哺乳动物体细胞手工克隆研究进展

采用化学去核和无透明带技术相结合,对哺乳动物卵母细胞进行处理,使通过该方法获得的去核无透明带卵母细胞作为受体,进行体细胞核移植,从而获得克隆动物。该方法完全避免了传统核移植的显微操作及其繁琐程序,是纯粹的手工克隆,它的成功将会大大简化核移植程序,提高核移植总效率,同时提高核移植的生产力。论文对手工克隆的研究进展,手工克隆的机理,手工操作的体细胞核移植方法及影响手工克隆的因素进行综述。     

猪卵母细胞化学辅助手工去核及手工核移植胚胎发育能力因素的研究

本研究在筛选猪化学辅助手工去核最佳脱羰秋水酰碱(Demecolcine,DC)浓度的基础上,探讨了各种因素对手工重构胚发育的影响,以期建立高效的猪手工体细胞核移植技术体系.观察不同成熟时间卵母细胞在不同DC浓度下的去核效率,并进一步比较了化学辅助手工去核法和荧光染色去核法、不同类型的供体细胞(颗粒细胞、新生巴马肌肉成纤维细胞和胎儿成纤维细胞)和供体细胞的不同处理方法(70％～80％汇合、血清饥饿法和100％接触抑制法)对重构胚发育能力的影响.结果表明:(1)利用DC诱导去核,对体外成熟培养44 h的卵母细胞以浓度0.4 μg· mL-1作用0.5～1 h为宜.(2)用DC化学辅助手工去核与用荧光染色去核的重构胚囊胚发育率差异不显著(13.11％ vs 9.25％,P＞0.05).(3)以胎儿成纤维细胞、颗粒细胞和新生巴马小型猪肌肉成纤维细胞为供体构建的重构胚的融合率、卵裂率及囊胚率均差异不显著(P＞0.05).(4)用70％～80％汇合(对照组)组、接触抑制组和血清饥饿组的细胞作供体构建的重构胚,在融合率上,接触抑制组显著高于对照组(P＜0.05);在分裂率与囊胚率上,各组之间均无显著差异(P＞0.05).研究结果表明,化学辅助手工去核法在实际生产中可以替代荧光染色去核法,能省去去核过程中荧光染色及紫外光照射去核等步骤,从而简化了猪手工体细胞核移植程序,提高了猪手工体细胞核移植效率,能为高效的猪手工体细胞核移植技术体系的建立提供参考.     

手工克隆生产猪胚胎关键技术的改进研究

手工克隆(handmade cloning,HMC)是在传统克隆技术的基础上发展出的一种体细胞核移植技术,作为纯手工操作技术,每一步骤的操作细节都影响着HMC的效率及重构胚胎发育能力.本试验针对HMC生产克隆猪胚胎的3个关键步骤:透明带消化、手工切割去核与无透明带重构胚的体外培养展开研究.结果显示,猪卵母细胞透明带以3...     

改进的表面张力辅助去核法对小鼠卵母细胞去核的研究

为了探讨改进的小鼠表面张力辅助去核法（STA）的可靠性，本试验用改进的表面张力辅助去核法与表面张力辅助去核法对小鼠卵母细胞进行去核操作，比较其去核操作效率。结果发现，改进的表面张力辅助去核法能显著减少去核操作时间，去核率与表面张力去核法无显著差异。改进的小鼠表面张力辅助去核法是一种适用于小鼠卵母细胞操作的快速、简单、实用的去核方法。     

小鼠胚胎干细胞密度梯度离心去核法

在细胞松弛素B的参与下，通过Ficoll密度梯度离心法可有效制备小鼠无核ES细胞，在适宜条件下，悬液培养中40％的小鼠ES细胞可发生去核作用，经Hoechst染色和形态观察确定：80％的去核ES细胞在30min内可恢复其原有形态，但其生活力不会超过48h，这为研究ES细胞的胞质功能及核质互作效应提供了一种可行的细胞去核方法。     

