雄性不育基因对棉花的遗传转化

利用TA29、A6、A9三启动子功能区与barnase基因融合构建的不育基因以农杆菌介导法对棉花下胚轴进行了遗传转化,通过胚状体途径获得了转基因再生植株.利用150 mg·L-1高浓度卡那霉素(Km)对转化初期筛选出的再生苗进行再次筛选,提高了转化株的选出率.通过PCR检测和Southern dot blot分析从转基因胚状体再生植株中获得了带有barnase不育基因的120株转基因植株.进行转基因植株生物学性状检测和观察表明,所获得的转基因植株对溴苯腈表现出了明显的抗性,并从不育基因转化植株中筛选出了具有明显不育特征的雄性不育株.     

Cre/loxP定位重组系统在植物雄不育和杂种优势中的利用研究

Cre—loxP是来源于噬菌体P1的一种位点特异性重组系统。目前，它已广泛应用于基因功能鉴定，动植物及微生物基因组的修饰以及基因的表达和调控。雄性不育系在杂种优势的利用中具有重要意义。本实验是以Cre—loxP系统调控细胞毒素基因barnase在植物雄性器官发育的特异时期在特异组织表达，从而达到控制植物育性的目的。1．在本实验中，通过PCR方法克隆了解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens的barnase基因，及其抑制因子barstar的DNA序列，同时，构建成功双元表达载体及基因枪转化载体，并已获得经分子险测呈阳性的小麦植株。2．osg6B是来源于水稻花药绒毡层的特异性的启动子，它在小孢子发育的四分体时期至单核花粉期在花药绒毡层中特异启动基因的表达，它具有较为严紧的时空特异性。以osg6B为启动子，构建了一组受控于Cre／loxP位点特异性重组系统的适用于基因枪法转化小麦的载体系统。其中，转不育基因(og6B—barnase)小麦植株生长正常，但开花后，花粉量明显减少，自交不能得到正常种子。进行花粉活力检测发现，转基因小麦大部分花粉表现为败育。花粉离体萌发试验表明，转不育基因小麦的花粉离体萌发率极低，几近败育。说明以osg6B驱动barnase在小麦花药中的表达可以导致雄性不育。3．以osg6B为启动子，构建了一组受控于Cre／loxP的用于控制双子叶植物育性的双元表达载体系统。以转cre基因的烟草作为受体，以含阻断序列的质粒农杆菌进行二次转化。二次转化株营养生长正常，但开花期花器官表现异常。具体表现为花瓣异常开裂或不开裂，花丝变短或粘连，花药提早萎蔫或异常开裂。推测这种现象的出现与启动子的组织特异性或barnase的渗露表达有关。4．二次转化株花粉染色因不同株系出现全部败育、部分不育和多数可育的情况。花粉离体萌发实验也得到了相似的结果。这说明通过筛选，利用Cre／loxP得到完全不育的植物株系是完全可行的。5．获得了9个barnase的突变体，初步推测第十四位氨基酸及第八十位氨基酸与核糖核酸酶活性有关。同时，发现barnase的第316位核苷酸序列为易突变位点，自然发生的突变多插入一个C，从而产生终止位点的改变。这或许会为今后barnase的克隆与利用提供一些参考。     

光敏核不育水稻存在BT型等位不育基因及其遗传关系的研究

农垦58s及其转育于不同遗传背景的光敏核不育水稻与BT型不育水稻六千辛A和寒丰A杂交,得到的F_1植株完全不育,证明农垦58s不育的2对隐性基因中有1对来源于农垦58,即为与BT型水稻等位的不育基因.由此推论农垦58s源于农垦581个基因位点的突变,而它的光敏不育性则为此突变基因和原有不育基因重叠作用的结果.当用作光敏不育的恢复亲本原已存在或不存在BT型水稻不育基因,决定了它们杂种F_2代的可育株和不育株呈3:1或15:1不同的比率分离.     

