草原革蜱各发育阶段对驽巴贝斯虫传播能力的研究

将实验室培育好的“清洁”草原革蜱成，释放到驽巴贝斯虫单一种人工感染的驴体上，使其自行叮咬吸血，俊雌虫饱血脱落后，置２８℃、相对湿度约９０％的温箱中产卵孵化，而后用次代３个不同发育阶段的蜱，分别叮咬除脾或非除脾健康易感驴。试验结果表明，草原革蜱在成虫阶段被驽巴贝斯虫感染，并经卵传递。次代幼虫、若虫和成虫都具有传播该种病的能力。另外，还发现在草原革蜱卵内发育的驽巴贝斯虫，对易感宿主动也具有感染性。     

内蒙古和新疆两地草原革蜱源性马驽巴贝斯虫病病原DNA检测

为探究来源于内蒙古西部某地的草原革蜱及新疆境内广泛分布的草原革蜱携带同一种病原-驽巴贝斯虫的情况。本试验借助光学、电子显微镜进行鉴定了采自于不同植被(包括内蒙古、新疆两地)的草原革蜱;并参考驽巴贝斯虫Bc48基因序列,合成引物,提取该种蜱携带的马驽巴贝斯虫病原DNA,进行PCR扩增、检测。结果显示,来自内蒙古(N=147)、新疆(N=200)两地的草原革蜱在假头基部、多孔区、齿式、气门板等超微结构形态方面基本相似。经PCR成功扩增出了草原革蜱所携带的驽巴贝斯虫病原DNA阳性条带452 bp;来源于内蒙古西部某地的草原革蜱携带驽巴贝斯虫的阳性率为8.16%(12/147),来源于新疆和静县平原的草原革蜱驽巴贝斯虫的阳性率为13.50%(27/200)。这些参数可为草原牧区优势分布蜱虫-草原革蜱所传播家畜血液原虫病的防治提供科学依据。     

甘肃省马驽巴贝斯虫病综合防治研究

在查明了30余年来流行甘肃省陇东南地区的一种马病病原为驽巴贝斯虫病，传媒为森林革蜱和草原革蜱的基础上，开展了综合防治研究工作。通过抗血液原虫药物的治疗试验，证明咪唑苯脲、贝尼尔、黄色素、焦虫净对驽巴贝斯虫病的治愈率分别为100％、84．62％、81．82％、73．33％。对贝尼尔用药途径改肌注为静脉滴注后治愈率由84．625提高到90．63％，且副反应大幅度降低，药物预防试验中证明咪唑苯脲、焦虫净、贝尼尔预防效果均达98％以上，有效保护期分别为59、24、24天。应用敌杀死灭蜱预防，效果达100％，有效保护期为23天。成功地研制出了咪唑苯脲缓释剂，其预防效果达100％有效保护期为113天。研究制定了“三双”综合防治措施，在流行区15个县（区）实施3年，共治愈马类家畜119175匹，预防马类家畜905200匹。流行区发病率由13．85％降到0．095，死亡率由5．65％降至0．04％。，获得经济效益8908．98万元。     

甘肃省东南地区马类家畜驽巴贝斯虫病病因及其防治技术

自６０年代以来,甘肃省东南地区马类家畜中间断流行驽巴贝斯虫病。１９９６年春季呈暴发性流行,造成了巨大的经济损失。直到１９９６年６月才被确诊,并得到迅速有效地控制。结合一年多的实践,对该病及其防治技术介绍如下：１驽巴贝斯虫病及传播媒介蜱１．１调查发现的...     

马驽巴贝斯虫病的诊断和治疗

１９９９年春季以来,我院接连收治１０余例以高热、贫血、黄疸等为主要特征的马匹疫病,实验室诊断确诊为马驽巴贝斯虫病,后经治疗全部治愈,现将情况介绍如下。１　发病情况吉林省左家地区属半山区,春季林地草场存在大量森林革蜱,但本院从有记录的１９９３年以来,尚未收治过患梨形虫病的马匹。１９９９年春季以来陆续有马匹发病,主要表现食欲减退,体温升高,经过抗生素或清热泻火类中药治疗无效,遂来我院就诊。２　临诊症状发病初期病马精神沉郁,饮食欲减退,但二便均正常,体温升高达３９－５～４１－８℃,心率每分钟达７０～…     

马驽巴贝斯虫ddPCR检测方法的建立

马驽巴贝斯虫(Babesia caballi)病是马属动物的一种血液原虫病,被农业农村部列为二类动物疫病.本研究旨在建立一种针对马驽巴贝斯虫病的ddPCR检测技术.利用马驽巴贝斯虫特异性引物及探针对反应体系进行优化,测试了方法的特异性、稳定性及灵敏性,对30份可疑样品进行了初步检测.结果显示,该方法具有较好的稳定性,最...     

