产气荚膜梭菌ε毒素及其疫苗研究进展

产气荚膜梭菌病是由产气荚膜梭菌引起的一种重要的人兽共患传染病,可导致山羊、绵羊等动物的肠毒血症或坏死性肠炎,并且可引起动物脑、心、肺和肾组织的水肿.B型和D 型产气荚膜梭菌所产生的ε毒素是引起动物上述病理变化和死亡的重要因素之一.虽然甲醛灭活的毒素疫苗能对动物产生保护性抗体,但是,灭活苗潜在的安全性原因使其在应用上受到限制.因此,基于ε毒素基因的重组疫苗和弱毒疫苗就成为人们研究的目标.     

产气荚膜梭菌ε毒素原核表达及其单克隆抗体的制备

以大肠杆菌表达的D型产气荚膜梭菌点突变的ε毒素蛋白作为免疫原,免疫BALB/c小鼠制备单克隆抗体,经过ELISA方法筛选,获得2株稳定分泌抗ε毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株2C3-D7和5H6-B8,单抗均为IgG1型。Western blot鉴定结果显示:2株单抗均能与重组ε毒素蛋白及D型产气荚膜梭菌ε毒素蛋白发生特异性结合。本试验为进一步研究产气荚膜梭菌ε毒素的生物学特性及建立产气荚膜梭菌的快速检测方法提供了基础。     

D型产气荚膜梭菌主要毒素基因的PCR检测

为了研究产气荚膜梭菌主要毒素基因,试验采用生物软件以NCBI上登录的产气荚膜梭菌α毒素、ε毒素作为参考,设计扩增D型产气荚膜梭菌α毒素与ε毒素的特异性引物,预期基因片段大小分别为1 110 bp、888 bp,进行PCR扩增。结果表明:设计的引物可以良好地扩增α毒素基因与ε毒素基因,基因片段大小与预期一致。     

产气荚膜梭菌ε毒素研究进展

产气荚膜梭菌是一种重要的人畜共患细菌性传染病病原,在自然界中分布极广,一定条件下可引起多种疾病.该菌常通过其外毒素危害人和动物机体,所产毒素主要有α、β、ε和ι4种外毒素.根据毒素产生的情况,将产气荚膜梭菌分为A、B、C、D、E、F和G7个型.ε毒素毒力最强,主要由B型和D型菌分泌.论文通过致病机理、病理变化、流行特点...     

D型产气荚膜梭菌ε毒素基因表达及其免疫保护作用的初步研究

利用PCR技术,从D型产气荚膜梭菌标准株(C60-2)染色体DNA中扩增出ε毒素基因。该基因产物大小为906 bp,序列分析结果表明,与GenBank报道的产气荚膜梭菌参考菌株ε毒素基因序列同源性大于99%。将扩增的ε毒素基因定向克隆到原核表达载体pET32a中,得到重组质粒pET32a-ETX,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)plys中,经IPTG诱导后,SDS-PAGE分析可见大小为54 ku的特异条带;经Western blotting和ELISA检测结果表明,表达的ε毒素能与抗天然ε毒素抗体发生特异性反应,说明ε毒素蛋白具有较好的反应原性。将表达的ε毒素蛋白用0.4%的甲醛溶液制成类毒素疫苗,免疫小鼠后,具有一定的保护力,这表明该重组菌株有望成为产气荚膜梭菌基因工程类毒素疫苗的候选菌株。     

A型产气荚膜梭菌α毒素的研究进展

α毒素（CPA）是产气荚膜梭菌最重要的毒素之一,而且也是A型产气荚膜梭菌最主要的毒力因子。Macfarlane首先发现α毒素的本质为酶,它具有细胞毒性、溶血活性、致死性、皮肤坏死性、血小板聚集和增加血管渗透性等特性。产气荚膜梭菌是引起各种动物坏死性肠炎、肠毒血症、人类的食物中毒和创伤性气性坏疽的主要病原菌之一,该菌分为A、B、C、D、E5型,其致病因子是菌体产生的外毒素。本文主要综述了A型产气荚膜梭菌α毒素的基本特征、结构、功能、检测技术等方面的研究进展。     

D型产气荚膜梭菌最佳产毒时间及毒素大小的确定

本实验测定了D型产气荚膜梭茵在肝片肉汤培养基的生长曲线、培养液的pH值变化曲线以及不同培养时间提取的毒素液的蛋白质含量,并用SDS--PAGE电泳方法检测了所提毒素为α、ε毒索。结果表明,D型产气荚膜梭茵在肝片肉汤培养基培养18h是其α、ε毒素的最佳产毒时间,毒素大小分别是43kD、35kD。     

