不同月龄山羊睾丸生精小管及固有层结构分析

试验旨在探究不同月龄山羊睾丸生精小管、固有层的结构及成分变化，及睾丸中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)蛋白的分布情况。选用1月龄和2月龄(幼龄)、12月龄(成年)山羊睾丸，利用特殊组织染色、免疫荧光、透射电镜并结合形态学计量统计分析，研究性成熟前后山羊睾丸生精小管、固有层细胞的结构成分及变化。结果显示：随着睾丸发育，生精小管管径增大，生精细胞种类、数量增多；支持细胞发育完善，体积增大，但轮廓不明显；睾丸间质细胞逐渐发育成熟，胶原纤维广泛分布于生精小管固有层基膜和睾丸间质中。免疫荧光染色观察可见：在1月龄、2月龄山羊睾丸中，α-SMA在管周肌样细胞、小动脉血管管周平滑肌细胞中表达阳性，在支持细胞、各级生精细胞、睾丸间质细胞中无表达；在12月龄山羊睾丸中，α-SMA在管周肌样细胞、小动脉血管管周平滑肌细胞中表达阳性，在支持细胞、各级生精细胞、睾丸间质细胞中无表达。本试验为深入研究睾丸的生理功能提供了基础形态学依据。     

仔猪睾丸组织体外培养方法的建立

以30日龄仔猪睾丸组织块为培养对象,应用飞利普TECNAI10电子显微镜对培养前后的生精细胞类别进行了观察,对培养后的组织块进行生精细胞分化程度鉴定,建立了仔猪睾丸组织生精细胞爬片体外培养模型.培养前后电镜观察及HE染色结果显示,培养前细胞种类主要有2种：支持细胞和精原细胞,有少数几个初级精母细胞;培养第20 d的睾丸组织块HE染色观察到3个精子细胞,电镜观察到2个精子细胞.证实,在没有添加睾酮的情况下,此培养体系能够提供睾丸组织块生精细胞分化所需要的条件,使非精子细胞类生精细胞减数分裂为精子细胞.     

Oct4在山羊睾丸组织中的表达与定位

探讨不同时期山羊睾丸组织中干细胞的分布和特点,以45 d和75 d山羊胎儿及出生后4月龄山羊睾丸为试验材料,进行了HE染色和Oct4抗体的免疫组化染色。结果显示,在45 d山羊胎儿睾丸组织中睾丸实质细胞聚集呈团状,形成岛屿状组织结构;发育到75 d山羊胎儿睾丸组织中睾丸的间质与实质组织结构差异明显,睾丸生精小管已经形成,生精小管管腔闭锁;出生后4月龄山羊睾丸组织结构明显,生精小管形态特征清晰,但管腔仍处于闭锁状态;Oct4免疫组织化学显示在45 d山羊胎儿睾丸组织中Oct4阳性细胞呈岛屿状分布,多见于生精小管前期的组成细胞;对于75 d山羊胎儿睾丸组织Oct4阳性细胞呈环状分布于生精小管中,睾丸间质组成细胞中则较少;在出生后4月龄山羊睾丸中阳性细胞主要分布于睾丸组织生精小管基底膜,沿基底膜环状分布。试验证实了在早期山羊睾丸组织中Oct4主要表达在生精前体细胞。     

睾丸支持细胞结构、功能及研究进展

在睾丸生精小管的上皮内存在生精细胞和支持细胞,支持细胞呈不规则形状,核细长,核仁大,表面积巨大.各级生精细胞处于支持细胞的包围中,随着生精细胞发育阶段的不同,睾丸支持细胞也发生相应的形态变化,以更好的维持生精细胞的发育.支持细胞参与血-睾屏障的形成,维持睾丸内的生精微环境;支持细胞分泌多种因子,它不但供给生精细胞营养,还可以为生精细胞提供免疫豁免的环境.近年来人们对睾丸支持细胞的形态结构和功能有了不断的了解.现就支持细胞的功能和研究进展进行综述.     