手工克隆小鼠胚胎的研究

与传统克隆相比,手工克隆使用较为简单的仪器设备和技术操作即可生产克隆动物。小鼠作为模式实验动物在多领域得以应用。本研究中采用杂交胎鼠细胞系提供核供体细胞,在含细胞松弛素(Cytochalasin B,CB)和链蛋白酶(Pronase)及2%血清的M199 hepes缓冲液滴(CBMP)中消化透明带并切割去核,电融合后1 h,重构胚置于含Sr Cl2及CB(5μg/m L)的无钙体外培养液(Ca2+-free IVC)中激活6 h,体外培养液(IVC)中清洗3遍后,移入WOW系统培养,培养至小鼠HMC囊胚阶段。研究发现:1)CBMP液中Pronase的浓度相比20μg/m L和100μg/m L,卵母细胞透明带在10μg/m L组需要更长时间消化至消失,较有利于操作;2)直流电(DC)80 V,持续40μs,融合率达60%。3)含10 mmol/L Sr Cl2的化学激活液处理的重构胚与5mmol/L组相比,囊胚更高(29±3%∶13±3%,P0.05),差异显著;4)两种体外培养液,CZB与m PZM,在IVC囊胚率上无显著差异(29±3%∶24±5%,P0.05),而使用CZB可获得较高的囊胚率。本实验首次采用HMC方法体外条件下生产小鼠克隆胚胎,通过摸索透明带消化时间、电激活参数、化学激活试剂及培养液,尝试小鼠体外生产克隆胚胎的新方法,并取得了初步成果,技术优化及效率提高问题仍需要更进一步的研究。     

卵母细胞去核方法在动物体细胞核移植中的应用研究

受体卵母细胞去核是核移植过程中至关重要的一步,几种去核方法已在核移植技术中得到应用。为了达到完全去核的目的,荧光染料和紫外光被应用在去核方法中,但同时也带给母源胞质负面影响。末期和化学辅助去核也得到应用,但不同的方法对受体卵母细胞的影响不同,导致不同的后期胚胎发育结果和不同的克隆效率。作者综述了不同的卵母细胞去核方法在动物克隆中的效率及它们各自的优势和缺陷。     

影响奶牛体细胞手工克隆技术因素的研究

旨在优化奶牛的手工体细胞克隆技术方案,本试验以牛卵母细胞为材料研究了2个半卵不同粘合交流电压、重构胚不同激活方法和不同的COCs采集方法对奶牛手工体细胞克隆胚发育的影响.结果表明,(1)降低2个半卵粘合交流电压能显著提高其随后的卵母细胞融合率(P<0.05);(2)A23187+6-DMAP组激活的无透明带重构胚分裂率和囊胚率显著高于Ionomycin+6-DMAP组(P<0.05);(3)真空蠕动泵抽吸法和刀片切割法获得的卵母细胞总数显著高于注射器抽吸法(P<0.05),而切割法获得的1和2级卵母细胞百分数显著高于其它2种方法(P<0.05).因此,采用真空蠕动泵抽吸法获得COCs,用较低的粘合交流电压进行半卵粘合,采用A23187+6-DMAP激活法进行融合后的激活能显著提高奶牛手工体细胞克隆效率.     

细胞松弛素B浓度对小鼠卵母细胞去核效果的影响

目的　探讨细胞松弛素 B浓度对小鼠卵母细胞去核效果的影响。方法　常规超排 KM小鼠获卵母细胞 ,将有明显第一极体的卵母细胞放入含有 5× 10 - 3、1× 10 - 2 、2× 10 - 2 g/ L CB的成熟培养液中孵育 15 min,采用盲吸法去核 ,去核后的卵母细胞放入含 5× 10 - 3g/ L Hoechst33342的成熟培养液中染色 15 min,在荧光显微镜下检查去核的效率。结果　 CB组去核率可达 88.2 % ,而对照组去核成功率仅达 2 9.7% ,两者的去核效果统计学上有显著差异 ;同时 CB的浓度过高会影响去核的效果 ,使卵母细胞的破溃率升高。结论　 CB有利于去核 ,同时卵胞膜可以借助磷脂双层的游动性而很快得到修复 ;高浓度的 CB对卵胞膜作用过于强烈 ,细胞骨架严重破坏 ,磷脂双层结构的弹性和粘性减弱 ,修复能力降低 ,影响胚胎的构建。     

