莱州湾三疣梭子蟹生态容量估算

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus,以下简称梭子蟹)是莱州湾内重要渔业资源,为恢复其资源量,湾内每年都进行大规模的增殖放流活动,增殖放流管理工作,亟需对梭子蟹生态容量进行深入研究。通过ECOPATH模型分析了莱州湾生态系统结构,并估算了梭子蟹在湾内的生态容量。在不改变生态系统结构以及维持系统稳定性的前提下,梭子蟹的生态容量可达1.107 t.km-2,生物量可达7 412 t,而梭子蟹在湾内的总资源量为3 759 t,说明梭子蟹仍有很大的放流空间。     

莱州湾三疣梭子蟹的生化遗传分析

采用聚丙烯酰胺不连续凝胶垂直板电泳技术对三疣梭子蟹的同工酶进行检测。分析了13种同工酶在莱州湾三疣梭子蟹肌肉中的表达情况,并对同工酶的表型进行了生化遗传分析。结果表明,13种同工酶有22个基因位点编码,其中Ldh-1,Me-3,Gdh-1,Sdh-1,G6pd-1和Sod-3共6个位点是多态的,多态位点百分数是27.3%。三疣梭子蟹的平均每个位点的等位基因的有效数目Ae为1.2270,平均每个位点的预期杂合度He为0.1170,实际杂合度Ho为0.2159。同时还分析了三疣梭子蟹的各个多态位点的Hardy-Weinberg偏离指数:Ldh-1、Me-3和Sod-3的d值都为1.0000,Gdh-1、Sdh-1和G6pd-1的d值分别为0.5047、0.8726和0.0597。这些数据表明,莱州湾三疣梭子蟹的种质资源还处于较好的状态。     

放流三疣梭子蟹月间回捕率及繁殖贡献率研究

2015年6月,将约500万只人工繁育的三疣梭子蟹C2期稚蟹放流到辽宁盘锦沿岸海域.当年7月28日—10月3日在盘锦沿岸以地笼网回捕1671只三疣梭子蟹样本,剪其螯足,剥离肌肉,提取DNA,利用微卫星DNA分子标记进行亲子鉴定,开展个体识别.试验结果显示,120只为当年放流蟹,放流后苗种短期月间放流蟹占当月回捕蟹群体的...     

三疣梭子蟹养殖技术

1 三疣梭子蟹的生活习性 梭子蟹是近海性种类,不做长距离的洄游,只是在冬季,随着水温的下降,而移栖于较深海区10～30m海底的泥沙中越冬,往往越冬的潜水深度,随着个体大小而不同.每年的春、夏,于清明前后到近岸3～5m的浅海区域索饵、生长和繁殖.因此,梭子蟹是海洋人工增殖放流的优良品种.     

三疣梭子蟹线粒体基因组SNP在增殖放流家系识别中的应用

为开发三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)增殖放流分子标志技术,本研究在前期获得三疣梭子蟹线粒体基因组24个SNP位点的基础上,采用高分辨率熔解曲线(HRM)检测技术对4个用于增殖放流的家系(A、B、C和D)(代表约80~120万个放流个体)进行了鉴别工作。结果显示,含有SNP位点的22条PCR扩增序列中,有9条SNP位点扩增产物在亲代(母本)及其子代的28个个体之间具有基本一致的熔解峰,且子代个体间Tm的均一性较好,无明显差异;进一步以序列已知的野生型及其突变体作为同一SNP引物扩增片段,在各家系间分析HRM标准曲线,这9个SNP可以成功用于三疣梭子蟹4个放流家系的鉴别。在这9个SNP位点中,可鉴定C家系的有5个,可鉴定B家系的有2个,可鉴定A、D家系的各1个。该研究结果为三疣梭子蟹种质资源的鉴定及标志放流工作的开展提供了技术支持。     

