一种茶枝致病菌的分离鉴定及致病力分析

采用形态学和分子鉴定方法确定采自建德市大同镇茶园茶枝的致病菌为镰刀菌Fusarium incarnatum与茶炭疽菌Colletotrichum fructicola,鉴定并报道F. incarnatum为茶树致病菌。龙井43和中茶108离体叶片及茎秆用于两种病原菌致病力分析试验,结果显示,F. incarnatum对龙井43嫩叶及茎秆具有较强侵染力,是造成该茶枝茎秆病害的主要致病菌,并且可能与C. fructicola共同侵染茶树叶片。因此,在今后茶树病害识别与防控方面需要密切关注。     

茶树CsAAPs亚家族基因的克隆与表达分析

采用RT-PCR技术,从龙井43中成功克隆了5个茶树AAPs（Amino acid permeases,氨基酸通透酶）基因。氨基酸序列比对结果表明,5个CsAAPs亚家族蛋白的序列同源性较高,为70.27%。根据氨基酸序列同源性构建系统发育树,结果显示5个CsAAPs分属3组。生物信息学分析表明,CsAAPs均含有9~10个跨膜区域和16~18个AAP保守基序。为了研究该亚家族对氮素的响应情况,选用3个茶树品种的扦插苗为试验材料,氮饥饿两周后,分别供应不同浓度的NH₄NO₃,然后利用qRT-PCR对CsAAPs在不同组织、氮素水平及茶树品种中的表达情况进行分析。研究发现CsAAPs在营养组织中均有表达,但是存在一定的组织表达差异,其中CsAAP3在茎中表达量最高,CsAAP8的主要表达部位为根和茎。在给氮素饥饿处理的茶苗从新供氮之后,CsAAP3的基因表达在3个氮素利用效率不同的品种间差异较大;在氮高效品种中茶302茎中表达的CsAAP3和CsAAP8,可以快速地对低氮条件做出响应,在低氮处理3 h后,基因表达水平明显增加。此研究预示着CsAAPs亚家族在茶树体内可能通过复杂的氨基酸转运参与氮代谢调控。     

质子泵在不同氮素形态调控茶树磷素吸收的功能研究

磷是植物生长发育的重要矿质营养元素之一,不同氮素形态均影响植物对磷素的吸收。植物细胞膜H⁺-ATPase在矿质营养元素吸收过程中具有重要调控作用,因此不同氮素形态调控茶树磷素吸收可能与细胞膜H⁺-ATPase相关。本研究采用二相分离法提取茶树根系质膜,并通过非损伤微测（NMT）、Western-blot等技术探究不同氮素形态对舒茶早根系磷素吸收和细胞膜H⁺-ATPase特征参数的影响。结果表明,铵态氮提高茶树对磷素的吸收;其茶树根系细胞膜电位、H⁺跨膜运输、H⁺-ATPase活性和蛋白表达均高于硝态氮处理;且细胞膜H⁺-ATPase专一抑制剂正钒酸钠（Na₃VO₄）显著减少不同氮素形态下茶树根系对磷素的吸收和富集。由此可见,茶树根系H⁺-ATPase可能参与不同氮素形态调控磷素的吸收。     

茶树CsMDHAR基因的克隆与非生物胁迫响应分析

基于茶树转录组数据,以龙井43茶树cDNA为模板,克隆得到开放阅读框（ORF）长度为1β305βbp,编码434个氨基酸的茶树单脱氢抗坏血酸还原酶基因,命名为CsMDHAR。蛋白序列特征和基因表达模式分析表明,CsMDHAR蛋白含有FAD结合功能域,属于FAD依赖的吡啶核苷酸-硫基氧化还原酶（Pyr-redox-2）家族。该蛋白有两个无序化区域,而且包含有32个磷酸化位点,理论相对分子量为47.21βkDa,pI为5.99,属于亲水性蛋白;CsMDHAR蛋白二级结构以α-螺旋和随机卷曲为主。通过PlantCARE和PLACE对启动子上游调控元件进行分析预测,结果显示,CsMDHAR基因启动子上游1β000βbp中含有多个与光、激素以及植物抗逆有关的顺式作用元件。利用荧光定量PCR方法检测龙井43和迎霜的CsMDHAR、CsAO和CsAPX在4种不同非生物胁迫下的表达水平,结果表明,在低温（4℃）胁迫下,两个茶树品种的CsMDHAR、CsAO和CsAPX的表达均受抑制,且品种间的差异较小;在高温（38℃）和干旱（200βg·L^-1 PEG）胁迫下龙井43中的CsMDHAR表达均上调,分别在8βh和2βh时达到最大值,为对照的1.49倍和1.85倍;盐（200βmmol·L^-1 NaCl）胁迫下,CsAO和CsAPX在两种茶树品种中的表达量变化趋势相似,但变化幅度不同,可能与品种间不同的抗逆性有关。     