D型产气荚膜梭菌引起青鹿猝死

对上海动物园 1头猝死的青鹿进行了详细的病原学研究。在死亡动物的肠组织中分离到粗大正直的杆菌 ,有荚膜和芽孢 ,并能使牛乳培养基海绵状发酵 ,可致死小白鼠 ,LD5 0 为 5× 1 0 4CFU。结合肠内容物的毒素中和试验、青鹿的临床症状和病理解剖特征 ,确诊该青鹿的猝死是由于感染了毒力较强的D型产气荚膜梭菌。     

抗产气荚膜梭菌ε毒素Phage-ScFv库的构建、筛选与鉴定

利用本实验室已诱导并纯化后的重组毒素蛋白制成类毒素免疫BALB/c小鼠,提取小鼠脾脏mRNA。通过RT-PCR和SOE-PCR获得由抗体重链可变区(VH)-Linker-轻链可变区(VL)构成的750bp左右单链抗体(ScFv)基因片段。随后利用噬菌体展示技术成功构建了抗产气荚膜梭菌ε毒素噬菌体单链抗体(Phage-ScFv)库。并通过吸附-洗脱-扩增,5轮高效的淘洗筛选系统,最终筛选出特异性强的噬菌体抗体。最后,对强阳性的单链抗体侵染E.coli HB2151进行表达,SDS-PAGE结果显示其相对分子质量为30 000左右,与预期结果一致,并且能以分泌形式表达。本试验为抗产气荚膜梭菌ε毒素中毒治疗及其分子致病机制的研究奠定了基础。     

产气荚膜梭菌ε毒素重组突变体大肠杆菌表达条件的优化

为优化产气荚膜梭菌ε毒素重组蛋白的表达条件,以前期构建的产气荚膜梭菌ε毒素重组突变体为基础,通过控制变量法确定诱导温度、诱导时间、IPTG诱导浓度以及诱导时菌液浓度等原核蛋白表达条件.结果表明,ε 毒素的重组突变体在37℃、菌液OD600值为0.895～1.295,1.6 mM IPTG诱导6 h条件下可溶性表达量最高...     

产气荚膜梭菌ε毒素基因的克隆、表达及其抗血清的制备

PCR扩增B型产气荚膜梭菌C58-2株ε毒素完整基因,并将其插入到pGEM-TEasy载体中,构建克隆载体pGEM-T-ε。对克隆载体pGEM-T-ε进行双酶切,将得到的918bp片段以正确的阅读框架定向克隆于pET-28a(+)中,然后将重组质粒转化进宿主菌BL21(DE3)中,在37℃1mmol/LIPTG诱导下该基因获得良好表达。经SDS-PAGE分析,其表达的蛋白约为36600,与预期值一致。Western-blotting试验显示,该重组蛋白可被D型产气荚膜梭菌血清识别,表明该重组蛋白具备天然毒素相似的反应原性。重组ε毒素蛋白在菌液上清、超声波裂解上清和包涵体中均有分布,表明重组蛋白可同时以胞外、周质和胞浆的形式表达,且以周质方式为主。重组蛋白在胰酶活化前后均可致死小鼠,活化后毒力可为原来的150倍。以重组ε毒素蛋白作为抗原免疫家兔制备血清,效价测定结果表明,重组ε毒素蛋白抗血清每毫升可中和30000个小鼠MLD。毒素-抗毒素中和试验和琼脂扩散试验均表明,该抗血清具有ε毒素特异性。     

产气荚膜梭菌α毒素的研究进展

作者对产气荚膜梭菌α毒素的组成、理化性质、生物学特性、检测、结构功能、作用机理、分子遗传及其与氨基酸的组成和细胞膜之间的关系等方面的研究进展作了简要综述。     

腐败梭菌α毒素和产气荚膜梭菌ε毒素的 共表达及其免疫效力评价

为获得腐败梭菌α毒素和D型产气荚膜梭菌ε毒素的共表达产物,并鉴定其致死活性和反应原性,评价其免疫保护效力,利用PCR扩增腐败梭菌α毒素和产气荚膜梭菌ε毒素基因Gcsa和Gcpe并克隆至pETDuet-1质粒,转化E.coli BL21(DE3),自诱导培养基诱导这2段基因共表达;用SDS-PAGE和Western-blot以及小鼠毒性试验、抗毒素血清中和试验对表达产物进行鉴定;将诱导后的大肠杆菌灭活,制成铝佐剂疫苗1 m L/只皮下注射免疫家兔2次,测定免疫血清中和抗体效价,用1 MLD的腐败梭菌毒素和D型产气荚膜梭菌毒素分别攻击。结果显示,所构建的E.coli BL21(pETDuet-Gcsa-Gcpe)可以同时表达Gcsa和Gcpe,表达产物能够与腐败梭菌和D型产气荚膜抗毒素血清反应;且具有小鼠致死毒性,只有用2种抗毒素一同作用,才能将其毒性中和;制成灭活疫苗免疫家兔,免疫血清对腐败梭菌毒素的中和抗体效价为2 MLD/0.1 m L,对D型产气荚膜梭菌毒素的中和抗体效价≥50 MLD/0.1 m L;用2种毒素攻击,免疫组家兔全部保护,对照组全部死亡,达到《中华人民共和国兽药典》(2015版)效力检验标准。结果表明,所构建的表达载体可以实现α毒素和ε毒素的活性共表达,本研究为腐败梭菌和产气荚膜梭菌的多联基因工程灭活疫苗的研究提供了实验基础。     