猪去核无透明带卵母细胞电融合参数的探讨

试验通过采用不同场强、电场时程和脉冲次数对去核的猪体外成熟卵母细胞电融合参数进行比较研究,观察细胞融合情况。结果表明,在电场时程30 μs、1次直流脉冲（DC）的情况下,电场强度0.8 kV/cm 时卵母细胞的融合率为94.7%,显著高于其他各组（P<0.05）;当电场强度为0.8 kV/cm、1次直流脉冲的情况下,电场时程60和90 μs时,卵母细胞融合率为86.5%和83.8%,差异不显著（P>0.05）,但显著低于30 μs时的电融合效率（P<0.05）;在电场强度为0.8 kV/cm,电场时程为30 μs的情况下,1次电脉冲激活卵母细胞的融合率（94.7%）和2次电脉冲的融合率（95.6%）无显著差异（P>0.05）,但两者显著高于3次电脉冲的融合率（81.7%）（P<0.05）。通过对各组进行比较,在电场强度为0.8 kV/cm、电场时程为30 μs、1次直流脉冲的电刺激可以对体外成熟的猪卵母细胞取得较好的融合效果。     

5-Aza-CdR对德保黑猪手工克隆重构胚胎体外发育效果的影响

为了探讨5-氮杂-2'-脱氧胞苷（5-Aza-CdR）对德保黑猪手工克隆（HMC）重构胚胎体外发育效果的影响,本研究分别从供体细胞和重构胚入手,比较了5个不同处理浓度（0、5、10、20和40 nmol/L）5-Aza-CdR处理HMC重构胚的体外发育效果,筛选最佳处理浓度;在最佳浓度下比较5个不同处理时间（0、24、48、72和96 h）对HMC重构胚的体外发育效果,筛选最佳处理时间;用4个不同浓度（0、0.25、0.5和1 μmol/L）5-Aza-CdR结合最佳浓度和最佳时间处理供体和重构胚,比较其体外发育潜能。结果显示,与空白对照组相比,5、10、20和40 nmol/L 5-Aza-CdR处理72 h对重构胚卵裂率均无显著差异（P>0.05）,20 nmol/L 5-Aza-CdR处理能显著提高重构胚的囊胚率（P<0.05）,10和20 nmol/L 5-Aza-CdR处理均能显著提高囊胚细胞数（P<0.05）,其中以20 nmol/L 5-Aza-CdR效果最佳;与空白对照组相比,利用20 nmol/L 5-Aza-CdR处理HMC重构胚72 h能显著提高重构胚的囊胚率和囊胚细胞数（P<0.05）,其余处理时间对重构胚卵裂率、囊胚率和囊胚细胞数均无显著影响（P>0.05）;在囊胚的最佳处理浓度（20 nmol/L）和最佳处理时间（72 h）下,结合供体的4个处理浓度（0、0.25、0.5和1 μmol/L）,同时处理重构胚和供体,各处理组HMC重构胚的发育潜能均有提高,但效果均不显著（P>0.05）,其中0.25~0.5 μmol/L 5-Aza-CdR处理效果较佳。综上表明,适宜浓度（0.25~0.5 μmol/L）的DNA甲基化酶抑制剂5-Aza-CdR处理供体细胞72 h并结合20 nmol/L 5-Aza-CdR处理重构胚72 h均能有效提高德保黑猪HMC重构胚胎的体外发育潜能,该结果可为今后研究德保黑猪HMC胚胎DNA甲基化调控机制提供参考。     

