鸽新城疫病毒分离株F0裂解位点的基因克隆及序列分析

为探索鸽新城疫的流行特点,在分子水平上阐明鸽新城疫病毒分离株与鸡新城疫毒株之间的相互关系,我们用RT-PCR技术获得了分离株FO裂解位点附近300bp的基因片段,将其克隆到pUC19载体上得到一重组克隆pNDV21,序列分析表明,插入片段与鸡新城疫强毒Texas相应区域的同源性为87.7%;而与弱毒株D26/76及La Sota的同源性分别是91.7%和98%.其FO裂解点的氨基酸顺序为Giy Arg-Gln-Gly-Arg.证明该分离株属于新城疫弱毒.     

新城疫病毒河北分离株F基因的克隆与序列分析

通过RT-PCR技术扩增和克隆2003—2007年由河北省分离到的、具有一定代表性的鸡新城疫病毒分离株F基因,与GeneBank中已发表的NDV不同基因型代表株F基因相应核苷酸片段及其氨基酸序列进行比较,构建系统发育进化树并确定分离株的毒力强弱及所属基因型。结果显示,分离株在该区段没有碱基缺失和插入,但有多处点突变分散存在。分离株F基因核苷酸序列与国内外已发表毒株相应序列核苷酸同源性为80.5%~98.5%,推导的氨基酸序列同源性为77.5%~97.7%。表明目前河北新城疫的流行以基因Ⅶ型为主,同时兼有传统的基因Ⅵ型和基因Ⅱ型。     

鸽新城疫病毒分离株的分子基础和免疫学研究报告

用电镜技术对鸽新城疫病毒分离株进行了形态学鉴定，ＡＧＰＣ法提取病毒的ＲＮＡ，反转录后用ＰＣＲ方法扩增到该分离株Ｆ０裂解位点附近的３００ｂｐ的基因片段。序列分析表明：该分离株与鸡新城疫强毒Ｔｅｘａｓ的同源性为８７．７％，而与弱毒株Ｄ２６／７６及Ｌａｓｏｔａ的同源性分别为９１．７％和９８％；证实其Ｆ０裂解位点的氨基酸顺序为Ｇｌｙ－Ａｒｇ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ，属于新城疫弱毒。将分离毒株接种无新城疫母源抗体的９日龄鸡胚制成油乳苗，每只幼鸽接种０．２５ｍｌ，成年鸽接种０．５ｍｌ，１０天后即可产生坚强的免疫力，保护率达１００％，免疫效力可维持６个月。     

鸽源新城疫病毒陕西分离株P基因的克隆及序列分析

【目的】对鸽源新城疫病毒(NDV)陕西分离株P基因进行克隆和序列分析,为研究P基因及V基因的功能奠定基础,并为防治新城疫提供科学依据。【方法】参考GenBank发表的NDV基因序列设计1对特异性引物,RT-PCR扩增NDV/Pigeon/ShX/China/2003P基因的全长片段,并进行克隆、序列测定和分析。【结果】NDV/Pigeon/ShX/China/2003P基因全长1 451 bp,其完整的ORF长度为1 188 bp,编码395个氨基酸。同源性比较可知,NDV/Pigeon/ShX/China/2003与其他分离株P基因的核苷酸序列同源性在63.6%~92.9%,推导的氨基酸序列同源性在67.7%~92.2%。系统发育进化树表明,NDV/Pigeon/ShX/China/2003与鸽源分离株P68亲缘关系最近,与F48E9和La Sota毒株处于进化树的不同分支。【结论】NDV/Pigeon/ShX/China/2003与国内外已报道的NDV毒株间存在较大变异。     

2株不同来源的新城疫病毒的F基因克隆和序列分析

以1株从发病鸽中分离到的新城疫病毒(PNDV／99株)和1株从发病鹅中分离到的新城疫病毒(GNDV／00株)为研究对象，用反转录—聚合酶链式反应(RT-PCR)对它们的F基因进行分段扩增、定向克隆到pUCll9质粒载体，然后测定它们的核苷酸序列，并推导出相应的氨基到序列。PNDV／99株和GNDV／00株的F基因全长1662bp，编码553个氨基酸，它们的裂解位点的氨基酸序列为112G-R-Q-G-R-L117，是NDV弱毒株特有的序列结构。序列分析结果表明，它们2株之间的核苷酸同源率高达99．28％，氨基酸同源率则为100％；它们与国内标准毒株F48E9的核苷酸同源率只有87．48％和87．36％，氨基酸的同源率都为91．68％；而它们与弱毒株La Sota的核苷酸同源率别为98．50％和98．74％，氨基酸同源率都为98．73％。     