产气荚膜梭菌α毒素研究进展

α毒素是产气荚膜梭菌的主要毒素和致病因子之一。本文综述了产气荚膜梭菌α毒素的检测，基因的克隆，表达和调控以及毒素的结构与功能等方面的研究进展。     

产气荚膜梭菌α毒素的研究进展

产气荚膜梭菌 (Clostridiumperfringens)的致病作用一般由它所产生的胞外酶或毒素诱导。主要有α -毒素、β -毒素、θ -毒素及其他的一些胞外酶。本文针对产气荚膜梭菌α毒素的组成、结构、理化性质、作用机理及分子遗传等方面的研究进展作了简要综述。     

产气荚膜梭菌α毒素研究进展

产气荚膜梭菌 (Clostridium perfringens)α毒素是第一个被赋予酶活性的细菌毒素 ,194 1年Mac Farlane和 Knight将其命名为磷脂酶 C。产气荚膜梭菌是一类革兰氏阳性厌氧粗大杆菌 ,大小 3～4μm× 1～ 1.5μm,分布广泛 ,恶劣时可产生高抵抗力的内生性孢子。该菌产生的外毒素有α、β、γ、δ、ε、η、θ、ι、κ、λ、μ、ν 12种以及肠毒素 (也称为芽胞相关蛋白 ) ,但主要起作用的是α、β、ε、ι4种。根据细菌产生外毒素的种类差别 ,可将产气荚膜梭菌分成 A、B、C、D、E等 5型。各型菌均可产生α毒素 ,其中以 A型菌产生的最多。毒素…     

抗产气荚膜梭菌ε毒素单克隆抗体的研制和部分特性鉴定

小鼠ＳＰ２／０骨髓瘤细胞和用产气荚膜梭菌ε类毒素免疫ＢＡＬＢ／Ｃ鼠的脾细胞，以ＰＥＧ为融合剂进行融合，获得分泌抗产气荚膜梭菌ε毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株１３株，经鉴定，杂交瘤所分泌的单克隆抗体在ＥＬＩＳＡ中均特异地与产气荚膜梭菌ε毒素反应，而不与α和β毒素反应，１３株单克隆抗体均为ＩｇＧ１亚类，经毒素抗毒素中和试验测定，１３株单克隆抗体中，１２株具有中和ε毒素的活性。     

产气荚膜梭菌主要毒素生物学活性研究进展

梳理和总结了产气荚膜梭菌的主要毒素种类、生物学活性、致病机制等,为后续的毒素分型、快速检测方法建立以及相关致病机制研究提供参考。     

产气荚膜梭菌ε毒素突变体的表达及免疫保护力评价

为获得产气荚膜梭菌ε毒素(ETX)的重组突变体,并评价其毒力及免疫原性。对已知的D型产气荚膜梭菌ETX编码基因进行优化设计,并将第106位组氨酸突变为脯氨酸,经人工合成获得基因片段GETXH106P。将GETXH106P克隆至原核表达载体p ET30a(+),转染BL21(DE3)菌中进行表达与纯化,从而获得重组蛋白r ETXH106P。利用Western blot方法检测r ETXH106P与D型产气荚膜梭菌抗血清的反应性,并检测其对犬肾细胞系(MDCK细胞)以及小鼠的毒力。随后,将r ETXH106P与Montanide ISA 201佐剂混合乳化制备疫苗,免疫4只健康家兔,按照《中华人民共和国兽药典》(2015年版)规定的方法检测一免及二免后兔血清的中和抗体效价。结果表明,r ETXH106P为可溶性表达,通过灰度扫描,其可溶性表达量比例可达30%;该重组蛋白能与D型产气荚膜梭菌毒素抗血清反应;细胞毒性试验结果显示,100μg/m L的重组蛋白仍无细胞毒性;小鼠安全性实验结果显示,6.25×106ng/kg剂量的重组蛋白对小鼠仍无致死性;每毫升的一免抗血清可中和450~700个最小致死量(MLD)、二免抗血清可中和3000~4000个MLD的D型产气荚膜梭菌毒素;用1 MLD的D型产气荚膜梭菌毒素攻毒后,对照组家兔4/4死亡,免疫组家兔4/4保护。以上结果表明,产气荚膜梭菌r ETXH106P重组蛋白毒力基本消失,且保留了良好的免疫原性,是D型产气荚膜梭菌病基因工程亚单位疫苗的理想候选抗原蛋白。