猪大肠埃希菌菌种保存条件筛选

以陕西部分地区分离的强致病性大肠埃希菌02、08、0135、0139、0141为研发菌种,通过菌种在不同的保存方法、温度、时间下保存后细菌的形态、存活率、菌落形态及对小鼠致病性的观察,最终确定了以含150mL／L牛奶蔗糖为保护剂的菌种,以冻干的方法于-20℃保存2年,以150mL／L甘油保护剂的菌种,于-20℃保存1年,两种保存方式和4℃可保存90d。     

禽大肠埃希氏菌融合菌株疫苗的研制及应用

对从陕西省主要养鸡地区病死鸡分离的禽致病性大肠埃希氏菌进行Omp分型，用不同Omp型的菌株构建成融合菌株。用融合菌株制作铝胶灭活疫苗，与单价疫苗和两亲本菌株双价疫苗的免疫保护效果进行比较。结果表明，融合菌株疫苗可对多种O血清型致病性大肠埃希氏菌的攻毒试验产生坚强的保护，保护率高达93％～100％，而O血清型单价疫苗的保护率仅67％～80％，双价疫苗的保护率仅80％。在生产中对蛋用鸡的应用结果表明，融合菌株疫苗可明显降低鸡的死淘率。     

猪致病性大肠埃希菌外膜蛋白亚单位疫苗免疫效果观察

用超声波破碎并采用N-十二烷基肌氨酸钠进行猪致病性大肠埃希菌外膜蛋白提取,提取物经SDS-PAGE电泳检测后制备成疫苗,以肌肉注射方式免疫SPF小鼠,于免疫前及免疫后每隔1周分别收集血清.以间接ELISA的方法检测血清中IgG抗体水平,同时用不同血清型大肠埃希菌菌株与免疫血清做玻板凝集试验和攻毒保护试验.结果表明,在免疫小鼠后的第28天左右机体内的抗体水平达到最高值,免疫血清能够与不同菌株发生凝集反应且不同菌株对小鼠的攻毒都具有免疫保护力,说明外膜蛋白不仅具有一定的免疫原性而且对不同菌株具有交叉免疫保护力,因此外膜蛋白亚单位疫苗作为一种新型疫苗可望适用于防控猪大肠杆菌病.     

猪大肠埃希氏菌多价油乳剂灭活苗的研制

用从北京地区几家规模化猪场腹泻仔猪分离鉴定的大肠埃希氏O60、O141、0139、09和064制成多价油乳剂灭活苗，以0.2mL/只剂量免疫小白鼠，分别于免疫后7、14、30和60d攻毒，结果免疫14d后可获得100%保护；用该多价油乳剂灭活苗分别在母猪产前40d和15d肌肉注射2mL，对免疫母猪所产仔猪的保护率达95.0%以上。     

鸡大肠埃希氏菌制苗菌株的生物学特性研究

对制苗用鸡大肠埃希氏菌O1、O2、O78标准株的培养特性、免疫原性、菌株毒力及保存代次进行了研究。结果表明，3株标准菌在麦康凯琼脂、普通肉汤及鸡裂解血液马丁肉汤琼脂上生长良好，培养后的3株菌均符合鸡大肠埃希氏菌生化特性；用固体培养基培养后的菌液制成蜂胶灭活疫苗，免疫30日龄雏鸡，1－2周后产生保护力，3周攻毒时保护率为100％，对同型异株（湖北地方分离株）的攻击保护率在80％以上；3株菌都能使重20g小白鼠死亡、4日龄雏鸡死亡，剖解死亡雏鸡，均呈典型大肠杆菌病病理变化；连续传5－10代的3株菌，其毒力明显减弱。     

鸡大肠埃希氏菌地方菌株的致病性与药敏试验

分别从死亡鸡胚、病死鸡中分离大肠埃希氏菌，进行致病性与药敏试验，并鉴定致病性较强的菌株的血清型。结果表明，所分离的菌株绝大多数对一日龄鸡有致病性，所有血清型对头孢唑啉高度敏感。     

马齿苋对猪大肠埃希菌抑菌作用观察

按常规方法制备马齿苋水提取物,以试管二倍稀释法测定马齿苋水提取物对猪大肠埃希菌的体外最小抑菌浓度;以小鼠为试验动物,观察马齿苋对猪大肠埃希菌体内抗菌作用。结果显示,马齿苋对猪大肠埃希菌有较好的体外抑制作用,最小抑菌浓度为0.25g/mL;小鼠体内抗菌作用提示,马齿苋在小剂量时对猪大肠埃希菌无抗菌作用,增大药物剂量其本身的毒副作用会致死小鼠。     

猪大肠埃希菌高密度发酵条件的试验研究

利用5 L发酵罐分批培养O2、O8、O135、O138、O139、O141血清型组成的猪大肠埃希菌菌液,通过活菌计数的方法,对大肠埃希菌在发酵过程中温度、pH、通气量、葡萄糖加量等基本条件进行试验研究.结果表明,在用发酵罐进行大肠埃希菌多个血清型的高密度发酵时,利用常规的干粉培养基,将培养温度控制在37℃±0.5℃,pH控制在7.0～7.2,逐渐增大通气量,根据pH的变化补加40%的葡萄耱,可以使细菌的培养菌数(cfu)达到150亿/mL以上.     