巴贝斯虫及其传播媒介—蜱的研究概况

巴贝斯虫是属于原生动物亚界(Protozoa)、顶器门(Apicomplexa)、孢子虫纲(Sporozoa)、真球虫目(Eucoccidiorida)、梨形虫亚目(Piroplasma)、巴贝斯虫科(Babesiidae)、巴贝斯虫属(Babesia)的一类单细胞虫体。巴贝斯虫属共有99种虫体,它们分别寄生于各种家畜、野生动物和各种鸟休内。其中多数虫体具有严格的宿主特异性。只有少数虫体,如田鼠巴贝斯虫(B.microti)、既可在鼠体内寄生,有时又可侵袭人体 自然条件下,多数巴贝斯虫必须经硬蜱(lxodid)才能在哺乳动物宿主间传播。在哺乳动物宿主体内,巴贝斯虫主要寄生于红细胞内,分裂繁     

甘肃省陇东南地区马类家畜驽巴贝斯虫病流行病学调查

甘肃省陇东南地区的礼县，北道，秦城等县（区）的马类家畜中，流行一种以高热，黄疸，贫血为主要特征的疫病。经流行病学调查，实验室诊断，病理剖检，确诊为驽巴贝斯虫病，其传播媒介为森林革蜱，该病每年１～６月发病，具有固定的地区性，不受品种，性别，年龄的限制，营养状况对发病率也无明显影响，经用贝尼尔以３．５ｍｇ／ｋｇ体重剂量深部肌肉注射，结合对症治疗，治愈率达８９．７％。     

一例马混合感染驽巴贝斯虫与马巴贝斯虫病及并发症的诊治

从外地新购的马，混合感染驽巴贝斯虫、马巴贝斯虫，由于早体代谢产物的刺激与渐进性贫血，而引发一系列并发症：心衰、肺水肿、出血性素质致肠驰缓。经实验室检查确诊后，用黄色素、贝尼尔驱杀致病体并采用补液、止血、通便、强心等一系列对症治疗措施及中兽医辩证治疗后，该病例救治成功。     

吸血行为对草原革蜱和森林革蜱中肠菌群结构的影响

本研究旨在探明随吸血时间的延长,草原革蜱和森林革蜱中肠菌群结构的特征及变化。从内蒙古呼伦贝尔和宁夏固原绵羊体表分别采集半饱血、饱血草原革蜱和半饱血、饱血森林革蜱,无菌条件下收集蜱中肠内容物,提取细菌总DNA,扩增细菌16S rDNA V3-V4区,IonS5^TMXL高通量测序,对比分析各样本菌群结构的特征。结果显示,森林革蜱半饱血中肠内的细菌多样性最高,草原革蜱饱血和半饱血中肠内的细菌多样性次之,森林革蜱饱血中肠内的细菌多样性最低;变形菌门为4个样品的优势菌门;无形体属、立克次体属、寡养单胞菌属和柯克斯体属为4个样品的优势菌属,其中无形体属在草原革蜱和森林革蜱饱血中肠内的含量高于2种蜱半饱血中肠,立克次体属和柯克斯体属在2种蜱半饱血中肠内的含量明显大于饱血中肠;边缘无形体、弯曲假单胞菌和柯克斯体科RFE02菌为4个样品的优势菌种,其中边缘无形体的分布特点与无形体属在2种蜱中肠内的分布特点相一致。结果表明,草原革蜱和森林革蜱中肠菌群结构易受到吸血行为的影响,共有菌属和菌种在不同蜱种和不同饱血状态下的相对丰度变化较大。     

草原革蜱和边缘革蜱的分子生物学鉴定

本研究旨在建立草原革蜱和边缘革蜱的分子生物学鉴定方法,并探讨其系统发生关系。在新疆从动物体表采集寄生蜱,形态学鉴定后,PCR扩增获得2种革蜱的16S rRNA及线粒体色素氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)基因序列,测序后进行同源性分析。用Mega 5.0和Mrbayes 3.2软件分别构建系统进化树,草原革蜱16S rRNA序列与GenBank数据库中已知草原革蜱16S rRNA序列聚类,而边缘革蜱COⅠ序列与GenBank数据库中已知边缘革蜱COⅠ序列聚类,与形态学鉴定结果一致。本研究结果表明,在传统形态学分类的基础上,结合分子生物学鉴定方法能简易、准确鉴定草原革蜱和边缘革蜱。     

