亚麻木质素合成相关基因COMTRNAi表达载体构建及转化

以已经克隆到亚麻木质素合成关键酶咖啡酸-O-甲基转移酶基因(COMT)全长cDNA序列为基础,通过扩增RNAi顺式及反式片段(均为249 bp),先连接到中间载体pBSK,再连接表达载体pCAMBIA-1301-multi,构建成COMT基因的RNAi表达载体,通过农杆菌介导转化亚麻,获得转基因植株,通过GUS染色和PCR检测,表明干扰载体已经转入亚麻中。这为推进亚麻纤维品质改良的分子育种提供了基础。     

利用mRNA差别显示技术分离红树植物许树耐盐相关cDNA

选用适应甜土种植10余年的红树植物许树分株,在室内分别以盐水与自来水进行沙培.分别提取叶片的总RNA.通过oligo（dT）12CA反转录合成cDNA第1链,以此为模板,用4组10核苷酸随机引物与锚引物o1igo（dT）12CA组成的引物对,进行PCR扩增,选择差异表达片段,发现3个稳定的差异cDNA只存在盐水培养下许树叶片中,而自来水培养条件下却没有.这3个差异cDNA片段分别命名为colb1,colb2,colb3.对3个cDNA采用DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter KitI进行RNA杂交检测,只有colb1在盐培许树叶中呈现稳定的显色信号,在自来水浇灌的许树叶中却无显色信号,colb2和colb3均无显色.可见colbl（463 bp）是耐盐相关cDNA.将片段colb1克隆,并进行序列分析,其AT碱基对占全序列的61.74%.将序列提交NCBI进行BLASTN和BLASTX查询,未发现相关同源cDNA.耐盐相关cDNA的获得将为分离全长耐盐基因和其耐盐机制的研究奠定了基础.     

外源诱导提高茶树新梢EGCG含量过程的相关基因分离

以福鼎大白茶为试验材料,用荧光标记的mRNA差异显示技术,研究外源诱导物ID1在诱导提高茶树新梢EGCG含量过程中基因转录水平的变化,分离相关基因片段。从诱导茶树芽叶及对照中分离出18个差异显示的cDNA片段,反向Northern杂交显示其中5个片段可能是来自差异表达基因的转录产物,其中编号DD2、DD9、DD12、DD16为诱导表达上调片段,编号DD3为诱导表达下调片段。将这5个片段克隆于pGEM T-Easy载体,酶切鉴定结果显示载体以及插入的特异片段。序列测定表明,DD12的cDNA片段出现未识别码。通过NCBI网站(http:/www.ncbi.nlm.nih.gov)作Blast序列同源性分析。结果表明,DD2的差异cDNA片段与烟草的硫氧还蛋白过氧化物酶的基因序列同源;DD3的差异cDNA片段,是茶树一个RAPD产物(AJ516005.1)的一段序列,功能未知;DD9的差异cDNA片段与拟南芥、莲子的NADH脱氢酶具有很高的同源性;DD16的差异cDNA片段未能找到与之同源的基因序列,可能为新基因。     

大豆疫霉根腐病菌诱导下SSH文库构建及初步分析

大豆疫霉根腐病是危害大豆生产的毁灭性病害之一,研究利用抑制性消减杂交技术(Suppression Subtractive Hybridization,SSH)成功构建了疫霉菌诱导的大豆抗病品种绥农10差异表达的cDNA消减文库,从文库中共筛选到2 067个阳性克隆,PCR鉴定插入片段大部分集中在100～800 bp之间,利用BLAST在GenBank数据库进行序列相似性比对,获得有功能的EST375个,分析表明这些EST功能涉及大豆的抑制病原菌生长、细胞自身保护、信号传导、系统获得抗性、蛋白质合成、呼吸作用等.     