水牛活体采卵和无透明带胚胎培养体系的优化

本研究旨在探索哺乳动物体外受精（IVF）胚胎单独或少量培养时发育效率低、无透明带胚胎的体外发育潜能受阻的问题,以期建立提高水牛活体采卵（ovum-pick-up,OPU）和徒手克隆（handmade clone,HMC）胚胎发育潜能高效稳定的体外生产体系。研究首先比较了单个微滴内共培养的胚胎数量（1、3、5、10和20枚）对胚胎发育效果的影响;而后采用微穴体系（well-of-the-well,WOW）和辅助共培养体系（培养微滴中添加包埋IVF胚胎的琼脂糖小块）培养OPU-IVF胚胎,并用WOW体系培养无透明带的徒手克隆重构胚,与传统的微滴培养体系比较其体外发育效果。结果表明：单个微滴内培养的胚胎数量为1、3和5枚时,囊胚发育率极显著低于10枚和20枚组（P<0.01）;与微滴培养体系相比,辅助共培养和WOW体系均极显著提高OPU-IVF胚胎的囊胚率（P<0.01）,且WOW培养体系极显著促进HMC重构胚的卵裂率和囊胚率（P<0.01）。综上所述,胚胎群体培养有助于胚胎发育,在保证系谱明确的前提下琼脂糖包埋辅助胚胎共培养体系和WOW体系提高了OPU-IVF体外胚胎发育效率,且WOW体系还可用于无透明带胚胎的高效培养。     

Optimization of in vitro Culture System for Embryos Derived from Ovum-pick-up and Zona-free Embryos in Buffalos

The purpose of this study was to explore the problems of low development efficiency of small amounts in vitro fertilization (IVF) embryos and limited development potential of zona pellucida-free embryos when cultured in vitro of mammals,to establish an efficient and stable in vitro production system for improving the developmental potential of living ovum-pick-up (OPU) and handmade clone (HMC) embryos in buffalos.The study first compared the effect of the number of fertilized eggs (1,3,5,10 and 20) co-cultured within a single microdroplet on the embryonic development effect.Then,OPU-IVF embryos were cultured using the well-of-the-well (WOW) system and the auxiliary co-culture system (adding agarosaccharide fragments of embedded in in vitro fertilization (IVF) fertilized egg in the cultivation of microdroplets).Furthermore,the embryos without zona pellucida were cloned and reconstructed by using the WOW system and compared with the traditional microdroplet system in vitro.The results showed that the blastocyst development rates of the 10 and 20 embryos groups were significantly higher than that of the 1,3 and 5 embryos groups.Compared with the microdroplet system,the assisted co-culture system and the WOW system significantly improved the blastocyst rate of OPU-IVF embryos(P<0.01).Moreover,the WOW culture system significantly promoted the cleavage rate and blastocyst rate of HMC reconstructed embryos(P<0.01).To sum up,embryo mass culture contributed to embryo development,and under the premise of ensuring a clear pedigree,the agar-sugar embedding assisted embryo co-culture system and the WOW system improved the in vitro development efficiency of OPU-IVF embryos,the WOW system would also be applied to the high-efficient culture of zona pellucida free embryos.     

Development to Term of Fused and Partially Enucleated Mouse Two-Cell Embryos

Contents: After the blastomeres of mouse two-cell embryos were fused by electric pulses within the zona pellucida, one nucleus of the fusion products was removed following the enucleation method described by McGrath and Solter (1983a, 1983b). 38% (196/520) of the fused embryos were enucleated successfully when Whitten's medium was used as enucleation medium and 434 of 1007 (43%) of the embryos when M 2 was used. 30% (47/159) of the partially enucleated embryos cleaved during their in vitro cultivation but only 3% developed to the morula or blasto cyst stage. 20 young (17%) were born after the transfer of 120 fused and partially enucleated two-cell embryos to 8 pseudopregnant recipients. It was shown that fused and partially enucleated two-cell embryos are able to survive and are able to reach adulthood, although their developmental rate is significantly lower than that of control embryos .
Here we report experiments for the examination of the developmental capacity of two-cell mouse embryos partially enucleated after fusion .     