马驽巴贝斯虫PCR和qPCR检测方法的建立

马驽巴贝斯虫是一种寄生于马属动物的血液原虫,给马产业造成巨大的经济损失。本研究旨在建立两种高效、可靠的PCR诊断技术,为进一步提高口岸检疫工作效率奠定基础。根据马驽巴贝斯虫Bc48基因序列,设计了一对特异性引物和荧光探针,建立了PCR和qPCR检测方法,测试了两种方法的特异性、灵敏性、稳定性。结果显示：建立的两种方法均具有良好的特异性;PCR方法的最低检出限为4.04×10² copies/μL,qPCR方法的最低检出限为4.04×10¹ copies/μL;对33份马血样品进行检测,结果qPCR检出的阳性样品数为23份(69.7%),而PCR检出的阳性样品数为9份(27.3%)。表明两种方法均可成功用于马驽巴贝斯虫的检验,但是荧光定量PCR方法的灵敏度明显优于PCR方法。     

驽巴贝虫BC-48基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

采用PCR方法扩增驽巴贝虫吉林分离株BC-48基因片段，将扩增产砌与pGEM—TEasy载体连接，重组质粒经PCR、单酶切鉴定后测序；构建BC-48的重组pGEX-4T-2表达载体．经IPTG诱导表达后，进行SDS-PAGE、Western—blotting分析。结果显示，克隆的BC-48基因片段长610bp，含有一个570bp的开放阅读框，编码189个氨基酸，与GenBank中USDA株（U46551）的同源性为96．7％；表达的融合蛋白为45ku，能被驽巴贝虫阳性血清识别；表明该融合蛋白具有较好的反应原性。     

牛巴贝斯虫巢式PCR诊断方法的建立

根据GenBank发表的XJ-MSA-2c核苷酸序列(登录号:EU328267)设计的2对特异性引物MS-1、MS-2、MS-3以及MS-4,建立牛巴贝斯虫病巢式PCR快速检测方法。在特异性检测试验中,仅从MSA-2c质粒样本中扩增出622、350bp2条目的片段,与预期片段大小相符,而作为对照样本的双芽巴贝斯虫、牛环形泰勒虫、东方巴贝斯虫基因组DNA均无此扩增目的条带出现。第1次和第2次扩增的敏感性分别为1.75、1.75×10-2μg/L。在对46份全血的DNA样本巢式PCR和显微镜检测中,阳性检出率分别为34.8%(16/46)和23.9%(11/46)。结果表明,所建立的巢式PCR方法准确、敏感、特异,作为牛巴贝斯虫病的快速检测和小范围的流行病学调查,具有重要的临床意义。     

Prokaryotic Expression of the Cysteine Proteinase Gene of Xinjiang Strain of Theileria equi/Babesia caballi and Its Bioinformatics Analysis

This study aimed to clone and express cysteine proteinase (CP) gene of Theileria equi and Babesia caballi. The CP proteins were analyzed using bioinformatics tools and online databases. The total DNA of T. equi and B. caballi as the template sequence for PCR. The CP genes were cloned, expressed using the cloning technique and prokaryotic expression system, respectively. Then the recombinant CP (rCP) proteins were purified by Urea dialysis. Finally the specific reaction of polyclonal horse anti-CP serum with rCPs was analyzed through Dot blot method. The CPs were predicted and analyzed by the software MAGA, Prot Param, TMHMM, SignalP-5.0, Antibody Epitope Prediction, SYFPEITHⅡ, ProPred and EzMol^2.1 respectively. The CP genes were successfully amplified from DNA of T. equi and B. caballi and expressed in the inclusion body fractions, Dot blot assay indicated that the recombinant protein could react with polyclonal horse anti - CP serum. Compared with T. equi-CP and B. caballi-CP, different protozoon CP genes were highly conserved in evolution, and phylogenetic analysis results were consistent with their protozoon taxonomy. The bioinformatics analysis revealed that two CPs are the hydrophilic protein instead of a transmembrane one, no transmembrane domain, no Th cell epitope was found, and more localized in the cytoplasm, mitochondria and nuclei. The relative molecular weight (MW) of T. equi-CP was 29 948.60, the theoretical isoelectric point (pI) was 5.53, stability coefficient was 22.50; B. caballi-CP’MW was 14 603.62, the theoretical pI was 8.54, stability coefficient was 47.69, but signal peptide was contained. The CPs have good reactionogenicity, as the hydrophilic extracellular proteins with no Th cell epitope, and more localized in the cytoplasm, mitochondria and nuclei, which helped T. equi and B. caballi avoid host immune response outside the cell membrane and the CPs involved in proliferation, differentiation and programmed cell death. In conclusion, a theoretical basis was provided for the study on CP’s functions and the pathogenesis of T. equi and B. caballi.     