水稻对不同小种稻瘟菌抗性差异表达基因的鉴定

 以同一水稻品种接种不同小种稻瘟菌，利用抑制消减杂交（SSH）技术构建水稻 稻瘟菌非亲和/亲和互作消减cDNA 文库。 经差异筛选、序列分析及RT PCR验证，共获得25个独立的差异表达cDNA克隆。根据与它们同源基因的功能推测，这些cDNA克隆可能参与了对病原菌的防卫反应、转录和蛋白合成与修饰等一些重要的生物学过程。通过RT PCR检测了差异表达基因在非亲和/亲和互作早期的表达谱，所有被检测基因在非亲和/亲和互作零点的表达水平均相同，而在接种后的其他时间点，它们的表达在互作反应中或被诱导或被抑制，说明这些表达的变化仅仅与接种的不同小种有关，肯定了所分离到的基因及其表达变化的可靠性。受不同小种病原菌侵染后，由于一些参与防卫反应的基因被诱导或被抑制的程度和持续时间的不同可能导致水稻小种特异的抗性。     

亚麻CAD基因克隆及反义表达载体的构建

本试验以亚麻(Linum usitatissimum L.)品种Argos为材料,分离了高纯度的RNA.用简并引物以RT-PCR的方法,克隆了亚麻CAD基因cDNA部分序列,长度为477bp,构建了pGEM-T-CAD质粒.用限制性内切酶EcoR I酶切pGEM-T-CAD质粒和载体pGEM-7Zf(-),进行连接,构建成中间表达载体pGEM-7Zf(-)-CAD质粒.用限制性内切酶Xba I和BamH I双酶切中间表达载体pGEM-7Zf(-)-CAD质粒和pBI121栽体,进行连接,构建了亚麻CAD基因反义植物表达载体pBI121-antiNTCAD.     

巴西橡胶树磷酸蔗糖磷酸化酶基因的克隆和表达模式分析

蔗糖是橡胶生物合成的主要碳源,而磷酸蔗糖磷酸化酶(SPP)是蔗糖合成最后步骤的关键酶,克隆橡胶树SPP家族基因并研究其表达特性,将有助于揭示橡胶树中蔗糖合成代谢的分子调控.本研究利用拟南芥和杨树的SPP氨基酸序列为探针,搜索橡胶树EST和基因组数据库,并设计引物进行PCR扩增,得到1个橡胶树SPP基因的cDNA和基因组序列,命名为HbSPP1.序列分析显示,HbSPP1基因组含有8个外显子、7个内含子,其cDNA序列的编码区(CDS)为1278 bp,编码424个氨基酸,蛋白分子量为48.1 ku,等电点为6.02.进化上,HbSPP1基因与杨树SPP基因的亲源关系比拟南芥要近.组织特异性表达分析发现,HbSPP1在叶片中的表达丰度最高.另外,在叶片不同发育阶段中,HbSPP1在稳定期叶片中的表达明显低于幼期叶片.     

甘蔗茎全长cDNA文库构建及EST序列分析

在利用改进的Oligo-capping法构建1个高质量的甘蔗茎全长cDNA文库基础上,对该文库进行大规模测序,获得了283条5'端有效EST序列,平均长度为459 bp,经聚类和拼接获得204个假定独立转录本(TUTs),冗余序列所占比例27.9％.NCBI同源比对分析结果表明,其中132条EST拼接的103个TUTs与已知功能基因具有较高的同源性,结合拟南芥功能基因分类标准对这些TUTs进行分类,可分为12类,以参与蛋白质合成的基因最多,其次为细胞结构、蛋白质降解和贮藏、转录等类型的基因.     

甘蓝型油菜矮化突变体抑制消减cDNA文库 的构建及初步分析

采用抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization, SSH)技术，以甘蓝型油菜矮化突变体“NDF-1”为实验方（tester），野生型“3529”为驱动方（driver）构建植株差异表达的抑制消减cDNA文库。所建cDNA文库的插入片段大小主要集中在100 bp~1000 bp之间。斑点杂交筛选得到了32个阳性克隆，序列测定和同源性对比分析表明，其中的12个克隆功能未知，其余涉及到激素信号转导、第二信使、光合作用、脂肪酸代谢及衰老等多个方面。还对部分差异表达基因的功能进行了分析。为进一步认识油菜植株矮化的机理奠定了基础。