砂梨果实ACC氧化酶cDNA克隆及其反义表达载体构建

利用RT-PCR和RACE技术从'早生新水'砂梨成熟果实cDNA中克隆出ACC氧化酶基因保守片段及其5'和3'端,拼接后获得砂梨果实ACC氧化酶cDNA全长。该cDNA全长1 225 bp,将其命名为Pyp-ACO,GenBank登录号为EF451060。Pyp-ACO核苷酸序列有一个945 bp的开放读码框,5'端非翻译区为63 bp,3'端非翻译区为217 bp,与西洋梨和苹果的编码区核苷酸序列有较高的相似性,分别为98.3%和98.1%。Pyp-ACO推导编码314个氨基酸,该序列具备非血红素二价铁离子依赖型的氧化/加氧酶类的12个保守氨基酸和催化活性所需的3个氨基酸。将Pyp-ACO编码区序列反向插入pYPX145载体,构建了由双35S启动子所控制的双元表达载体,同时已成功将表达载体导入根癌农杆菌菌株LBA4404,为耐贮藏转基因梨选育奠定了基础。     

牡丹ACC氧化酶基因的克隆与反义载体的构建

根据报道的牡丹ACC氧化酶基因(DQ337251)cDNA序列,设计一对特异引物,以牡丹品种"洛阳红"基因组DNA为模板,用PCR扩增方法克隆出牡丹ACC氧化酶基因的部分片段,并将其连接到pMD18-T载体上进行测序.结果表明,克隆的序列全长为467 bp,其中包括一个长度为157 bp的序列,推测它可能是一个内含子,其它序列与已报道序列同源性为98.2%;用SacⅠ和XbaⅠ对重组质粒和载体pBI 121酶切、连接,构建牡丹ACC氧化酶基因的反义表达载体.     

桃ACC氧化酶基因的克隆和植物表达载体的构建

以‘玉露’桃叶片基因组ＤＮＡ为模板,用ＡＣＣ氧化酶基因特异寡聚核苷酸为引物进行ＰＣＲ扩增,得到１．３ｋｂ左右的扩增产物,将其克隆到ｐＵＣ１９加Ｔ载体上,组建亚克隆并进行序列测定,结果表明,该基因全长有１２８８个碱基,由４个外显子和３个内含子组成。外显子由９５７碱基组成,编码３１９个氨基酸。该基因与桃、番茄、矮牵牛、康乃馨、苹果ＡＣＣ氧化酶ｃＤＮＡ氨基酸序列同源性分别为９９．３％,８３．０％,７６．８％,７４．０％,７５．０％。ＲＮＡ点杂交表明,该基因在未成熟果实检测不到杂交信号,随着成熟度增加,硬度下降,基因表达增强。将ＡＣＣ氧化酶基因分别正向和反向克隆到植物表达载体ｐＢＩ１２１中,并通过酶切分析,ＰＣＲ和点杂交鉴定重组质粒正确。将重组表达质粒导入根癌农杆菌中,经ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交鉴定证实质粒已被导入。     

草菇开伞相关基因反义表达载体构建

以质粒pCAMBIA1301和pBI121为基础构建草菇表达载体pCB。把已克隆的草菇开伞相关基因DNA片段正反向插入pCB,获得pCB—opn15和pCB—opn39,经测序证实,pCB—opn15为正向插入,pCB—opn39为反向插入。     

梨品种中矮1号GA20-氧化酶基因正义和反义表达载体的构建

通过对已获得的中矮1号GA20-氧化酶基因的cDNA序列全长进行分析,选取Spe I/Bst EⅡ双酶切位点、以pCAMBIA1305为载体构建质粒。成功构建了GA20-氧化酶基因的植物正义和反义表达载体pCAMBIA1305-GAF和pCAMBIA1305-GAR,并成功转入到了农杆菌EHA105菌株中;为GA20-氧化酶基因的遗传转化和梨品种中矮1号矮化机理研究奠定了基础。     