茶树cpDNA测序及基于cpDNA序列的山茶属植物亲缘关系研究

叶绿体基因组在物种鉴定、系统进化分析及亲缘关系研究等领域应用前景广阔。本文应用Illumina高通量测序技术对龙井43（Camellia sinensis cv. Longjing 43）的叶绿体全基因组进行测序;利用叶绿体trnL-trnF序列研究茶树及其近缘植物的亲缘关系。结果表明,龙井43叶绿体基因组全长为157 096 bp,反向互补重复区（Inverted repeat, IR）为26 080 bp,小单拷贝区（Small single copy region, SSC）、大单拷贝区（Large single copy region, LSC）分别为18 283 bp、86 653 bp。共注释叶绿体基因133个,其中蛋白编码基因86个,rRNA基因8个,tRNA基因39个。对所选植物的trnL-trnF序列进行比对,序列长度变异范围为481~501 bp,序列最长为岔河大茶,最短为金花茶,基于此序列构建亲缘关系树,山茶属茶组植物聚成一个组。研究结果对茶树优良品种培育及山茶属植物亲缘关系的研究具有重要价值。     

生物质炭配施氮肥对茶树生长及氮素利用率的影响

通过水泥池小区试验,采用¹⁵N同位素示踪技术,研究了生物质炭配施氮肥对茶树生长及氮素利用率（茶树吸收、土壤氨挥发、N₂O和土壤残留量）的影响。结果表明,与不施生物质炭且不施氮肥（B₀N₀）处理相比,施氮能促进茶树的生长发育,茶树株高、树幅和基部径粗均显著增加,茶叶增产68.06%~112.63%。生物质炭对茶叶产量的影响因施氮量而异,在不施氮（N₀）和减量化施氮（N₁）条件下,配施生物质炭处理茶叶产量增加8.82%和8.75%,而常规施氮（N₂）条件下配施生物质炭处理茶叶产量略有降低,但差异均不显著。与B₀N₀处理相比,施氮处理土壤氨挥发和N₂O排放量显著增加;在N₁条件下,配施生物质炭（B₁N₁）处理氨挥发和N₂O累积排放量分别降低了5.87%和4.99%;在N₂条件下,配施生物质炭（B₁N₂）处理氨挥发和N₂O累积排放量分别降低了9.97%和11.41%,B₁N₂处理氮素减排效果更好。与单施氮肥处理相比,配施生物质炭均能增加茶树各器官氮含量、¹⁵N丰度和Ndff值,有利于茶树对氮素的吸收利用。与单施氮肥处理相比,配施生物质炭处理茶树¹⁵N利用率和¹⁵N残留率分别增加了0.46~3.93百分点和4.09~14.37百分点,¹⁵N损失率下降4.54~18.30百分点,其中B₁N₁处理效果优于B₁N₂处理。总体而言,生物质炭配施氮肥促进了茶树对氮的吸收,增加土壤氮素持留,并降低氮素气态损失,从而提高了氮素利用率,以减量化施氮配施生物质炭（B₁N₁）处理茶树能起到“减氮增产”效果,具有良好的应用前景。     