马驽巴贝斯虫新疆伊犁株Bc48基因克隆、表达及其多克隆抗体的制备

为表达马驽巴贝斯虫新疆伊犁株Bc48基因,制备多克隆抗体,试验根据GenBank中马驽巴贝斯虫Bc48基因序列,设计合成1对特异性引物,以提取的新疆株Bc48基因组DNA为模板进行PCR扩增,将扩增产物克隆至原核表达载体pET-28a（+）中,阳性质粒转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中,经IPTG诱导后表达产物进行SDS-PAGE分析,切胶纯化蛋白后免疫6周龄雌性BALB/c小鼠,制备多克隆抗体;同时把该基因克隆至真核表达载体pCMV-N-flag中,将阳性质粒转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中,提取pCMV-N-flag-Bc48质粒转染到293T细胞中进行真核表达。结果显示,获得了大小约为15 ku的融合蛋白,与预期目的蛋白大小相一致;免疫BALB/c小鼠制备的多克隆抗体经ELISA和Western blotting检测、验证,能特异地识别相应抗原,其抗体效价可达1：128 000,说明该多克隆抗体有较高的抗体效价和特异性;真核表达质粒在293T细胞中表达Bc48蛋白。本试验可为进一步研究马驽巴贝斯虫功能基因及建立快速的检测方法奠定基础,在虫株的分类学研究及候选疫苗的研制中有重要意义。     

马泰勒虫和驽巴贝斯虫半胱氨酸蛋白酶截短基因的克隆表达及其生物信息学分析

旨在克隆、表达马泰勒虫（Theileria equi）和驽巴贝斯虫（Babesia caballi）半胱氨酸蛋白酶（cystein protease,CP）基因,并对其进行生物信息学预测和分析。提取马泰勒虫和驽巴贝斯虫的DNA,以此为模板扩增目的基因。利用克隆技术和原核表达系统克隆表达CP,用尿素透析法进行纯化。通过Dot blot验证其与相应阳性血清特异性反应。应用MAGA软件和Prot Param、TMHMM、SignalP-5.0、Antibody Epitope Prediction、SYFPEITHⅡ、ProPred及EzMol^2.1等在线分析软件分析T.equi-CP和B.caballi-CP的基因及其蛋白序列。成功构建了重组质粒GST-T.equi-CP和GST-B.caballi-CP,经SDS-PAGE试验结果显示该基因表达的蛋白以包涵体形式高效表达,并能与相应阳性血清特异性反应。对T.equi-CP和B.caballi-CP基因编码蛋白进行系统发育分析发现,与其他原虫物种相比,系统发育分析结果与其原生动物学分类结果一致。经生物信息学分析预测显示,两个CP蛋白为亲水性蛋白,无跨膜区,不属于跨膜蛋白,无Th细胞表位,在细胞质、线粒体和细胞核中定位较多。其中T.equi-CP蛋白的相对分子质量为29 948.60,等电点为5.53,稳定系数为22.50。B.caballi-CP蛋白的相对分子质量为14 603.62,等电点为8.54,稳定系数为47.69,有信号肽区域。T.equi-CP和B.caballi-CP蛋白具有良好的反应原性,作为亲水性膜外蛋白,无Th细胞表位,在细胞质、线粒体和细胞核中定位较多等,可能说明CP在马梨形虫逃避宿主免疫反应,参与增殖、分化及程序性细胞死亡等发挥作用。本研究为T.equi-CP和B.caballi-CP蛋白的功能研究与马梨形虫的致病机制研究提供了理论依据。     

内蒙古锡林郭勒盟地区优势蜱种及其基因多样性分析

为了解内蒙古锡林郭勒盟地区的优势蜱种及其存在的基因多态性,应用传统形态学和分子生物学相结合的方法,对该地区14个主要牧区采样点进行蜱虫种型的鉴定和基因多态性分析。通过传统形态学鉴定方法,对蜱虫样品进行显微镜观察以初步确定蜱属。采用聚合酶链式反应(PCR)对蜱虫的16S rRNA基因序列进行扩增,测序后对蜱种进行分子鉴定和基因序列同源性分析,确定蜱种多样性。应用Mega 6.06软件构建系统进化树,与GenBank数据库中已知蜱虫的16S rRNA进行聚类分析,以确定蜱进化的规律。结果显示14个不同地区的蜱虫均属于草原革蜱,为锡林郭勒盟地区的优势蜱种之一,但不同地区的蜱虫之间存在明显的基因多态性。