山东半岛南部海域三疣梭子蟹增殖放流群体回捕率

根据2010年和2011年5-8月在山东半岛南部海域对三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)增殖放流前后分别进行的每年3个航次的对比调查结果,定量分析了三疣梭子蟹自然群体和增殖放流群体的数量,并根据三疣梭子蟹放流苗种数量和放流后捕捞产量,对三疣梭子蟹增殖放流群体回捕率进行分析.研究结果表明,2010年5月山东半岛南部海域三疣梭子蟹增殖放流前自然群体资源量很少,相对资源密度为0.90 ind/(站.h);在5-6月共放流苗种11 015.13万只,放流后10d左右资源量增加为26.08 ind/(站.h),放流群体所占的比例为96.55％;8月进行调查的相对资源密度为1.70 ind/(站.h),当年生群体数量占所有群体数量的比例为64.29％;9月、10月、11月秋汛期间捕捞产量为3 108 t,捕捞个体平均质量为232.3 g,增殖放流群体回捕率为7.54％.201 1年5月山东半岛南部海域三疣梭子蟹增殖放流前自然群体相对资源密度为1.70 ind/(站.h);在5-6月共放流苗种13 132万只,放流后10d左右资源量增加为29.15 ind/(站.h),放流群体所占的比例为94.17％;8月进行调查的相对数量为1.00 ind/(站.h),当年生群体数量占所有群体数量的比例为70.00％;9月、10月、11月秋汛期间捕捞产量为2 896 t,回捕个体平均质量为226.0 g,增殖放流群体回捕率为6.43％.除2011年胶州湾海域由于富营养化水质较差,以及其他因素对黄家塘湾海域的影响导致这两个放流点放流群体回捕率偏低外,2010年和2011年山东半岛南部放流海域整体水质良好,水温、透明度、盐度、营养盐比例、生物饵料等均比较适中,属于放流环境条件较佳的海域,比较适合三疣梭子蟹生长,放流群体回捕率整体上处于较高水平.     

基于Ecopath模型的海州湾三疣梭子蟹增殖生态容量研究

为科学开展生态型增殖放流,对海州湾海域三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)开展生态容量评估。根据2018-2019年海州湾渔业资源调查数据,构建了由20个功能群组成的海州湾生态系统Ecopath模型,并对模型进行了不确定性及参数敏感性分析检验,系统分析了生态系统的总体特征、功能群间的营养关系和关键功能群,并评估了三疣梭子蟹的增殖生态容量。结果表明,Ecopath模型可信度Pedigree指数为0.482。三疣梭子蟹目前不是海州湾生态系统的关键功能群,其他底层鱼类、软体动物(Molluscs)以及底栖甲壳类(Benthic crustaceans)是海州湾生态系统的关键功能群。三疣梭子蟹生物量的增加对棘头梅童鱼(Collichthys lucidus)以及其他中上层鱼类产生正影响,对底层鱼类以及小黄鱼(Larimichthys polyactis)产生负影响;虾虎鱼科(Gobiidae)、口虾蛄(Oratosquilla oratoria)生物量的增加对三疣梭子蟹有较大负影响,多毛类(Polychaetes)生物量的增加对三疣梭子蟹有较大正影响。三疣梭子蟹的增殖...     

莱州湾三疣梭子蟹生物学参数及生长特性研究

根据2012年5~11月使用单船底拖网进行的7个航次调查数据,运用FiSATⅡ软件相关模块对莱州湾三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)生长、死亡参数及生长特性、种群补充模式、资源量等进行研究。结果显示:7个航次共捕获三疣梭子蟹1128 ind,雌雄性比为0.96,雌性甲宽为27~227 mm,雄性为29~207mm;获得三疣梭子蟹雌性生长参数k=1.60、L_∞=241.50、W∞=639.29、t0=0.081,雄性为k=1.50、L∞=210.00、W∞=418.23、t0=0.091;经体长结构VPA(Length-Structured VPA)模块估算,稳定状态下莱州湾三疣梭子蟹雌性渔获尾数为734×10~4ind、种群尾数为1.15×10~8ind、资源量为2 682 t,雄性渔获尾数为810×10~4ind、种群尾数为1.19×10~8ind、资源量为1 929 t;经变换体长渔获曲线法(Length-Converted Catch Curve)及刀刃式选择假设模型(Knife-Edge)估算三疣梭子蟹雌性总死亡系数Z=4.17、自然死亡系数M=1.20、捕捞死亡系数F=2.97、资源开发利用率E=0.712、平均选择甲宽Lc=62.38mm、最大效益时开发利用率Emax=0.515;雄性总死亡系数Z=3.76、自然死亡系数M=1.19、捕捞死亡系数F=2.57、资源开发利用率E=0.684、平均选择体长Lc=40.84 mm、最大效益时开发利用率Emax=0.487。研究表明:1)莱州湾三疣梭子蟹雌雄性比、雌雄性幂指数均处在正常水平,总体生长状况良好;2)莱州湾三疣梭子蟹雌、雄性群体资源利用率均显著高于最适利用率与最大利用率,处于过度开发水平;3)莱州湾三疣梭子蟹现存资源量低于生态容量,上升空间较大。     