采摘标准与施氮水平对茶树春茶产量、品质及氮素利用的影响

为探讨田间不同生产方式对茶园产量、茶叶品质及茶树对氮肥吸收利用的影响,采用微区¹⁵N示踪技术,研究了不同采摘标准（一芽一叶和一芽三叶）和氮肥施用水平（200、450 kg·hm^-2）下茶树春季新梢产量、品质成分和¹⁵N氮素吸收利用等变化。结果表明,新梢产量主要受采摘标准影响,一芽三叶的产量是一芽一叶的1.8~2.1倍,氮肥用量对春季新梢产量影响不显著;采摘标准对氨基酸含量特别是对茶氨酸等品质成分的影响大于施氮水平,以N2水平（N 450 kg·hm^-2）下采摘一芽一叶的含量最高;成熟叶含氮量从初冬到春茶结束呈下降趋势,说明叶片内氮素在春茶期间发生再利用,但其肥料氮占全氮的比例（Ndff）在增加,可能是氮素吸收和再利用的共同结果;供氮水平对新梢Ndff的影响大于采摘标准,而新梢采摘的氮携带量主要受产量影响,低氮条件下新梢¹⁵N回收率最高。本研究表明,采摘标准和施氮量对茶园产量、茶叶品质及茶树对¹⁵N氮素的吸收分配产生影响,但两个氮肥水平都能基本满足不同采摘标准下茶树对氮素的需求。     

不同茶树品种聚硒能力研究

选取安康地区的6个主栽茶树品种,通过人工加硒的水培盆栽和土培盆栽试验,采用氢化物原子荧光光谱法测定整株茶树叶片的硒含量,以便从中筛选出聚硒能力强的适栽茶树品种.结果表明:水培条件下的聚硒能力依次为:龙井43>中茶108>紫阳群体种>陕茶1号>乌牛早>龙井长叶;进一步对不同茶树品种进行土培验证,其聚硒能力依次为:中茶108>龙井43>紫阳群体种>陕茶1号>乌牛早>龙井长叶.结果表明,同一培养条件下,中茶108和龙井43聚硒能力相对较强,紫阳群体种和陕茶1号次之,乌牛早和龙井长叶相对较弱.本研究旨在为聚硒茶树品种的高效利用提供参考依据.     

早生优质适制名优绿茶新品种--中茶108选育研究

随着名优茶生产的迅速发展,生产上对适制名优茶的品种需求越来越迫切,中国农业科学院茶叶研究所通过系统育种方法从龙井群体种中先后育成了早生、优质、高产绿茶新品种龙井43、龙井长叶和中茶102,深受广大茶农欢迎,并在生产上发挥了积极作用,特别是龙井43,取得了显著的经济效益。但龙井43也存在着抗病性较差等不足之处,为了对其进一步改良,应用辐照育种新技术对龙井43等6个品种的插穗进行辐照处理,再经过单株筛选、株系鉴定、品比试验等育种程序,从龙井43辐照处理插穗的扦插苗中选育出了早生、优质、抗病、适制名优绿茶的新品种——中茶108。     

秋茶光合作用与品质成分变化的分析

以茶树品种龙井43为材料,测定8月19日和9月23日不同时间点茶树冠层处光强、叶片温度、光合参数、品质成分含量及品质成分合成基因表达,初步明确光强、叶片温度对秋茶光合作用及三者对秋茶品质成分积累和相关合成基因转录水平的影响。结果表明,秋茶叶片温度以及叶肉细胞光合活性是影响净光合速率的关键原因,并且叶片温度可能通过调控儿茶素合成基因CsPAL、CsF3′5′H、CsANS、CsUFGT及氨基酸合成基因CsGS、CsGOGAT、CsTS1表达来影响秋茶茶多酚、氨基酸含量。另外,秋茶冠层处光强和净光合速率与部分品质相关合成基因的表达水平具有显著相关性。     