CRISPR/Cas 9基因编辑技术降低贵州禾株高研究

为获得株高降低的贵州禾水稻新种质,以贵州禾高秆糯稻材料黎平杂边禾为研究材料,根据CRISPR/Cas 9靶位点设计原则设计水稻OsGA20ox2基因的特异性靶点sgRNA序列,构建水稻OsGA20ox2基因的CRISPR/Cas 9定点突变载体,利用农杆菌介导的愈伤转化法遗传转化黎平杂边禾,通过潮霉素筛选,以及PCR分子检测,获得16株转基因植株。对筛选获得的转基因植株基因进行测序,获得7株OsGA20ox2基因靶位点被编辑的突变转基因植株。研究表明,T_1代突变体植株株高比黎平杂边禾降低了29.6%。     

水稻短光敏不育基因(rpms4)的遗传分析及初步定位

为了深入研究水稻短光敏不育基因,以D38S为母本,华占为父本构建了一个F_2分离群体,对短光敏不育基因控制的遗传规律进行分析。利用集团分离分析法(bulked segregant analysis, BSA)筛选多态性SSR标记,并在多态性标记附近增加标记引物筛选,将获得所有多态性SSR标记对含有248个单株的D38S×华占杂交得到F_2群体进行定位分析。D38S×华占的F_1代植株在南昌早季镜检花粉育性表现正常,自然结实率也正常。对248个F_2群体单株进行育性调查,统计短光可育株与短光不育株分离比,发现短光可育株与短光不育株数分离比符合3:1的分离比,因此可以推测D38S的短光敏不育性状遗传模式符合受1对隐性核基因控制模式。该研究利用集团分离分析法(BSA)从均匀覆盖水稻染色体基因组的3 600对SSR中筛选到7对与该不育基因连锁的标记。利用D38S×华占的F_2群体和7对SSR标记,将短光敏不育基因定位于水稻1号染色体,位于标记RM3442与RM6339之间,遗传图距均为1.2 cM,将该短光敏不育新基因命名为rpms4。本研究为进一步精细定位和克隆rpms4提供了科学依据。     

花粉特异性核糖核酸酶基因诱导籼稻特性不育及其遗传研究

以水稻愈伤组织和悬浮细胞系作为基因枪转化的外植体，把水稻花粉特异性基因ＰＳ１启动子与ｂａｒｎａｓｅ构成的嵌合基因导入籼稻，获得籼稻五个品种Ｂａｓｍａｔｉ－１，青油占，胜优２号，明恢复６３，新山占２９的转基因植株。试验以两个质粒ＰＳ１－ｂａｒｎａｓｅ和ｐＩＬＴＡＢ２２７共转化的方法，以潮霉素Ｂ作为筛选因子，选择抗性愈伤及再生植株。     

棉花核不育系豫98-8A育性遗传分析

为了阐明1999年从转基因后代遗传群体中发现的1株雄性不育植株不育基因的遗传规律及其与现有不育基因的等位性,采用表型观察测量,以及经典的自交和测交手段,研究了该不育材料败育性状的遗传规律。花器官形态特征调查表明：不育株花柱长和花柱外露长度均明显高于同质系的正常可育株,而每朵花的子房直径及花药数量没有明显差异。遗传分析表明：杂合体可育株自交,后代不育株与可育株呈3:1分离,不育株与杂合姊妹可育株测交,不育株与可育株呈1:1分离,表明该核不育材料受隐性单位点控制;与阆A(msc1)、洞A(msc3)等育性位点杂合可育株分别杂交,其F1代单株育性均得到恢复。由其F1代产生的F1:2家系中均出现不育株与可育株呈1:3和7:9两个育性分离群体,表明该材料败育基因为不同于阆A、洞A的不育基因位点。     

玉米自交系18-599(白)转化受体体系的建立和转barnase基因植株的获得

以抗病优质综合性状优良的玉米自交系18-599（白）为试材,优化其遗传转化受体体系,并进行了barnase基因的转化。结果表明,在基于N6和MS培养基的8个方案中,N6-4培养基是转化受体系统建立的最佳培养基;幼胚的最佳接种长度为1.6 mm;用于转化的幼胚愈伤组织继代次数最好控制在5次之内。利用18-599（白）优化受体体系进行了barnase基因的基因枪转化,用除草剂Basta作筛选剂,其致死浓度为8 mg L^-1,3轮筛选的Basta浓度依次为6、8和6 mg L^-1。对转化植株的分子检测和大田不育性状观察表明,获得了转barnase基因的雄性不育18-599（白）转化植株。     

不同世代太谷核不育小麦对花药成株的影响

通过对太谷核不育小麦杂交一代可育株和不育株,及二、三、四代可育株花药的离体培养,结果表明:1.不育株花药培养能够获得植株再生;2.杂交一代的可育株花药出愈率最高,绿苗分化率亦最高;3.基因型对花药出愈率和绿苗分化率有明显的影响.     