三疣梭子蟹“早繁”试验

三疣梭子蟹是个体较大的海产食用蟹，其肉味鲜美，国内外久负盛名。辽宁地区因气候比较寒冷，人工饲养要到6月末7月初才放苗，至10月份起捕，生长期仅3～4个月，当年只有部分个体可达到商品规格，其余的需越冬，下一年再养，使养殖成本增加。为使大部分三疣梭子蟹能在当年达到商品规格，笔者于2002年进行了三疣梭子蟹“早繁”(提早人工育苗)试验。试验获得了成功，现总结如下。     

辽东湾三疣梭子蟹增殖放流效果评估

根据2018年6—8月在辽东湾对三疣梭子蟹增殖放流前后进行的4个航次的对比调查结果,定量分析了辽东湾三疣梭子蟹自然群体和增殖放流群体的数量,并根据三疣梭子蟹放流苗种数量和放流后捕捞产量调查数据,对辽东湾三疣梭子蟹增殖放流效果开展评价。结果显示,2018年6月上中旬辽东湾海域三疣梭子蟹增殖放流前,自然群体资源量较低,相对资源密度为2.80只/h;在6月下旬共放流苗种3 678.94万只,7月上中旬、8月上中旬和8月下旬三疣梭子蟹相对资源密度分别为16.60、2.20和13.33只/h。通过6月上中旬放流前本底调查和8月下旬放流后跟踪调查分析增殖放流前后三疣梭子蟹资源量的变化,通过内禀增长率来计算自然群体在放流前后的种群扩繁能力,计算出2018年辽东湾三疣梭子蟹放流后,放流群体所占比例为30.10%;同时采用世代分析法,分析出2018年三疣梭子蟹当年补充群体占比为94.54%。统计2018年秋汛期间三疣梭子蟹捕捞产量为1 890 t,增殖放流回捕产量538 t,回捕率9.36%,投入产出比为1∶12.02。通过扫海面积法估算三疣梭子蟹的资源量为2 056 t,接近于回捕调查的实际产量。建议可以适当加大辽东湾三疣梭子蟹的放流量,促进辽东湾三疣梭子蟹资源修复和渔民增收。     

池塘养殖三疣梭子蟹的生长规律

为探讨池塘养殖三疣梭子蟹的生长规律和雌雄差异，本研究对1～6月龄池塘养殖三疣梭子蟹各生长指标进行了比较分析，并采用Logistic模型分别拟合三疣梭子蟹的体重(BW)、体长(BL)、体高(BH)、全甲宽(FCW)、甲宽(CW)、大螯长节长(MLC)、大螯不动指长(FFLC)、第一步足长节长(MLFP)等8个形态性状的生长特征。结果显示，三疣梭子蟹雌性和雄性的生长存在差异，早期雄性生长较快，后期雌性生长较快，而雌雄混合分析介于二者之间。三疣梭子蟹各生长性状的Logistic模型拟合结果显示，除雌性MLC和MLFP以及雌雄混合分析的MLFP之外，其余性状R²均达到0.990以上；雌性和雄性体质量的极限生长值分别为290.27和195.91g，快速生长区间分别为2.74～5.10月龄和2.33～4.14月龄，拐点分别为3.92和3.24月龄。研究表明，三疣梭子蟹的生长过程均符合“慢-快-慢”的特征，雄性比雌性更早进入快速生长期，但是快速生长期的持续时间不及雌性。本研究对三疣梭子蟹不同生长指标的规律特征，以及各指标在混合养殖条件下雌性和雄性的优势阶段进行了研究，为实现三疣...     