CREM在体外共培养山羊睾丸生精细胞中的定位研究

为进一步深入研究CREM基因在雄性动物中的表达调控机制,试验成功建立体外生精细胞和支持细胞共培养体系,并应用免疫细胞化学研究CREM在体外培养山羊睾丸生精细胞的表达特点。结果显示:CREM仅表达于圆形精子细胞,其他生精细胞和支持细胞检测不到CREM的表达。表明CREM基因在圆形精子细胞发育过程中起重要调节作用,但其作用机制有待深入研究。     

PHGPx在体外共培养山羊睾丸生精细胞中的定位研究

为探讨磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶(PHGPx)在雄性动物生殖机能中的作用及其在体外培养山羊睾丸生精细胞的定位,在已成功构建的山羊睾丸支持细胞-生精细胞共培养的基础上,制作细胞爬片,采用免疫细胞化学技术定位PHGPx的表达。结果显示,PHGPx在支持细胞、精原细胞中不表达,在圆形精子细胞细胞质检测到阳性表达产物。表明PHGPx在精子发生后期圆形精子的变态发育中起特定的调节作用,但作用机制有待深入研究。     

鸡胚睾丸支持细胞的传代培养与鉴定

以孵化18d的广西土鸡鸡胚为实验材料,采用两步酶消化法分离鸡胚睾丸支持细胞,置于37℃、5％C02的培养箱中培养,用低渗的磷酸缓冲液（PBS）处理进行纯化,并对原代和传代支持细胞进行了鉴定。结果显示,睾丸支持细胞生长良好,已传至第4代;经低渗处理,可去除绝大部分的生精细胞,获得的支持细胞纯度可达95％;鉴定结果显示,支持细胞为碱性磷酸酶（AKP）阴性;油红O染色显示,支持细胞胞质内舍有大量的脂肪滴,核内有双极小体;丫啶橙染色证明支持细胞的细胞质中富含RNA,细胞核内的DNA含量也较高;罗丹明123染色证明支持细胞含有丰富的线粒体。结论：经两步酶消化法以及低渗处理后能得到纯度较高的鸡胚睾丸支持细胞;37℃、5％CO2的培养条件适宜支持细胞的生长;AKP染色、油红O、丫啶橙和罗丹明123等方法简单易行,适用于鸡胚睾丸支持细胞的鉴定。     

小鼠生精细胞的分离和体外培养

为了建立一种操作性强、稳定、高效的小鼠生精细胞体外培养体系,从10只8周龄成年雄性健康清洁级昆明小鼠睾丸组织分离出细胞得到混悬液,采用支持细胞和生精细胞共培养方式,通过添加多种细胞培养液,以维持细胞的生长和增殖。结果表明:采用睾丸生精细胞、支持细胞共同培养的方式可得到密度较大的生精细胞,且精原细胞、精母细胞的数量占绝大多数。     

野外采集牦牛睾丸组织的冷冻保存及其生精细胞的复苏培养研究

采用玻璃化冷冻方法对野外采集的牦牛睾丸组织进行冷冻,通过HE(hematoxylin-eosin)染色分析发现玻璃化冷冻后的牦牛睾丸组织曲细精管结构保存较完好,曲细精管可见大量形态完好的各类生精细胞。采用台盼蓝染色检测细胞活率,发现冷冻复苏后细胞活率可达80.20%。分别通过生精细胞和精原干细胞标志蛋白DDX4和GFRA1免疫荧光染色发现复苏后培养14天后的生精细胞和精原干细胞的数量明显减少。通过RT-qPCR对复苏后不同实验处理组牦牛睾丸细胞标志基因的表达分析,发现培养30天的生精细胞中的精原干细胞标志基因Thy1和UCHL1的表达量显著增高。因此,玻璃化冷冻保存的牦牛睾丸组织中曲细精管及其生精细胞得到了较好的保护,该方法对于其他哺乳动物生精细胞的长久有效保存具有重要的参考价值。     

羔羊睾丸支持细胞发育的组织学观察

为研究羔羊睾丸支持细胞发育过程中的形态学变化,本实验以湖羊1-5月龄的羔羊睾丸为材料,采用常规石蜡包埋、组织切片技术,应用Olympus DP71显微镜照相系统和DP Control软件拍照获取图像,观察了睾丸支持细胞、生精细胞的的形态学变化,利用显微测微系统测量了支持细胞大小、数量、生精小管管径以及面积变化。结果表明:性成熟前羔羊睾丸的解剖特征参数总体表现出左侧大于右侧;随着羔羊睾丸的发育,支持细胞的结构更加清晰完整,细胞体积逐渐增大,生精小管管径、睾丸支持细胞和生精细胞的数目都有增加,并没有在生精小管中发现圆形精子。性成熟之前,羔羊睾丸支持细胞的快速增长主要表现在生精小管直径显著性增大,随着羔羊睾丸生长发育,支持细胞的增殖能力增强,并对生精细胞的发育有一定的影响,本研究可为进一步研究不同季节及不同发情时期滩羊睾丸发育特征提供参考。     

Bcl-2基因与睾丸生精细胞凋亡

Bcl-2基因是参与睾丸生精细胞凋亡的重要基因之一,文章从睾丸生精细胞凋亡特点、Bcl-2基因研究进展及如何影响睾丸生精细胞凋亡等方面详细论述了Bcl-2基因在睾丸生精细胞凋亡中所起的重要作用.     