大肠杆菌肠毒素ST1—LTB融合蛋白工程菌株的免疫原性研究

已构建的能表达大肠杆菌肠毒素ＳＴ１ＬＴＢ融合蛋白的工程菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＸＥＴＳＬＴ１）及其表达产物经动物试验证实没有毒性反应。用从ＩＰＴＧ诱导的工程菌中提取的包涵体或经甲醛灭活的工程菌制成抗原,免疫小鼠,结果免疫小鼠至少能抵抗１５ＭＬＤ的大肠杆菌强毒株Ｃ８３９０２（Ｋ８８ａｃ,ＳＴ＋,ＬＴ＋）的攻击。用提取的包涵体免疫家兔后,采集的血清能够中和天然ＳＴ１的毒性。这表明构建的工程菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＸＥＴＳＬＴ１）可以作为预防幼畜大肠杆菌性腹泻基因工程菌苗的候选株。     

大肠杆菌EL—1株免疫原性的研究

采用热裂解和甲醛灭活方法处理由亚成年大熊猫体内分离的大肠杆菌EL-1 株,制备免疫原免疫家兔。经检测发现,热裂解方法能增强大肠杆菌EL-1 株的免疫原性,提高免疫动物血清抗体效价,促进中性粒细胞的吞噬功能。     

某规模化猪场大肠埃希菌O141的分离鉴定及药敏试验

从河北衡水某规模化猪场21日龄发病仔猪脾脏中分离到1株革兰氏阴性杆菌,通过菌落形态、培养特性和微量生化试验,鉴定为大肠埃希菌,应用大肠埃希菌O抗原定型血清鉴定为O141。该菌株对供试的14种抗菌药物均产生耐药性,其中多种常用抗菌药物对其完全没有抑制作用。动物致病性和毒素试验表明,该菌株在20 h内能够导致70%小鼠死亡,并产生热稳定肠毒素,为1株产肠毒素性大肠埃希菌。     

表达大肠杆菌K88ac-ST1-LTB融合蛋白工程菌株的免疫原性研究

已构建的能表达大肠杆菌K88ac-ST1-LTB融合蛋白的工程菌株BL21（DE3）（pXKST3LT5)及其表达产物经动物试验证实没有毒性反应。用从IPTG诱导的工程菌中提取的包涵体或经甲醛灭活的工程菌制成抗原，免疫小鼠，结果免疫小鼠至少能抵抗2MLD的大肠杆菌强毒株C83902（K88ac,ST^ ,L^ )的攻击，用提取的包涵体免疫家兔后，采集的血清能够中和天然ST1的毒性，这表明构建的工程菌株BL21（DE3）（pXKST3LT5)可以作为预防幼畜大肠杆菌性腹泻基因工程菌苗的候选株。     

致猪水肿病大肠埃希菌多重PCR检测方法的建立及应用

本研究旨在建立一种快速鉴定致猪水肿病大肠埃希菌的多重PCR检测方法.分别针对大肠埃希菌16S rDNA、志贺毒素Stx2e A亚基和菌毛F18ab A亚基保守序列设计合成3对特异性引物,优化多重PCR反应条件,并进行特异性和敏感性检测.结果显示,阳性对照菌株扩增产物大小分别为1 062、733和313 bp.特异性和灵敏性检测结果表明,与肠炎沙门菌、多杀性巴氏杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌、支气管败血波氏杆菌和猪链球菌等猪常见致病菌均无交叉反应;菌体直接扩增法最低检出量为1 875 CFU.利用建立的多重PCR检测方法对分离收集的128株大肠埃希菌进行鉴定,得到36株致猪水肿病大肠埃希菌,其中30株既有菌毛F18ab又产志贺毒素Stx2e,另外6株仅产志贺毒素Stx2e.结果表明,本试验所建立的多重PCR检测方法对致猪水肿病大肠埃希菌的快速诊断和流行病学调查具有一定的应用价值.     