三疣梭子蟹精子活力评价方法的研究

采用染色法和钙离子载体A23187诱导精子顶体反应法,对三疣梭子蟹精子的活力进行评价研究.结果表明,采用台盼蓝染色无法清晰辨别死、活精子.采用曙红B染色,精子分别呈现不同的染色特征:活精子无色,细胞边界清晰可辨,在光学显微镜下观察可见顶体中央突起的圆锥状结构和辐射臂;死精子细胞边界有稍许模糊,核杯和顶体均着色.最适的曙红B浓度和染色时间分别为2%和2 min.钙离子载体.A23187诱导精子顶体反应的结果显示:在诱导时间和A23187浓度分别为50 min和30μg·mL-1时,校正顶体反应率达到(92.73±2.43)%.对这两种活力检测方法的比较分析显示,曙红B染色法和钙离子载体A23187诱导精子顶体反应法的活力检测值与样品理论值呈显著正相关(P<0.01),他们二者之间亦呈显著正相关(P<0.01),说明这两种方法均可用于精子活力检测,其结果具有可比性.     

梭子蟹肌孢虫的组织分布与形式特点

利用透射电镜技术研究了梭子蟹肌孢虫在三疣梭子蟹体内的组织分布和形式特点,结果显示,梭子蟹肌孢虫主要寄生在骨骼肌、血淋巴、鳃、胃和肠,而在心脏、肝胰腺、性腺和神经等部位未发现。在胃和肠的结缔组织以及骨骼肌中发现梭子蟹肌孢虫的分裂体,表明其可以在这些组织的细胞中增殖,尤其是在骨骼肌细胞中,大量不同发育时期的虫体显示了该虫对骨骼肌的亲嗜性。梭子蟹肌孢虫的分裂体以及其他增殖期的细胞仅寄生于宿主细胞内,而成熟的孢子可存在于宿主细胞内和细胞外基质中。梭子蟹肌孢虫的孢子有6种存在形式,在宿主细胞内和宿主细胞外基质中各有3种。孢子在宿主细胞内的存在形式:1孢子直接寄生于宿主细胞质中,自由游离,无膜包围;2孢子被单层膜包围,类微绒毛样突起物部分溶解,这种情况见于专业性吞噬细胞——无颗粒细胞内;3孢子被层状环形膜结构包围,类微绒毛样突起物清晰,这种情况见于非专业性吞噬细胞内。孢子在宿主细胞外基质中的存在形式:1孢子自由游离,无膜包围,类微绒毛样突起物清晰;2多个孢子被体液性被囊包围,类微绒毛样突起物清晰;3孢子无膜包围,孢外壁与类微绒毛样突起物消失。本研究阐明了梭子蟹肌孢虫在三疣梭子蟹体内的组织分布和孢子的存在形式,为进一步研究微孢子虫在宿主蟹体内的迁移规律提供了重要的基础数据。     

三疣梭子蟹受精卵离体孵化技术

为了探究三疣梭子蟹受精卵的离体孵化技术及效果,本研究先后开展了受精卵块最适分离液种类及作用条件的筛选、分离液处理不同发育期受精卵离体孵化的差异、分离液处理对受精卵卵膜的结构影响,及分离液处理受精卵对孵化后幼体活力的影响实验。结果显示,木瓜蛋白酶是一种较为理想的分离液,在浓度为0.09 g/mL,分离时间30 min时,分离率可达到99%以上;经过分离液处理后的各期受精卵均能孵化出幼体,卵内溞状幼体期离体胚胎孵化率最高,为89.0%±3.3%,未经处理的对照组为70.0%±4.8%;卵裂期离体胚胎孵化率最低,为58.0%±3.9%,对照组为31.0%±2.3%,与对照组相比,处理组的孵化率明显提高。透射电镜结果显示,经过分离液处理的受精卵卵膜结构疏松,且厚度降低,符合处理组孵化率增加这一现象,干露、福尔马林溶液胁迫和行为学测试对不同处理组的幼体进行质量评价的结果显示,处理组和对照组幼体活力无显著差异。研究表明,实验所获得的分离液可以有效提高三疣梭子蟹受精卵的分离率和孵化率,且不影响幼体质量,可为三疣梭子蟹及其他甲壳动物受精卵的离体孵化提供参考。本研究可为三疣梭子蟹的苗种繁育提供新的技术手段,也将为基因编辑辅助育种等技术的实施奠定基础。     