根癌农杆菌介导籼稻遗传转化影响因素研究

研究了抗生素种类、继代和菌液浓度对农杆菌介导籼稻转化的影响，并将反义蜡质基因导入4个高产、直链淀粉含量高的籼稻品种中。结果显示，羧苄青霉素的抑菌效果优于头胞霉素，其适宜浓度为250～350mg/L；4个品种继代愈伤比初代愈伤能获得更高的抗性愈伤得率；各个品种转化有其最佳的农杆菌菌液浓度（OD600值），茉莉新占和绿黄占为1．0，粤香占和矮秀占为0．6。应用此优化的农杆菌转化体系，我们得到了转化植株；PCR扩增和Southem杂交结果证明外源基因已经整合到转基因水稻的基因组中。     

一个水稻雄配子不育基因MGA1(t)的遗传及表达特征分析

在水稻转基因材料后代中筛选到一个自交后代标记基因呈1:1异常分离的雄配子不育突变体(暂命名为Male gametophyte abortion1,mga1(t))。该突变体花粉约50%败育,花粉败育表型与T-DNA共分离,且只能通过雌配子传递,表明mga1(t)是一个T-DNA插入引起的雄配子败育突变体。Southern blot分析表明,mga1(t)为单拷贝T-DNA插入突变体。侧翼序列分析发现T-DNA插入在水稻3号染色体上一个Bax inhibitor(BI)-1 like家族蛋白基因的5’非翻译区,该基因可能与细胞程序性死亡有关。RT-PCR表达分析显示MGA1(t)基因在水稻不同生长发育期均有表达,尤其在长度发育为0～7mm的颖花中强表达,表明该基因是一个水稻雄配子优势表达基因。     

利用花粉管通道法将叶片衰老抑制基因PSAG12-IPT导入普通小麦的研究

利用花粉管通道法将叶片衰老抑制基因PSAG12-IPT导入普通小麦品种西农1376,经PCR﹑GUS组织化学染色﹑点杂交和Southern杂交分析,证明带有特异启动子的目的基因已整合到5个植株的基因组中,且在大部分转基因植株中能够稳定遗传。通过叶片细胞分裂素含量﹑叶绿素含量﹑叶片衰老进程及农艺性状分析,初步证明PSAG12-IPT基因在     

水稻育性调控相关基因RNAi载体的构建及其表型鉴定

利用RNAi干扰技术研究不同基因对花粉发育、卵细胞发育和合子胚发育的影响是一种重要的手段。本研究通过筛选水稻在生殖发育过程中的9个重要调控基因,构建基因的RNAi表达载体,分析转基因植株育性及相关性状表型,以期探明RNAi表达载体对靶标性状的干扰效应。其中,AT61~AT63、AT64~AT66、AT67~AT69表达载体分别靶标花粉育性、卵细胞发育以及合子胚发育的调控。结果表明,除RNAi表达载体AT64没有获得转基因植株外,其余8个RNAi表达载体均获得了转基因植株;对T0代转基因植株的花粉育性、结实率以及潮霉素筛选(40 mg/L)发芽率检测的统计结果显示,RNAi表达载体AT62(花粉发育调控)、AT65(卵细胞发育调控)和AT67(合子胚发育调控)的干扰效应较强。本研究结果将为创制新型水稻基因工程不育系提供策略和选择。     