表达大肠杆菌肠毒素ST1-LTB融合蛋白双价基因工程菌株的构建

重组菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＸＥＴＳＬＴ１）经ＩＰＴＧ诱导后,其表达产物经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和ＥＬＩＳＡ检测,结果表明重组菌株可以高效表达大肠杆菌肠毒素ＳＴ１－ＬＴＢ 融合蛋白,该融合蛋白占菌体总蛋白的３３．２１％ ,而且已失去天然ＳＴ１肠毒素生物毒性。用从ＩＰＴＧ 诱导的工程菌中提取的包涵体或经甲醛灭活的工程菌制成抗原免疫小鼠,结果免疫小鼠至少能抵抗１．５ＭＬＤ 的大肠杆菌强毒株Ｃ８３９０２（Ｋ８８ａｃ,ＳＴ＋ ,ＬＴ＋ ）的攻击。用提取的包涵体免疫家兔后,采集的血清能够中和天然ＳＴ１肠毒素的毒性。这表明构建的工程菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＸＥＴＳＬＴ１）可以作为预防幼畜大肠杆菌性腹泻基因工程菌苗的候选株     

无抗性表达致PWD和ED大肠杆菌保护性抗原基因的重组菌构建

利用平衡致死系统成功地将构建表达致PWD和ED大肠杆菌保护性抗原基因的重组菌BL21(pFSFaeG)中所含氨苄抗性基因敲除,并转化沙门氏菌宿主菌X4550。经过质粒酶切分析和表达产物的SDSPAGE证实,氨苄抗性基因已经成功敲除,并且目的蛋白仍与谷胱甘肽转移酶相融合,得到有效表达,重组融合蛋白的分子质量约为80ku。经体外连续传代试验,重组菌X4550(pFSFaeG)均能在无抗生素压力下大量扩增并稳定传代,质粒稳定性和蛋白表达稳定性良好。无抗性重组菌的成功构建解决了基因工程疫苗抗性基因潜在危险问题,并有望通过沙门氏菌载体的递送作用,为研制口服疫苗奠定了基础。     

表达产气荚膜梭菌α—β融合蛋白基因工程菌株的构建

用PCR从含产气荚膜俊菌α毒素基因的质粒pXETA1中护增出α毒素基因，用NcoI和BamHI双酶切该α毒素基因，回收0.95kb的α毒素基因片段，再用NcoI和BamHI双酶切含产气荚膜梭菌β毒素基因质粒pXETB2，与上述回收的α毒素基因片段连接，转化至受体菌BL21（DE3）中。经NcoI、BamHI、NotI酶切反应鉴定和核苷酸序列分析证实，获得了理想重组质粒pXCPAB2，该重组质粒含有α-β融合基因。重组菌株BL21（DE3）（pXCPAB2）经IPTG诱导后，其表达产物经ELISA检测和SDS-PAGE分析，结果表明重组菌株可以高效表达α-β融合蛋白，该融合蛋白占菌体总蛋白的22.14%。用从IPTG诱导的工程菌中提取的包涵体或经甲醛灭活的工程菌制成抗原免疫小鼠，免疫小鼠至少能抵抗2MLD的C型产气荚膜梭菌的攻击。这表明构建的工程菌株BL21（DE3）（pXCPAB2)可以作为预防仔猪红痢基因工程菌苗的候选株。     

融合表达猪源C3d与猪流感病毒HA DNA疫苗的构建

为了构建融合表达分子佐剂猪补体C3d与猪流感病毒血凝素(HA)的真核表达载体,论文克隆了猪C3d全长基因与H3N2亚型猪流感病毒的HA基因,并构建了包含3拷贝的C3d和经过改造的HA(替换信号肽并去除跨膜区)的质粒pHA-C3d3.序列分析表明,获得的猪C3d与参考序列相比核苷酸同源性达到99.7%,氨基酸同源性达99...     

猪致病性大肠杆菌的分离鉴定及耐药性分析

从湖北省襄樊地区7家猪场采集病料进行大肠杆菌分离培养,获得36株菌株。通过菌落和细菌形态学观察、生化试验和动物试验确定分离细菌为致病性大肠杆菌。应用纸片扩散法对分离的大肠杆菌进行药物敏感试验,结果表明,对丁胺卡那霉素敏感的菌株有81％,氟苯尼考42％,庆大霉素39％,痢菌净33％,新霉素31％。对阿莫西林耐药的菌株为86％,氯霉素72％,土霉素56％,卡那霉素47％、庆大霉素47％。通过本次试验可知丁胺卡那霉素可作为襄樊地区防治致病性大肠杆菌的首选药物,氟苯尼考作为备选药物。