果实特异启动子调控薄皮甜瓜ACC合成酶cDNA反义表达载体的构建

应用反义RNA技术抑制甜瓜成熟过程中内源乙烯的合成,从而培育耐贮运品种是解决甜瓜延熟保鲜难题的可行新方法。根据GenBank中甜瓜、黄瓜ACC合成酶基因氨基酸保守序列设计引物,从成熟的薄皮甜瓜(齐甜1号)果肉组织中提取总RNA,经RT-PCR扩增得到约0.7kb的ACC合成酶cDNA片段,将其克隆到质粒载体pGEM-TEasy中,测序表明,该基因为777bp,编码258个氨基酸;从番茄(东农706)叶片组织中提取总DNA,经PCR扩增得到约2.2kb的E8基因片段,将其克隆到质粒载体pGEM-TEasy中,测序表明,该基因为2192bp;以pCAM2301为起始植物表达载体,pCAM-GT为中间载体,成功构建了果实特异启动子(E8)调控薄皮甜瓜ACC合成酶cDNA反义表达载体,采用冻融法将其转入根癌农杆菌LBA4404,得到了完整的Ti质粒表达载体系统。     

冬枣两个ACC氧化酶基因的cDNA克隆及其表达模式

 根据植物ACC氧化酶（ACO）家族的氨基酸和核苷酸保守区序列设计简并引物,采用3′RACE技术从半红期冬枣果实中分离了两个ACO同源基因片段,随后通过PCR技术进一步获得了两个包含完整开放阅读框（ORF）及3′端非编码区（UTR）序列的ACO基因的cDNA,即ZjACO1和ZjACO2。两个基因序列在GenBank中的登录号为EU216549和EU216550,其大小分别为1 115 bp和1 105 bp,编码蛋白大小分别为319个和321个氨基酸。ZjACO1和ZjACO2在核苷酸和氨基酸水平上的同源性分别为79.4%和84.0%。Northern杂交结果表明,这两个基因在冬枣叶片中不表达,而在不同发育阶段果实中的表达具有明显差异。     

矮牵牛ACS2基因的克隆及反义重复表达载体的构建

利用降落PCR的方法,从矮牵牛DNA中扩增出ACS2基因片段,在GenBank中获得基因序列号为DQ090003;利用一步法将ACS2基因的反义重复与pBI-121质粒连接,构建含该基因的反义重复表达载体.     

梨ACC氧化酶基因(ACO)的片段克隆及其RNAi载体构建

以若光梨成熟果实为材料,提取总RNA,在ACC氧化酶基因(ACO)cDNA序列同源性较高区域设计一对特异引物,利用RT-PCR克隆了ACC氧化酶(ACO)基因片段。将ACO反义基因、与副球菌中类胡罗卜素合成有关的间隔基因YYT和ACO正义基因3个片段串联在一起,经鉴定后,插入到植物表达载体中,构建成能够表达ACC氧化酶基因的双链RNA的植物载体pYF028,为耐贮砂梨的遗传转化创造条件。     

甜瓜ACC氧化酶反义基因植物表达载体的构建及对烟草的转化

应用反义基因技术抑制水果成熟过程中内源乙烯的合成,从而培育耐贮运品种是解决水果延熟保鲜难题的可行新方法。一个来自甜瓜的ACC氧化酶cDNA全序列被反向插入到植物表达载体pBI121中,从而构建了甜瓜ACC氧化酶反义基因植物表达载体。用该反义基因载体转化烟草获得转基因植株,并且转基因在转化植株的自交子代中发生孟德尔分离,由此验证了该载体构建的成功和可用性。此项研究为下一阶段用该反义基因载体转化甜瓜栽培品种做了充分必要准备。     

康乃馨ACC氧化酶反义基因遗传转化康乃馨的研究

 在建立康乃馨从愈伤组织到完整植株的高频再生体系的基础上，用花特异表达启动子驱动的康乃馨ACC氧化酶反义基因通过农杆菌介导法对康乃馨进行遗传转化，获得了3株转基因植株．经多重PCR及PCR-Southem杂交检测，证实康乃馨ACC氧化酶的反义基因已整合进康乃馨的基因组中。     

反义ACO 基因导入获得瓶插寿命长的香石竹植株

 通过农杆菌( Agrobacterium tumefaciens) 介导法, 利用香石竹叶片作外植体, 将反义香石竹ACC 氧化酶基因导入香石竹‘黄星’品种, 通过PCR 扩增、Southern blot 检测, 证明反义ACC 氧化酶基因已整合到香石竹基因组。研究发现, 叶龄、乙酰丁香酮等对转化率有着较大影响。通过叶片的两度选择分化, 大大减少了转化嵌合体比例。转基因植株在隔离条件下栽培, 开花正常, 切花在25 ℃条件下瓶插寿命较对照延长了4 d。     