牦牛与犏牛睾丸支持细胞分离培养及生物学特性比较分析

旨在建立牦牛与犏牛睾丸支持细胞分离培养及鉴定方案,比较两种牛睾丸支持细胞的生物学特性。本研究分别采集24月龄的3头健康公牦牛与3头F1代公犏牛睾丸组织作为2个样品组,其中每组3个生物学重复,分别通过混合酶消化、差速贴壁和饥饿处理分离得到两种牛的睾丸支持细胞,采用DMEM高糖及DMEM/F12培养基培养睾丸支持细胞,筛选更佳的培养体系。采用碱性磷酸酶染色、油红O染色和免疫荧光染色鉴定细胞表型特征,利用CCK8和RT-qPCR法分别检测细胞的增殖活性和标志功能基因的表达,进一步通过不同浓度丝裂霉素C处理两类支持细胞来评价两牛种支持细胞的耐受性及其作为饲养层细胞的潜能。结果,经形态、特殊染色及标志基因表达鉴定,成功分离到牦牛与犏牛睾丸支持细胞,建立了牦牛与犏牛睾丸支持细胞体外长期培养方案。发现DMEM高糖培养基更适用于睾丸支持细胞的增殖,两牛种支持细胞形态相似、轮廓清晰、呈现多边形或长梭形,牦牛睾丸支持细胞的体外增殖速率及活性远高于犏牛。调节精原细胞增殖分化相关基因（胶质细胞源性神经营养因子（glial cell line derived neurotrophic factor,GDNF）和转化生长因子β1基因（transforming growth factor-β1,TGF-β1））的表达在犏牛支持细胞中分别下调了3.4与2.9倍（P<0.05）,基质细胞源性因子12基因（stromal cell-derived factor 12,CXCL12）的表达在犏牛上调了3.6倍（P<0.05）;调节睾丸发育的SRY-盒包含蛋白9基因（sex determining region Y-box9,SOX9）和睾丸支持细胞特异表达的Wilm肿瘤基因1（Wilms tumor gene1,WT1）在犏牛支持细胞中的表达分别下调了25.9（P<0.01）与38.7倍（P<0.01）。与牦牛相比,犏牛睾丸支持细胞对于丝裂霉素C具有较差的耐受性,表现为细胞核质分界不清、胞质空泡化严重和悬浮死细胞增多。本研究成功建立了牦牛与犏牛睾丸支持细胞分离纯化与体外培养方案;与牦牛相比,犏牛睾丸支持细胞在增殖活性和睾丸生精细胞分化关键功能基因表达等方面均存在缺陷,这可能也是导致犏牛雄性不育的原因之一。     

成年犬睾丸支持细胞体外分离培养的研究

为了研究犬睾丸支持细胞体外生长和生物学特征,试验采用组织培养法和酶消化法分离该细胞,并通过H.E.染色、油红O染色和AKP染色对细胞进行鉴定。结果表明:组织培养法和酶消化法均获得了成年犬睾丸支持细胞,细胞增殖活力旺盛;H.E.染色可见睾丸支持细胞呈长梭形或不规则的多边形,有3~4个突起,胞质呈浅红色;油红O染色可见支持细胞的胞质中存在脂滴,被染成桔红色,而细胞核不着色。将支持细胞与生殖细胞共培养,精原干细胞可以贴附于支持细胞表面进行体外增殖,而难以直接贴于皿底生长。AKP染色可见精原干细胞呈AKP阳性,而支持细胞呈阴性。说明成年犬支持细胞可以在体外进行培养,具有其他物种支持细胞共有的一些生物学特征。     