鸽新城疫病毒分离鉴定

从病死美国鸽脾脏分离到１株病毒,经血凝抑制试验（ＨＩ）和电镜观察,确诊为新城疫病毒（ＮＤＶ）。采用ＳＰＦ鸡胚和ＳＰＦ鸡测定其致病指数分别为：ＭＤＴ＝６１．４,ＩＶＰＩ＝２．５３,ＩＣＰＩ＝１．６８,属于强毒株,该毒株经滴鼻／点眼途径可在９６ｈ致死６周龄非免疫鸡并出现典型的新城疫病变和症状,鸽子攻毒试验同样出现了新城疫症状和病变,超过鸽子产生高滴度的ＨＩ抗体。     

新城疫病毒山东分离株F和HN基因克隆与进化分析

选取山东2007 ～ 2008年的5株NDV流行株,克隆融合蛋白(F)和血凝素-神经氨酸酶(HN)基因全长并测序.结果表明,5个分离株F基因长度为1662 bp,编码553个氨基酸.F蛋白裂解位点的氨基酸序列均为112 R-R-Q-K-R-F117,符合强毒株F基因裂解位点的氨基酸序列特征.对F基因47 ～420 nt序列进行比对,发现4株鸡源毒株基因型为Ⅶd,另一鸽源毒株基因型为Ⅵ.5个分离株间F基因核苷酸和氨基酸序列同源性分别为88.8％～99.7％和94％～99.3％,与LaSota、Clone30、F48E9的氨基酸同源性分别为88.4％～89.5％、87.7％～88.8％、90.8％～92.4％.HN基因长度为1801bp,编码571个氨基酸,5个毒株均含13个半胱氨酸残基且位置保守.与LaSota的氨基酸同源性为87.2％～88.8％,与8个山东NDV流行株的同源性为89.8％～98.6 ％.     

鸽新城疫病原的分离与鉴定

应用SPF鸡胚从送检发病鸽的脑、脾脏组织分离到 6株病毒 ,结合流行病学、临床症状、病理解剖变化、病原分离、鸡胚病变特征、病毒含量测定、分离病毒回归鸽试验、分离病毒电子显微镜形态学观察和HA与HI血清学试验证明近年来新疆鸽群中广泛流行的疫病为鸽新城疫 ,其病原为鸽新城疫病毒。     

肉鸽新城疫病毒山东分离株的分离鉴定及其F基因的分子特性分析

从山东某发病肉鸽的体内分离到一株新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV),命名为Pigeon-Shandong-JN-08(简写JN08),对其融合蛋白(fusion,F)进行序列和分子特性的分析,以了解肉鸽NDV的遗传起源和分子特性。JN08经病毒蚀斑克隆纯化后动物回归试验可产生典型的NDV病变。研究结果发现,F蛋白多肽裂解位点的序列为112RRQKRF117,符合鸽源NDV强毒氨基酸基序。F基因分型及同源性比较显示:JN08与绝大多数鸽源毒株同属于基因Ⅵ型;其F基因与基因Ⅱ型毒株LaSota,B1,Bingham,TEX-48氨基酸同源性为89.9%,89.7%,90.4%,89.7%,与基因Ⅰ型毒株Ulster67的氨基酸同源性为91.3%,与基因Ⅲ型传统强毒F48E9的氨基酸同源性为92.8%;与国内鸽分离株P1-03,CH98-98,JS1-06,PB01-96和GZ-07的氨基酸同源性分别为91.3%,94.6%,94.8%,95.1%,94.0%;与国外鸽分离株Capital3-97,Tigre6-99,1166-02,IT227-97,2736-00,NY-84,TX3503-04,248VB-98的同源性分别为96.2%,93.8%,98.0%,96.8%,97.1%,96.8%,96.8%,98.4%。从F基因遗传进化树上发现:JN08与国外分离株的遗传距离较近,处于同一基因亚型上,而与国内分离株的遗传距离较远。     