茶树CsLHTs亚家族基因的克隆与表达分析

氨基酸是茶叶的重要品质成分和氮素贮存形式,因此开展茶树体内氨基酸转运蛋白的研究尤为重要。本研究从茶树转录组中筛选得到5条茶树LHTs(Lysine histidine transporters,赖氨酸/组氨酸转运蛋白)家族基因序列,并从龙井43中成功克隆获得4个茶树LHTs基因,分别命名为CsLHT1、CsLHT6、CsLHT8.1和CsLHT8.2。对该亚家族编码的氨基酸序列的理化性质和功能结构进行预测,结果显示CsLHTs亚家族含有9~11个跨膜区;且含有与氨基酸转运相关的结构域。为了明确在不同茶树品种和氮素水平间CsLHTs基因的表达差异,本研究选用3个茶树品种的扦插苗为试验材料,水培条件下氮饥饿两周后,分别用0.2、2、10mmol·L^-1的NH4NO3进行处理。利用qRT-PCR分析了CsLHTs在不同组织间的表达情况,结果表明4个基因在茶树营养组织中均有表达。经氮素处理后,CsLHTs基因在3个氮素水平和3个品种中呈现出不同的变化规律。CsLHT1、CsLHT6和CsLHT8.2在品种间的表达差异程度高于不同氮素水平间的基因表达差异。CsLHT8.1对氮素处理有明显的响应,尤其经0.2mmol·L^-1和10mmol·L^-1的NH4NO3处理72h后,在氮高效品种中茶302根中呈上调表达,表明CsLHT8.1可能参与氨基酸由根部向地上部的转运过程。     

茶树CsCML16基因的克隆及其低温胁迫下的表达分析

类钙调蛋白CMLs(CaM-like proteins)是植物体内一类重要的钙信号转导蛋白,在抗非生物胁迫中发挥重要作用.以龙井43、福鼎大白茶和黄金芽的一年生茶树扦插苗为材料,通过低温处理(10℃和4℃)分析茶树在低温胁迫下的生理变化;通过克隆茶树类钙调蛋白CsCML16,分析其在低温胁迫下不同抗寒性茶树品种中的表达...     

茶树钙依赖性蛋白激酶基因CsCDPK17的鉴定及表达分析

钙依赖型蛋白激酶(Calcium-dependent protein kinases,CDPKs或CPKs)是植物细胞中重要的钙离子信号受体,普遍参与了植物生长发育和胁迫响应等调控过程。本研究从茶树龙井43中克隆到1条CDPK基因,经测序验证该序列包含1611bp的完整ORF,编码536个氨基酸。结合序列比对和进化分析发现该蛋白N-末端具有豆蔻酰化位点,具备钙依赖性蛋白激酶的保守结构域,并且与拟南芥AtCDPK17的同源关系最近,因此命名为CsCDPK17(Genbank登录号为:MK238482)。蛋白质理化特性分析发现其蛋白分子量为59.9kD,理论等电点pI为5.43,属无跨膜结构域的亲水性蛋白。使用水稻原生质体和烟草叶片两种瞬时表达的方法均证明CsCDPK17是细胞质膜和细胞核双定位蛋白。对克隆到的CsCDPK17上游2000bp的启动子区分析发现了多个与基因转录、光、激素(ABA、SA、MeJA等)相关的顺式作用元件。表达分析显示,CsCDPK17在成熟叶和种子中表达水平较高,而在根中的表达水平最低;在龙井43、大面白等4个品种冷驯化过程中,该基因的表达随着冷驯化过程显著上调,随着脱驯化过程下调;同时还发现CsCDPK17能够不同程度地响应低温(最高5.1倍)、干旱(最高2.3倍)、渗透(最高2.4倍)胁迫。本研究的结果表明CsCDPK17在茶树的生长发育和低温、干旱、渗透等非生物胁迫响应的过程中均发挥一定的调控作用。     

合成茶树咖啡碱相关的N-甲基转移酶基因家族的克隆及序列分析

咖啡碱是茶叶中重要的功能成分,它以黄苷为底物,以S-腺苷甲硫氨酸（SAM）为甲基供体,通过N-甲基转移酶（NMT）类催化的一系列甲基化反应合成的产物。根据NMT基因高度相似的特性,利用长片段PCR法和侧翼序列克隆技术分离了白叶一号6种NMTs的基因组DNA全长,其中有2种为已报道的茶树咖啡碱合成酶基因TCS1、TCS2,1种为假基因,另3种基因分别被命名为TCS3、TCS4、TCS5,基因结构分析发现这6种基因均由4个外显子和3个内含子组成。山茶属植物的NMTs可聚为5类,其中TCS4和TCS5为与其他基因的相似性相对较低的一类。这些结果为今后更好地从基因组水平上剖析茶树咖啡碱的遗传机制提供有用参考。     