小鼠去透明带裸卵的体外受精及其胚胎发育

为了建立提高小鼠弱精子体外受精率的新方法 ,将小鼠宰杀在 2 0℃下搁置 14 h,然后取出附睾尾精子进行冷冻保存。用解冻后活力明显下降的精子 ,与去透明带裸卵进行体外受精。结果显示 ,与带有颗粒细胞卵的体外受精率(0 % )和透明带切开卵的体外受精率 (4%～ 31% )相比 ,去透明带卵的体外受精率增至 39%～ 6 8% (P<0 .0 1) ;体外受精所获的 2细胞胚 ,经培养有 74 %～ 10 0 %的胚胎发育至扩张囊胚 ;来自 BDF1雄性小鼠精子的 2细胞期体外受精胚 ,经体外培养至囊胚期后再移植 ,获得了正常新生小鼠。以上结果表明 ,去透明带裸卵与小鼠弱精子体外受精 ,可提高小鼠弱精子的利用率     

免胚胎细胞核移植重组胚的发育力

以兔为模型 ,对影响胚胎细胞核移植重组胚发育力的电融合与激活参数、体外培养系统进行了探索性研究。结果表明 ,有利于重组胚发育力的适宜电融合与激活参数为 2 0 0 V/ m m的电场强度、10 0μs的脉冲宽度 ;在不同的体外培养系统中 ,TCM- 199培养液内于兔胎儿成纤维细胞饲养层 (REF feeder)上共同培养的重组胚获得了最高的 2～ 4-细胞发育率和桑椹胚或囊胚的发育率 ,分别为 6 5 .7%和 2 2 .9%;移植 111枚重组胚给 9只假孕母兔 ,其中 2只妊娠 ,1只完成足月妊娠产出 2只克隆仔兔 ,另 1只在妊娠 2 2 d流产 1只克隆死胎。     

秋水仙碱化学去核对山羊卵丘细胞核移植胚胎体外发育的影响

研究旨在探讨秋水仙碱化学去核在山羊卵母细胞去核中的应用及其对卵丘细胞核移植胚胎体外发育的影响。结果表明:用秋水仙碱处理山羊体外成熟19h的卵母细胞,可使其核区形成胞质突起,以此为指示进行显微操作去核率可达100%,且用0.8μg/mL秋水仙碱处理30min的山羊卵母细胞突起率可达91.27%,显著高于对照组及0.4μg/mL处理组(P<0.05),与1.6μg/mL处理组的突起率差异不显著(P>0.05)。通过比较盲吸去核法与秋水仙碱化学去核法构建的山羊卵丘细胞核移植胚胎的体外发育能力发现,秋水仙碱化学去核法构建的重构胚体外发育能力较高,桑椹胚发育率显著高于盲吸去核法(P<0.05)。     

卵母细胞核因子促进核移植四倍体胚胎早期发育研究

研究旨在探讨猪卵母细胞核因子在重编程过程中发挥的作用。将体细胞引入未去核的MⅡ期卵母细胞中,构建体细胞核与卵母细胞核共存的核移植四倍体胚胎。通过分析核移植四倍体胚胎的早期发育情况探讨卵母细胞核因子对核移植四倍体胚胎早期发育的影响。结果显示,核移植四倍体胚胎、孤雌二倍体胚胎及孤雌单倍体胚胎这3组胚胎的卵裂率极显著高于核移植二倍体胚胎（P<0.01）,且核移植四倍体囊胚率及总细胞数也极显著高于核移植二倍体囊胚（P<0.01）。与通过标准核移植程序构建的核移植二倍体胚胎相比,核移植四倍体胚胎具有更强的发育能力。本研究建立了一个体细胞核与完整卵母细胞核因子物质共存的四倍体胚胎模型,有助于研究供体核与卵母细胞核之间的联系,为研究核因子在重编程过程中发挥的作用提供了平台。