中国水仙NtPLATZ1正、反义植物表达载体构建及转化烟草的研究

通过构建中国水仙锌指蛋白基因NtPLATZ1正义和反义两种植物表达载体,并用冻融法将其导入农杆菌EHA105菌株,介导遗传转化烟草,对遗传转化的烟草再生植株进行PCR-Southernblot和RT-PCR检测,研究NtPLATZ1的功能。结果表明成功将NtPLATZ1转化烟草,获得5株阳性转基因植株。NtPLATZ1在转基因烟草中过表达能抑制烟草的生长,抑制表达可促进烟草生长。     

节瓜ACC 合酶基因CqACS 的克隆与表达分析

为分析ACC 合酶与节瓜雌性之间的关系，以雌性自交系（A36）和普通雌雄同株自交系（SX）为材料，克隆得 到节瓜ACC 合酶（CqACS）基因，并与葫芦科中已知的ACC 合酶基因进行同源序列比对分析、构建进化树；对A36 幼苗 叶片进行赤霉素（GA3）处理后用qRT-PCR 对CqACS 基因进行表达分析，并统计赤霉素处理前后20 节内的雌花率。结果 表明，CqACS 基因在雌性自交系A36 中的长度为1 318 bp，普通雌雄同株自交系SX 中长度为1 637 bp。经对比分析，SX 比A36 多了91、97、117 bp 3 个片段，除此之外只有2 个碱基的差别。同源序列比对发现，A36 中的CqACS 基因与西瓜中 的Cit-ACS1 基因同源性最高，为95.31%，与黄瓜中的Cs-ACS1 基因同源性为91.13%；SX 中的CqACS 基因与西瓜中Cit- ACS1 基因同源性为78.04%，与黄瓜中的Cs-ACS1 基因同源性为76.06%。GA3 处理后，A36 的平均雌花节率（20 节位内） 为45%，而对照为90%；qRT-PCR 分析发现，与对照相比，CqACS 基因在GA3 处理后的相对表达量显著上调，且在第3 次 处理后4 h 上调最大。     

结球甘蓝春化相关基因VIN3反义植物表达载体构建及转化

以pBI121植物表达载体和BoVIN3-1基因片段为基础,构建结球甘蓝春化相关基因VIN3反义植物表达载体。将BoVIN3-1基因片段反向插入355启动子与GUS基因之间的限制性酶切位点XbaⅠ和SmaⅠ中,构建含反义BoVIN3-1基因的工程质粒pBI35S-BoVIN3-1。通过花蕾微量注射法转化结球甘蓝,获得9株转化植株。PCR检测结果表明,其中5株为阳性植株,阳性株率55.6%。经春化处理的转反义基因植株与对照相比,春化一定程度被推迟。半定量RT-PCR检测结果表明,转化植株在进行低温处理后仍有该基因少量表达,并随春化处理时间的延长转录水平升高,在第50天时表达量达到最高。     

拟南芥AtHEMA1基因的克隆及其表达载体的构建

为探究AtHEMA1基因转化植物后对叶绿素合成机制的影响,本实验设计特异引物,以拟南芥基因组DNA为模板,采用PrimStar HS DNA聚合酶扩增AtHEMA1基因。将AtHEMA1基因克隆至载体pVCT2101,获得植物表达载体pVCT2298。     

香蕉ACC氧化酶基因(MAO3)的克隆及其表达特性分析

 根据同源扩增得到香蕉(Musa acuminata) ACC氧化酶基因(MAO3) 的核心部分, 再通过3'和5'RACE扩增上、下游序列以及Genome-Walker的方法得到启动子部分, 共获得3 718 bp长度的序列。将所得结果进行聚类分析, 发现香蕉中ACC氧化酶的氨基酸序列非常保守, 各序列间的同一性高达99% ,与单子叶植物和双子叶植物中ACC氧化酶的氨基酸序列的同源性在66.7%～71.8%之间。组织原位杂交试验表明MAO3基因的表达具有组织特异性, 初步认为是在韧皮部筛管组织中特异表达。运用实时荧光定量PCR技术, 实时监测到了MAO3基因和香蕉乙烯受体基因ERS2受机械伤诱导的定量变化。