三疣梭子蟹低盐耐受性相关甲基化标记的开发及验证

为开发三疣梭子蟹低盐耐受性相关甲基化标记,采用甲基化敏感性高分辨率熔解曲线法(methylation sensitive high resolution melting curve, MS-HRM)进行了三疣梭子蟹低盐耐受性相关甲基化位点的筛选和应用。结果显示,从三疣梭子蟹转录组数据库中共开发了8个甲基化标记,其中6个标记与低盐度耐受性显著相关,在低盐度条件下表现出显著的去甲基化或甲基化,这些标记分别位于V-ATP酶(V-type proton ATPase)、CLC型氯离子通道、琥珀酸脱氢酶、NAD(P)转氢酶(NAD(P)、磷酸乙醇酸性磷酸酶、NADH还原酶基因,为三疣梭子蟹耐低盐新品种的分子标记辅助选育提供候选工具。研究表明,“宁象1号”耐低盐能力显著高于野生群体,且选育群体中位点Pt-M1、Pt-M2的去甲基化率达到100%,可能有利于低盐条件下保持体内Na⁺和Cl^-的平衡。     

三疣梭子蟹EcR基因的克隆及表达分析

为研究蜕皮激素受体(EcR)在甲壳动物生长和生殖过程中的作用,采用反转录PCR(RT-PCR)和cDNA 末端快速扩增(RACE)技术,克隆了三疣梭子蟹蜕皮激素受体 (PtEcR)基因全长cDNA序列(GenBank登录号:KC354381),运用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法,分析该基因在不同组织、蜕皮时期和二次卵巢发育阶段的表达特 征。结果表明,PtEcR cDNA全长2 231 bp,包含1 269 bp ORF,编码422个氨基酸;推导的PtEcR氨基酸序列与已公布的其他甲壳动物EcR进行比对,发现一致性 达67%～97%;系统进化树分析PtEcR与其它甲壳动物EcR聚为一支,而昆虫EcR聚为另一支。PtEcR在检测的三疣梭子蟹10个组织中均有表达,其中在Y-器(YO)表达量最高。在蜕皮周期中,自蜕皮后期至蜕皮前期D2亚期PtEcR在YO中的表达量一直较低;至D3亚期和D4亚期,PtEcR表达量显著升高,这与血 淋巴中20-羟基蜕皮酮(20E)浓度在D3/D4亚期显著升高相协同,表明PtEcR在三疣梭子蟹蜕皮过程中起着重要的作用。二次卵巢发育阶段,PtEcR在YO和肝胰 腺(Hp)中的表达量自Ⅱ期逐渐升高至Ⅳ期达到最高;卵巢(Ov)中,则在Ⅰ、Ⅲ期较低,Ⅱ、Ⅳ期较高,表明PtEcR可能参与卵巢发育和卵黄发生。     