冷冻保存新生牛睾丸组织中支持细胞的分离纯化

睾丸支持细胞(sertoli cells,SCs)是生精上皮中的多功能体细胞,其分离培养对体外探讨精子发生机理至关重要。因牛新鲜睾丸组织取材不便,本试验在前期基础上探讨了从冷冻保存的新生牛睾丸组织中分离纯化SCs的可行性。将冻存的1日龄牛睾丸组织复苏,进行形态学检查和SCs分离培养。石蜡切片苏木精-伊红(HE)染色显示,曲细精索及睾丸间质保存完好。二步酶消化结果显示,生精上皮解离良好。利用差异贴壁法将原代细胞纯化后扩大培养,绝大多数细胞呈不规则多边形,3d即可生长至汇合。RT-PCR分析显示,贴壁细胞表达SCs阳性分子标记胶质细胞源神经营养因子(GDNF)和雄性激素结合蛋白(ABP)而不表达精原细胞分子标记PLZF。流式细胞术检测显示,所获细胞中ABP和GDNF阳性细胞数分别为99.7%和99.8%。以上结果表明,从冻存的新生牛睾丸组织中可获高纯度的SCs。本试验结果为后续相关试验奠定了基础。     

二乙基己烯雌酚对成年仓鼠睾丸一氧化氮生成和生精细胞凋亡的影响

探讨了在二乙基己烯雌酚（DES）诱发成年动物生精细胞凋亡过程中睾丸一氧化氮（NO）生成和生精细胞一氧化氮合酶（eNOS和iNOs）表达的变化，以期为阐明DES诱发生精细胞凋亡机理的研究提供基础资料。成年雄性仓鼠皮下注射不同剂量DES（分别为0．01、0．1和1mg／kg体重），连续注射7d后取其睾丸，进行NO含量的测定和eNOS、iNOS免疫组化染色。电镜观察生精细胞超微结构的变化，并用TUNEL法检测睾丸中生精细胞凋亡的变化，苏丹Ⅲ染色法检测睾丸生精小管内脂滴分布的变化。结果显示：NO的生成与DES呈剂量依赖性。DES处理后，在1mg／kg体重剂量组，大量生精细胞表达eNOS和iNOS，并出现大量凋亡，退化的生精细胞胞浆内有大量髓样结构，并有大量脂滴分布于生精细胞内和细胞间。eNOS和iNOS阳性生精细胞与凋亡的生精细胞数量和类型基本一致，主要为精母细胞和圆形精子细胞。     

线粒体凋亡途径在锰致鸡支持-生精细胞凋亡中的作用

探讨线粒体凋亡途径在锰致鸡支持-生精细胞凋亡中的作用。取对数生长期鸡支持-生精细胞,用含0、2、3、4mmol.L-1MnCl2的DMEM培养液,培养24h,采用吖啶橙-溴化乙锭(AO/EB)双荧光染色法检测鸡支持-生精细胞凋亡,流式细胞仪检测线粒体膜电位(△ψm),Westernblot法检测胞浆内细胞色素C(Cytc)蛋白表达含量,分光光度法检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9,3(Caspase-9,3)活性。用含MnCl2的DMEM培养液培养24h后,处理组细胞与对照组相比,鸡支持-生精细胞凋亡指数逐渐升高(P0.01);线粒体膜电位显著降低(P0.01);胞浆中Cytc蛋白表达量逐渐增加;Caspase-9,3活性逐渐升高(P0.01)。线粒体途径介导的凋亡是锰对鸡生殖毒性作用的主要机制之一。     

成年牛睾丸组织体外无血清培养研究

为研究促进精子发生的体外培养体系,通过无血清睾丸组织培养法,将成年牛睾丸组织块种植于培养板, 观测不同时间睾丸细胞的迁出和形态变化。通过油红O染色鉴定具有分泌功能的支持细胞,通过碱性磷酸酶和免疫组化染色鉴定集落样生长的精原干细胞。结果发现该体系可获得生长良好的多种类型细胞,包括表达AP、Oct-4和GFRα1的精原干细胞及具有分泌功能的睾丸支持细胞,并可获得大量精子。说明,该无血清培养体系可作为一个重要的工具来研究生物学和化学因素对雄性生殖系统的影响,也为研究精子体外发生和移植提供了材料。     

