生物功能的研究及常用的体外分离纯化、培养及鉴定方法,以期为利用动物支持细胞开展雄性生殖领域的研究提供参考。     

成年公兔睾丸支持细胞的分离纯化及鉴定

为了寻求一种从成年公兔睾丸获得大量高纯度、高活率支持细胞的方法，本试验采用了胶原酶、胰蛋白酶和透明质酸酶联合消化法，从成年公兔生精小管分离出支持细胞，通过Tris-HCl低渗处理和选择性贴壁培养对所得的支持细胞进行纯化，并采用形态学和HE染色鉴定。最终获得了大量较高纯度（78.3%）和高活率(90.7%)的支持细胞。     

牛体外胚胎冷冻保存的研究进展

体外胚胎冷冻保存技术是胚胎移植技术的重要组成部分,在辅助生殖技术中发挥重要作用,同时对种质资源保存、加强遗传改良和促进优质种源国际交流等方面具有重要意义。然而,体外胚胎冷冻过程中存在脂质含量过高、活性氧水平升高及机械损伤等问题,导致体外胚胎冷冻效率低,这极大地限制了体外胚胎冷冻保存技术的广泛应用。大量研究表明,通过去脂质、优化体外胚胎培养液、人工塌陷囊胚腔和优化冷冻程序等手段,可以有效提高冷冻后胚胎的存活率和发育能力。因此,本文概述了体外胚胎冷冻保存技术的研究进展和胚胎冷冻过程中存在的问题,总结了提高体外胚胎冷冻效率的方法措施,旨在为提高体外胚胎冷冻保存效率提供一定参考。