三疣梭子蟹卵黄磷蛋白纯化及其ELISA测定方法

采用凝胶过滤层析法纯化了三疣梭子蟹成熟卵巢的卵黄磷蛋白(vitellin,Vn),采用变性凝胶电泳(SDS-PAGE)确定了Vn亚基数量和分子量,以纯化的Vn为抗原,制备了三疣梭子蟹Vn多克隆抗血清,纯化后得到Vn抗体,在此基础上比较和优化了三疣梭子蟹Vn测定的酶联免疫吸附法(ELISA)参数,建立了稳定的三疣梭子蟹Vn含量测定的ELISA方法。结果表明:(1) SDS-PAGE 显示三疣梭子蟹成熟卵巢中的Vn含有分子量为100、75和66 ku的3个亚基,Western-blotting检测表明,这3个亚基均具有较强的免疫特异性;(2) 样品直接包被法比双抗体夹心法具有更高的线性相关性,Vn抗体最佳稀释倍数为1∶90 000,最佳包被时间为8 h,一抗和二抗反应时间分别为2 h和1 h,显色时间为20 min;(3) 该方法定性检测的灵敏度为14.9 ng/mL左右,标准曲线方程为y=0.000 9x+0.399 1(R²=0.986 1),其中x和y分别代表Vn浓度和OD₄₅₀值,工作范围为200～900 ng/mL;(4) 应用该方法测定三疣梭子蟹卵巢中Vn含量,结果表明,批次内和批次间平均变异系数分别为3.59%和3.10%,重复性良好。     

三疣梭子蟹LGBP基因的重组表达及微生物结合实验

将扩增得到的三疣梭子蟹LGBP基因开放阅读框与表达载体pET-22b(+)连接,转化E.coil BL21(DE3)plysE后IPTG诱导表达。经SDS-PAGE检测,发现诱导组比空载体和未诱导组多出一条分子量约为41 ku的表达产物,与预测的重组蛋白分子量大小基本一致。重组质粒在不同IPTG浓度和不同温度条件下诱导表达产物的SDS-PAGE分析结果显示,低浓度0.4 mmol/L IPTG和30 ℃诱导能有效减少菌体蛋白的本底表达。用纯化的重组蛋白连续免疫小鼠,4周后得到抗血清,经Western-blotting检测,其具有很好的特异性。微生物结合实验表明,重组表达的pET-LGBP具有较强的生物活性,其与丹麦啤酒酵母、巨大芽孢杆菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、大肠杆菌等均有结合能力。     

三疣梭子蟹快速生长品系核心种质有效群体含量

三疣梭子蟹是我国海水养殖的重要种类之一,良种选育核心种质的繁衍与更新是制约品种选育成功的技术瓶颈。根据Doyle和Talbot提出的计算有效群体含量的计算公式,对2008年三疣梭子蟹快速生长品系核心育种群有效群体含量进行估算,得出实际群体有效含量为213,实际近交系数为0.002 3,其近交系数较小,近交衰退控制在较低的水平。但三疣梭子蟹保种数量和留种方式仍然困扰育种群体控制,因此,借鉴畜禽的保种模式,从留种方式、雌雄比例、保种数量等方面对三疣梭子蟹快速生长品系核心基础群进行保种研究。结果表明,采用随机留种,雌雄1∶1比例交尾,雌雄数量各131只,此保种模式既能保证三疣梭子蟹快速生长品系核心基础群遗传多样性处于较高水平,使其具有较大的选育潜力,又能使保种成本维持在一个合理水平。此研究模式也为理论保种模式,需要在以后的实际群体选育过程中逐步完善。     

血卵涡鞭虫单克隆抗体的制备与初步应用

用血卵涡鞭虫可溶性抗原免疫BALB/c小鼠,经常规融合、间接ELISA方法筛选,将所得阳性克隆再经3次亚克隆后,共获得3株针对血卵涡鞭虫的单克隆抗体(2B₂、3G₄、4G₇),单克隆抗体亚类鉴定表明,三者为IgG类抗体。用筛选的杂交瘤细胞株制备小鼠腹水抗体,其细胞上清及腹水效价分别为5.12×10^-4和8.00×10^-4。进一步利用单克隆抗体建立间接荧光抗体方法对单抗特异性进行鉴定,阳性虫体被染上黄绿色荧光,而正常梭子蟹血淋巴则未被染色。用单克隆抗体和多克隆兔抗血清以羊抗鼠HRP-IgG为酶标抗体,建立了检测血卵涡鞭虫的双抗体夹心ELISA方法,该方法对血卵涡鞭虫阳性标本检测符合率为100%。结果表明,制备的单克隆抗体效价高、特异性好,可用于血卵涡鞭虫的早期临床诊断。