茶树CsCIPK12与CsKIN10的互作鉴定及其表达分析

蔗糖非酵解-1相关蛋白激酶（Sucrose non-fermenting 1-related protein kinase,SnRK）在代谢调控和胁迫信号传递中发挥重要的作用。本文以茶树SnRK3亚家族的CsCIPK12基因和SnRK1亚家族的CsKIN10基因为研究对象,通过序列比对和进化分析,发现CsCIPK12和CsKIN10都具有N端激酶结构域和C端调节域;CsCIPK12具有与CBLs结合的NAF/FISL结构域,与拟南芥AtCIPK12,杨树PtCIPK17、18、19同源关系最近;而CsKIN10具有泛素相关的UBA结构域,与杨树PtSnRK1同源关系最近。通过酵母双杂交系统,证实了CsCIPK12和CsKIN10蛋白存在相互作用。表达分析发现,在自然冷驯化过程中,CsKIN10的表达模式与前期对CsCIPK12的研究结果一致,在龙井43、浙农12、大面白3个茶树品种中受低温不同程度地诱导;4℃短时低温处理发现,CsCIPK12和CsKIN10在成熟叶中受低温显著诱导（最高诱导水平分别为4倍和2.3倍）,而在新梢中,二者对低温的响应并不显著;ABA、葡萄糖以及蔗糖处理发现,CsCIPK12和CsKIN10在成熟叶中受这3种处理的显著诱导。结果表明,CsCIPK12与CsKIN10蛋白相互作用,参与ABA和糖信号途径,在茶树低温胁迫响应中可能发挥重要作用。     

小贯小绿叶蝉取食诱导抗、感茶树品种挥发物的释放

为研究不同抗性水平茶树应对小贯小绿叶蝉取食诱导的挥发物释放及相关代谢机制,以抗虫茶树品种举岩（JY）和感虫茶树品种恩标（EB）为试验材料,利用动态顶空收集法结合GC-MS技术检测茶树在小贯小绿叶蝉取食不同时间（6、12、24、36、48、72βh）释放的主要挥发物组分,并结合转录组数据分析主要挥发物合成途径上的相关基因的表达水平及其调控趋势。结果表明,在健康状态下,茶树释放的挥发性物质较少;在虫害后不同时间段的茶样中检测到顺-β-罗勒烯（β-Ocimene）、(E)-4,8-二甲基-1,3,7-壬三烯[(E)-4,8-dimethyl-1,3,7-nonatriene,DMNT]、芳樟醇（Linalool）、法尼烯（Farnesene）等10种主要挥发物。其中,单萜类物质在虫害诱导的感虫品种茶树上含量高,倍半萜类物质在虫害诱导的抗虫品种茶树中含量高。转录组数据显示,小贯小绿叶蝉取食诱导抗、感茶树品种中调控萜类合成的关键基因均被明显激活。调控单萜类物质合成的相关基因在感虫茶树品种中的表达量相对较高,而调控倍半萜类物质合成的相关基因在抗虫品种中的表达量与感虫品种差异不显著。本研究结果为茶树抗虫机制和小贯小绿叶蝉绿色防控提供一定的理论依据。     

茶树对硒吸收累积特性及其硒调控相关基因的表达分析

本文采用沙培试验,从动态角度研究了不同时间和不同浓度下茶树对硒的吸收累积规律,并分析相关基因的表达特点。结果发现,茶树不同部位对硒的累积量存在较大差异,大部分硒保留在根部,在其体内的迁移率较低,硒的累积量和外源硒浓度、培养时间显著相关;当外源硒浓度在0~0.05 mmol·L^-1时,茶树长势良好,但当浓度高于0.10 mmol·L^-1时,茶树表现出中毒症状。荧光定量PCR分析发现,转录因子CsbHLH62及茉莉酸信号途径中的关键基因丙二烯环化氧化酶基因（CsAOC）和脂氧合酶基因（CsLOX6）受到高浓度硒的诱导表达,相关性分析表明,这3个基因的表达量与根系硒含量呈显著正相关。本研究表明,茶树各部位对硒的累积与外源硒浓度和培养时间显著相关,基因CsbHLH62、CsAOC和CsLOX6可能在该过程中发挥着重要作用。