鸽新城疫病毒及危害

鸽新城疫是由鸽Ⅰ型副粘病毒(PPMV-Ⅰ)引起的一种高度接触性传染病,该病传播迅速,流行期长,发病率与死亡率极高,严重危害了养鸽业的发展。就鸽Ⅰ型副粘病毒的病毒结构、分类地位2个方面的研究进行了简要综述,并且分析了鸽新城疫疾病的危害与防治中存在的问题,以供参考。     

新城疫病毒中国株F48E9融合蛋白基因序列分析

该研究经全自动序列测定,获得了新城疫病毒中国株Ｆ４８Ｅ９融合蛋白（Ｆ）基因１８３８ｂｐ的ｃＤＮＡ核苷酸序列,并推导出编码５４９个残基的氨基酸序列。序列分析表明,该序列中有６个潜在的糖基化位点,１３个半胱氨酸残基,裂争位点区氨基酸序列为Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ｇｌｎ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ｐｈｅ。同源性分析表明,新城疫病毒中国株Ｆ４８Ｅ９融合蛋白（Ｆ）氨基酸序列与国外发表的其他新城疫病毒株Ｆ蛋白相比,同源性在９６．１７％～９２．１６％之间。     

鸡新城疫病毒洛阳分离株HN基因的克隆和序列分析

应用RT PCR技术从新城疫病毒洛阳分离株中扩增HN的cDNA片段,并将其克隆至pMD18 T载体进行核苷酸序列测定。结果表明:新城疫分离株HN基因片段长度为1716bp,编码571个氨基酸;推测出的氨基酸序列中有5个糖基化位点,12个半胱氨酸残基;与国内外的14株新城疫毒株HN基因相比,核苷酸和氨基酸同源性分别为66.4%~98.5%和87.8%~98.3%;与标准毒株Lasota和Clone30的亲缘关系较远,核苷酸和氨基酸差异性较大,而与天津分离株和云南分离株的亲缘关系较近,基本属于同一基因群。     

鸽新城疫病毒及鸽痘病毒血凝特性及HA试验技术参数研究

为研究鸽新城疫病毒(PNDV)和鸽痘病毒(PPV)的血凝特性,同时为2种病毒的血凝试验(HA试验)提出技术参数,分别采用鸡和鸽红血细胞(RBC),在不同反应介质和条件下进行病毒血凝试验。结果表明:①PNDV既能凝集鸡RBC,又能凝集鸽RBC,而PPV只凝集鸡RBC;②PNDV对0.5%鸡RBC血凝价比对1%鸡RBC血凝价高1~2个稀释度,而PPV对0.5%鸡RBC血凝价比对1%鸡RBC血凝价高5个稀释度;③PNDV和PPV对鸡RBC的HA凝集强度呈线性变化,而PNDV对鸽RBC的HA凝集强度呈非线性变化;④进行PNDV和PPV的HA试验的理想技术参数为:用0.5%鸡RBC,以0.89%生理盐水或pH 7.4 PBS为反应介质,PNDV于37℃作用30 m in时转至室温观察,重复观察应于35 m in内结束,而PPV应于37℃作用30 m in观察,观察后迅速放回37℃,重复观察应于10 m in内结束。     

鸡新城疫病毒地方株F基因的扩增克隆与鉴定

应用RT-PCR技术对分离自发病鸡群的新城疫病毒(MDV)的F基因进行了扩增，结果得到0．81d)的扩增产物。将该扩增产物克隆至pMD18-T载体中，经酶切和PCR鉴定后，证明与设计的目的片段完全相符，从而用分子生物学的方法确定了常规实验室诊断的正确性。     

