免疫鸡感染马立克氏病病毒的诊断

采用细胞培养和免疫荧光试验从河南某种鸡场已免疫马立克氏病疫苗的产蛋期发病肉种鸡中成功分离到一株马立克氏病病毒,命名为MDV/He N15。用PCR方法对其pp38、meq和g B基因进行序列分析,与Gen Bank参考序列比较发现,分离株meq和pp38基因与Ⅰ型MDV毒株的同源性分别达到99.0%~99.8%和99.8%~100%,g B基因序列与参考株GX0101序列完全一致,基因上具有强毒特征。表明在免疫过疫苗的鸡群中仍然存在MDV强毒感染的风险。     

黄羽父母代种鸡混合感染禽白血病病毒与马立克病病毒的鉴定

广西某养殖场130日龄父母代种鸡发生临床肿瘤样病变和死亡,对病鸡采用病理解剖、组织病理学观察、PCR检测、病毒分离以及分离株重要基因的序列测定和病原鉴定。结果显示:病鸡的心脏、肝脏、脾脏等部位表现有肿瘤样病变; PCR检测及病毒分离培养有J亚群禽白血病病毒(avian leukosis virus subgroup J,ALV-J)和马立克病病毒(Marek's disease virus,MDV)的感染; ALV-J分离株env基因的序列与10株ALV-J参考株的核苷酸相似性为87. 2%～97. 7%,与ALV A-E亚型参考株的相似性为53. 5%～54. 7%;与ALV-J英国原型株HPRS-103的env基因糖基化位点进行分析比较,部分糖基化位点发生了改变; MDV分离株meq基因序列与8株MDV参考株的核苷酸相似性为98. 7%～99. 4%,分离株在第71～80位氨基酸发生突变,符合国内强毒分离株的特征。结果说明:该鸡群为ALV-J和MDV的混合感染。     

ALV与MDV混合感染造成鸡群临床肿瘤暴发的诊断

2017年11月,广西某公司两个商品鸡群出现鸡只食欲不振、排绿色粪便症状。病鸡解剖发现内脏有肿瘤发生,采集肿瘤组织和外周血淋巴细胞分别进行病理组织学观察、病毒分离以及PCR鉴定,结果显示两批鸡均为J亚群禽白血病病毒(Avian leukosis virus sub-group J,ALV-J)与马立克氏病病毒(Marek′s disease virus,MDV)的混合感染。从每群发病鸡分别获得的2株ALV-J和2株MDV的基因序列测定与遗传进化树分析结果显示,4株ALV-Jgp85基因相似性为100%,均与广西分离株GX15MM6-2的亲缘关系最近,而与NX0101的距离相对较远。4株MDV之间meq基因相似性为99.0%~99.9%,其中1株与MDV标准强毒GA在同一个分支,另外3株与广西分离的MDV超强毒GXY2、GX0101距离最近且在同一个分支,都具有MDV-1型强毒株的特征。     

广西省2013~2015年ALV-J分离株gp85基因序列分析

为了解J亚群禽白血病病毒(subgroup J Avian leukosis virus,ALV-J)在广西省鸡群中的变异趋势,对2013~2015年现场分离到的8株ALV-J毒株的gp85基因进行PCR扩增、克隆、测序及分析比较。结果表明,8株分离病毒核苷酸及氨基酸序列同源性依次为92.5%~99.8%和89.2%~100%,与原型株HPRS-103的同源性依次为92.8%~98.1%和88.6%~97.1%,与国内外其他分离株的同源性为92.9%~99.9%和87.6%~99.4%。位点的有义突变和沉默突变的比例显示,除了2014年的1个分离株GX14YY17的高变区(hypervariable region 1,hr1)外,均未发现选择压对连续几年的分离株的gp85基因有明显的作用。     

40周龄三黄种鸡爆发禽白血病的诊断与病原分析

为了解鸡群中禽白血病(Avian leukosis,AL)发生的原因以及感染的禽白血病病毒(Avian leukosis virus,ALV)的亚群,研究对发病鸡进行临床诊断、病理剖检和病理组织学观察,并采集肿瘤样病变组织处理后接种DF-1细胞,培养后分别进行禽白血病病毒p27群特异性抗原ELISA检测、亚群特异性PCR检测以及亚群特异性间接免疫荧光法(IFA)鉴定,确定了40周龄三黄种鸡群感染了J亚群禽白血病病毒(ALV-J,分离株命名为GX16YL02);进一步对分离株env基因进行PCR扩增、克隆和序列测定与比较分析。结果表明:分离株GX16YL02的env基因与ALV-J英国原型株HPRS-103的核苷酸及氨基酸的相似性分别为93.9%和91.9%,与其他8株国内外参考株的核苷酸及氨基酸的相似性分别为90.7%~95.5%和89.4%~95.2%,其中gp85基因与其他参考株的核苷酸和氨基酸相似性相对较低,分别为86.9%~94.9%和85.1%~95.4%,整个env基因有义突变和沉默突变的比例分析显示,与gp37基因相比,gp85基因变异较大,尤其是免疫选择压在高变区hr1区域有一定的作用。     