牛生精母细胞/精原干细胞分子标记GFRα-1的验证

生精母细胞(gonocytes)是幼龄雄性曲细精索中的未分化生殖细胞,随睾丸发育逐渐向生精上皮基膜迁移并发育为精原干细胞(spermatogonial stem cells, SSCs)。生精母细胞和SSCs的分离培养对体外探讨精子发生机理至关重要,而其特异分子标记验证又是分离培养的关键环节。胶质细胞源神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor, GDNF)能促进生精母细胞和SSCs的增殖,用GDNF家族受体α-1(GDNF family receptor alpha-1,GFRα-1)标记生精母细胞和SSCs已在啮齿类等动物得到证实,但在牛等大家畜则仍需验证。为此,本研究将冻存的新生牛睾丸组织复苏,从转录和蛋白水平对GFRα-1的表达进行了验证。荧光定量PCR分析显示,犊牛生精上皮表达多能性基因Nanog和较高水平的GFRα-1 mRNA;免疫荧光染色显示,曲细精索中的大圆形细胞表现为GFRα-1阳性,其定位和分布与苏木精-伊红染色显示的生精母细胞一致;分离培养后,这些细胞表现为生精细胞典型的团簇状形态,仍为GFRα-1和Na...     

疏肝益阳胶囊对炔雌醚诱导大鼠生精紊乱和氧化应激的缓解作用

笔者拟探讨疏肝益阳胶囊(SGYY)对炔雌醚(QES)诱导大鼠生精紊乱和氧化应激的缓解作用及机制。将20只8周龄雄性SD大鼠随机分为4组,适应饲养1周后,进行药物灌胃处理,对照组:0.1mL生理盐水+0.1mL橄榄油;SGYY组:100 mg·kg-1 SGYY;QES组:0.1 mg·kg-1 QES;QES+SGYY组:0.1 mg·kg-1 QES+100mg·kg-1 SGYY。QES溶于橄榄油;SGYY溶于生理盐水;每天1次,连续2周。处理结束后,取睾丸、附睾、精囊腺和前列腺称重、测量长径与短径,并制备睾丸组织切片,通过HE染色,观察睾丸生精小管组织结构、生精细胞比例的变化;通过免疫组织化学方法检测睾丸生精细胞PCNA表达,Tunel法检测细胞凋亡;分离血浆,检测睾酮含量变化。取睾丸匀浆检测抗氧化酶活性。结果显示,QES处理后大鼠生殖器官的质量显著下降,附睾的精子数量显著减少;生精小管的面积、直径、生精上皮的高度和生精细胞数量均显著减少。而且,生精细胞的PCNA表达和血浆睾酮含量明显下降,Tunel阳性细胞数明显增加。睾丸SOD、GSH-Px和T-AOC活性显著下降,MDA含量显著升高。SGYY增加生殖器官质量、精子数量、睾丸睾酮含量、增殖的生精细胞数量和抗氧化酶活性,降低了MDA含量和Tunel的表达。结果表明,SGYY通过改善抗氧化功能、抑制氧化应激及促进睾酮分泌等途径增加了生精细胞数量并提高睾丸的生精功能。     

蒙古马睾丸支持细胞的体外分离培养与鉴定

为研究一种简单快速分离蒙古马睾丸支持细胞并保证其活性的基本方法,本试验采集2岁蒙古马睾丸组织于低温环境下进行机械分离,将1~3 g睾丸组织剪碎,采用重力沉淀法去除游离的红细胞和间质细胞;使用0.1%胶原酶Ⅳ和0.25%胰蛋白酶+EDTA逐步进行组织消化,并用含有10%胎牛血清的培养基进行细胞培养;在接种后采用差异贴壁法分离纯化支持细胞,使用Tris-HCl低渗法去除杂质细胞,并采用碱性磷酸酶（AKP）染色、HE染色、实时荧光定量PCR方法进行鉴定。结果显示,支持细胞贴壁性能较强,培养24 h后大多数细胞开始贴壁,细胞形状呈椭圆形;培养48 h后胞质增多,折光性变强;培养3~4 d细胞胞质展开紧密连接,此时细胞呈三角形,有明显的核仁,培养6~7 d细胞生长状态进入稳定期。实时荧光定量PCR结果显示,GATA4和GDNF基因在培养细胞中极显著表达（P<0.01）,AKP染色支持细胞呈阴性表达,表明分离培养的细胞确为支持细胞。本试验使用机械分离法与两步酶消化法处理组织,可快速高效地获得睾丸支持细胞,成功构建了蒙古马睾丸支持细胞体外培养方法。