一株新城疫病毒分离株全基因组序列的克隆与分析

根据GenBank上所公布的新城疫病毒(NDV)的全基因组序列,设计了10对引物,运用RT-PCR方法获取了三黄鸡新城疫病毒(SHJ00株)全基因组序列,并对其进行了比较分析。结果表明:此株三黄鸡新城疫病毒(SHJ00)的全基因组序列由15 192个碱基组成,在NP基因和P基因之间的非翻译区多了6个核苷酸ACACTC;与NDV一致,SHJ00基因由6个ORF组成,即3′-NP-P-M-F-HN-L-5′;测序后拼接的F基因长1 672 bp,包含完整的开放阅读框(1 662 bp),编码553个氨基酸,F蛋白裂解位点的氨基酸顺序为112R-R-Q-K-R-F117,具有强毒株序列特性;根据NDV基因分型标准,三黄鸡新城疫病毒SHJ00株归属基因Ⅶ型新城疫病毒;F基因与国内外NDV代表株的核苷酸同源性为80.9%~97.7%,其中与F48E9同源性为84.3%,与Lasota的同源性为82.0%;测序后拼接的HN基因长为1 716 bp,编码571个氨基酸,与国内外NDV代表株的核苷酸同源性为80.0%~98.1%,其中与F48E9同源性为84.5%,与Lasota的同源性为81.4%。     

一株新城疫病毒F基因的克隆及序列分析

以PCR扩增新域疫病毒JZ05株的F基因,并进行克隆和测序.采用DNAssist序列分析软件将JZ05毒株,基因与另外18个NDV毒株F基因序列及其氨基酸序列进行比对分析.测序结果表明.NDV JZ05株F基因产物F0蛋白酶裂解位点(111~117位)的氨基酸序列为GRRQKRF.与18个NDV毒株F蛋白的氨基酸序7,1对比,半胱氨酸残基数目和位置完全一致;仅NDV JZ05株发生单个氨基酸残基变更的有5处;而其F蛋白细胞融合活性位点中的一些保守氨基酸残基都没有发生变更.10个毒株(Ch98、Ch2000、YN、JZ05、JS01、GD05、SCL03、SSX03、Lye01、TW)之间全长氨基酸序列的同源性均在96%以上,这10个毒株与3个疫苗毒株(LaSota、B1、Clone30)的同源性在88.07%～89.51%.     

鸽新城疫病毒的分离鉴定

用SPF鸡胚从疑似鸽新域疫病鸽群中分离到1株病毒，该病毒株能凝集鸡红细胞，这种凝集作用能被抗新域疫病毒阳性血清抑制。血凝素热稳定指数为1min，具有快速血凝素的解脱率，病毒对氯仿、乙醚、胰蛋白酶、盐酸(pH5.0)敏感，0.1％甲醛溶液能完全灭活病毒。分离株经肌肉注射能使鸽发病和死亡，出现与自然发病鸽一致的症状和病变。对该分离株作进一步生物学特性鉴定，鸡胚平均死亡时间(MDT)为74．6h，1日龄雏鸡脑内接种致病指数(ICPI)为1．53。结果表明本分离株为强毒型鸽新域疫病毒。     

运用锚引物扩增新城疫病毒鹅源分离株基因组末端序列

在T4 RNA连接酶的作用下,将人工合成的锚引物直接与新城疫病毒（NDV）鹅源毒株ZJ1株的基因组5′末端的反转录产物及NDV基因组3′末端直接相连,然后用聚合酶链反应（PCR）和RT－PCR分别快速扩增基因组5′末端和3′末端,测序结果表明：3′末端的Leader序列为55nt,5′末端的trailer序列为114nt。将该序列与GenBank报道的NDV鸡源毒株的相应序列相比,XJ1株与6个鸡源NDV毒株的Leader和trailer序列的同源性分别为83.6%-92.7%和60.5%-63.2%。序列比较结果表明：该鹅源毒株与鸡源毒株在基因组3′端调控区有较高的同源性,而在基因组5′端的调控区同源性则较低。     

鸽Ⅰ型禽副粘病毒F基因克隆及序列分析

利用ＲＴ－ＰＣＲ技术获得了编码鸽Ⅰ型禽副粘病毒ＧＤ－Ｐ１分离株Ｆ０裂解位点附件８８４ｂｐ的Ｆ基因ｃＤＮＡ片段,并将其克隆到ｐＧＥＭ－Ｔ Ｅａｓｙ质粒中,获得了重组质粒Ｔ－ｐＰＭＶ－Ｆ－Ｉ,核酸序列测定和分析表明,该片段与新城疫病毒强毒株Ｆ４８Ｅ９和ＨＥＲ／３３相应区域的同源性分别为８７．５％和８８．１９％,与新城疫病毒弱毒株ＬａＳｏｔａ和Ｂ１株的同源性分别为８３．８３％和８４．１５％。该病毒Ｆ０裂