花粉致死基因ZmAA1对玉米遗传转化的研究

为了研究花粉致死基因ZmAA1的功能,进而创制转ZmAA1基因玉米不育新材料。在Gen Bank中找到花粉致死基因ZmAA1及启动子Pg47,并在目的片段的上下游设计増加酶切位点,基因合成构建到克隆载体puc57上,采用传统酶切连接的方法构建了植物表达载体pCAMBIA3300-Pg47-ZmAA1-35S-bar,并利用农杆菌介导法转化优良玉米自交系郑58萌动胚。成功构建植物表达载体pCAMBIA3300-Pg47-ZmAA1-35S-bar;共获得94株除草剂抗性植株,其中47株目的片段PCR呈阳性反应,对温室中表现为花粉败育的PCR阳性植株进行目的片段及筛选标记bar基因RT-PCR与蛋白免疫学试纸条检测,结果表明,花粉致死基因ZmAA1及启动子Pg47已经整合到玉米基因组并表达。     

Characterization of transgenic male sterility in alfalfa

Dependable male sterility would help to make hybrid cultivar development a reality in alfalfa once higher levels of heterosis are attained. Alfalfa plants obtained by genetic transformation with a construct containing the Barnase gene under the control of a tobacco anther tapetum specific promoter were studied. Vacuolization and degeneration of the tapetal cell cytoplasm at a premeiotic stage of development were observed in all five transformed plants (T₀)examined, but the severity of the abnormalities varied greatly among pollen sacs of a genotype. During the meiotic stage, some pollen sacs showed reduction in size, and the tapetum generally appeared thinner when compared to those of the non transgenic plants; tapetal cells showed abnormal vacuolization and signs of cytoplasm degeneration. Despite this, some microspores were formed and some pollen grains were shed in all the T₀ plants, but these were highly variable in size and had very low in vitro germinability. Self-fertility was negligible. The T₀ plants were crossed with one or two unrelated non transgenic male-fertile plants. Mendelian segregation was observed with two exceptions. Instability of the trait in F₁ progenies was noticed, varying for different T₀ parents. F₁ plants exhibiting higher sterility than the primary transformants were observed, indicating that it should be possible to obtain good male sterile plants by backcrossing this trait into different genetic backgrounds. The possible use of this transgenic male sterility in alfalfa breeding is briefly discussed. This revised version was published online in July 2006 with corrections to the Cover Date.     

通过组织培养获得棉花不育株

棉花（ＧｏｓｓｐｉｕｍｈｉｒｓｕｔｕｍＬ．）体细胞培养获得的再生植株中存在很大差异,其中育性变异表现最突出,在１９９０～１９９１年培养再生的植株中发现９个不育株,其中１株雌雄全不育,形态上表现高大紧凑,花器小,畸形,柱头四裂,电镜观察表明其它粉粒空瘪,内容物少,另２株为雄性不育,电镜观察发现其花粉粒外壁发育不良。用鄂荆１号做父本与其杂交,Ｆ１代值株均不育,鄂荆１号回交ＢＣ１不育株与可育株呈１：１分     

棉花雄性不育研究和应用进展

综述了棉花雄性不育类型、不育机理和雄性不育系杂种优势利用状况,着重讨论了棉花雄性不育的细胞学、生理生化和分子生物学研究进展。并对本领域研究和应用中存在的问题及发展前景提出了看法。     

水稻‘陆18S’核不育基因连锁的分子标记

为了研究水稻不育基因的遗传机理和连锁情况,利用‘陆18S’与3个父本杂交,并对F2进行花粉育性和结实率观察和遗传分析,同时对F2后代进行RAPD分子标记。通过遗传分析得知,‘陆18S’不育系由1对隐性核基因控制。通过分子标记的筛选,找到了与‘陆18S’雄性不育紧密连锁的RAPD标记S490,片段大小为850 bp。获得与不育基因紧密连锁的RAPD标记。为不育基因克隆、定位奠定了坚实的基础。     

水稻体细胞无性系雄性不育突变

对5个类型的水稻不育系进行了幼穗培养, 在红源A、 包源A和W6154s中, 共获得了10例雄 性不育变异株, 水稻花粉败育可分为无花粉、 典败、 圆败和染败四种类型。 发现了不育 花粉败育类型之间可以相互转换现象。 对雄性不育变异株用一批现有CMS不育系的保持系和恢复系进行测交和回交, 有的变异株其 恢保关系发生了变化,