三株J亚群禽白血病病毒的分离及其gp85基因序列分析

本试验从湖北省分离到3株J亚群禽白血病病毒,并通过病理解剖、DF-1细胞培养和RT-PCR进行了鉴定,分别命名为HB1002、HB1003和HB1009。根据J亚群原型毒株HPRS-103序列设计引物,扩增gp85基因并测序。序列分析表明:基因片段大小均为921 bp,与预期一致;分离到的3株病毒之间核苷酸同源性在97.7%~99.7%,氨基酸同源性在95.1%~99.0%;与原型毒株HPRS-103核苷酸序列同源性在94.1%~94.8%;与其它ALV-J核苷酸同源性在87.6%~97.3%;进化树分析表明,分离到的3个毒株与JS09GY6同源性最近,在95.2%~97.3%。     

安徽省五华鸡J亚群禽白血病病毒gp85基因分子序列特征分析

为进一步了解J亚群禽白血病病毒(avian leukosis virus subgroup J,ALV-J)gp85基因的结构、功能及其遗传变异趋势,采用PCR方法克隆了安徽省地方品种五华鸡ALV-J gp85基因序列ALV-J-WH,并将该序列与GenBank数据库中登录的15个gp85基因序列进行了比对分析。结果显示,ALV-J-WH与所比对的氨基酸序列同源性介于85.9%~96.2%之间,与其同源性最高的是来自于国内ALV-J毒株的JN378888基因序列,进化树也证实两者亲缘关系较近;此外,相对其他ALV-J gp85氨基酸序列,ALV-J-WH在223位氨基酸后有10个氨基酸的缺失;对所有全长序列分析结果表明,共有71个可变氨基酸位点,10个高度变异位点,尤其是hr1和hr2区域分布较多。结果表明,ALV-J-WH与国内部分ALV-J毒株分离gp85基因来自共同的原始病毒,但其具有独特的序列特征;ALV-J gp85基因高度易变,部分高频率突变的氨基酸位点可能是ALV-J在抗体免疫选择压下的作用位点。     

黄羽肉鸡马立克氏病病毒强毒株GX18NNM4的分离鉴定及其致瘤基因meq的序列分析

为探究黄羽肉鸡鸡群临床异常的发病原因,通过病理剖检、组织病理学观察、PCR检测、细胞培养、间接免疫荧光试验(Immunofluorescent assay,IFA)、序列测定进行病原分离鉴定。结果显示:病鸡心脏、肝脏等器官均有肿瘤样病变;常见肿瘤病病毒PCR检测呈现马立克氏病病毒(Marek′s disease virus,MDV)阳性,细胞培养病毒分离及IFA鉴定结果表明成功分离一株MDV野毒株(命名为GX18NNM4);分离株meq基因的序列分析表明,GX18NNM4与vvMDV参考株GX0101的同源性最高,其核苷酸及氨基酸相似性分别高达99.8%和99.4%,且其突变位点符合国内强毒株的特征。通过氨基酸序列分析发现GX18NNM4的两个脯氨酸重复序列PPPP发生了突变,即PPPP→PNPP,且GX18NNM4与vvMDV/vv+MDV参考株RB1B、Md5、GX0101及648A的脯氨酸发生中断的数量同在0~3的范围内。结果表明该鸡群为MDV感染。     

河南土鸡群马立克病病毒流行毒株的分离鉴定及分子进化分析

本研究旨在分离鉴定河南鸡群马立克病病毒(Marek’s disease virus,MDV)流行毒株,了解当前MDV分子进化特征并为鸡马立克病(MD)的有效防控提供参考。根据MDV基因组设计了meq、gE、gI、gB、pp38以及132-bp重复序列基因的特异性引物,应用PCR扩增和DNA测序分析对河南焦作土鸡群8份MD疑似病例进行了确诊,并通过鸡胚成纤维细胞(CEF)盲传培养和间接免疫荧光试验(IFA)分离鉴定了3个流行毒株,分别命名为HNJZ101、HNJZ102和HNJZ103。结果显示,3个MDV分离株均为血清1型(MDV-1)毒株,未发生禽网状内皮增生症病毒(REV)共感染,并且132-bp重复序列基因均为双拷贝。meq、gE和gI基因核苷酸序列比对分析发现,临床病例样本及3个MDV新分离株的meq基因与国内外温和毒或疫苗毒株的meq基因核苷酸序列同源性仅为64.7%~78.8%,但与MDV强毒株的同源性高达98.9%~100.0%;gE和gI基因的核苷酸序列同源性均较高,分别为99.1%~99.9%和99.3%~100.0%。系统发生树分析结果表明,HNJZ101、HNJZ102和HNJZ103与绝大多数此前分离的河南毒株及国内MDV强毒株同处于一个大的进化分支。研究结果表明,3个分离株HNJZ101、HNJZ102和HNJZ103很可能是当前河南土鸡群中流行的致病性MDV-1毒株,其确切的致病型及导致免疫失败的原因仍有待进一步深入研究。     

一例A亚型禽白血病病毒引起的纤维肉瘤的病理学和病毒学分析

将禽白血病A亚型（Avian leukosis virus subgroup A,ALV-A）SDAU09C3毒株人工感染SPF引起的肾脏和肝脏纤维细胞样肉瘤进行病理组织学观察,同时检测是否有其它肿瘤相关病毒感染,另外,应用PCR扩增病毒囊膜蛋白gp85基因,并对其基因编码的氨基酸序列与原攻毒株比较分析。结果显示,SDAU09C3毒株引起的肿瘤,主要为纤维细胞肉瘤,胶原纤维较少,细胞及纤维排列极不规则。病毒学检测证明发病鸡只存在ALV-A的感染,而ALV-J、马立克氏病病毒（Marek＇s disease virus,MDV）、网状内皮增生症病毒（Reticuloendotheliosis virus,REV）均为阴性。所分离的ALV-A病毒的囊膜蛋白gp85基因编码的氨基酸序列与原攻毒株同源性为99.5%。     

J亚群禽白血病病毒gp37基因的克隆和序列分析

近两年我们从国内不同省份先后分离和鉴定了8株J亚群禽白血病病毒（ALV-J），并对其中的5株进行了gp37基因的克隆和序列分析，结果表明，我们分离的5株ALV-J之间的同源性为94.6%-99.0%；与国内最早分离的SD9901，SD9902和YZ9901等毒株之间的同源性分别为95.3%-98.5%,95.6%-99.0%和94.9%-98.6%；与国际最先报道的原型株HPRS-103之间的同源性为93.4%-95.1%；与其它国外毒株的同源性为92.7%-96.8%。这表明我国ALV-J的gp37基因正在不断发生变异，但相对于gp85基因的变异性要小。     

2011年~2012年四川地区J亚型禽白血病分子流行病学调查

为了解2011年~2012年四川地区J亚型禽白血病病毒(ALV-J)流行情况及流行病毒株的分子特征,本研究采集四川地区疑似禽白血病的病料样品784份(血液样品700份,组织样品84份)进行PCR检测,并对部分样品的gp85基因进行序列测定和分析。血液样品和组织样品ALV-J检出率分别为3.1%(22/700)和14.3%(12/84)。核苷酸序列比对结果表明,18个阳性样品的gp85基因核苷酸同源性为87.7%~99.8%,与ALV-J株HPRS-103的核苷酸同源性为87.3%~98.2%,与以前分离的J亚群四川株SCGS-1的核苷酸序列同源性为87.9%~94.4%。遗传进化分析表明,18个样品分别属于不同的分支,其中来自石棉的样品SM与其他样品的遗传距离最远。该调查结果显示四川地区鸡场的ALV-J感染比较普遍,其gp85基因存在明显的遗传多样性,引种是导致这种遗传多样性的重要原因。     

一株引起90日龄三黄鸡髓细胞瘤病ALV-J的分离与鉴定

广西玉林某养殖公司送检的一批疑似感染禽白血病病毒(Avian leukosis virus,ALV)的90日龄三黄鸡表现为精神沉郁、虚弱、消瘦,至送检时发病率为0.2%,无死亡。通过临床症状观察、剖检变化以及病毒分离后细胞培养上清ALV群特异性抗原p27 ELISA检测和细胞培养物亚群特异性PCR的鉴定,从病鸡组织材料中分离到一株ALV-J并命名为GX16ZS01;进一步对其gp85基因进行克隆、测序,并与其他ALV-J参考株进行基因序列的分析与比较,结果表明分离株与ALV-J原型株HPRS-103核苷酸序列的相似性为92.7%,氨基酸序列相似性为88.6%,与其他ALV-J参考株的核苷酸和氨基酸相似性分别为91.1%~95.5%和87.9%~93.2%,其中与SD07LK1的氨基酸相似性最高,为95.5%;遗传系统进化树分析表明,该分离株与GX10YL22株的亲缘关系最近,与原型株HPRS-103亲缘关系较远,但同属ALV-J的大分支;与原型株HPRS-103的糖基化位点比较,发现分离株多出一个糖基化位点。     

伪狂犬病病毒Fa株gp63（gI） 基因核苷酸序列测定及分析

对我国最早分离的伪犬病病毒（pseudorabies virus,PRV)Fa株糖蛋白gp63(gI)基因核苷酸序列及的氨基酸序列作了测定与分析，完整的gp63(gI)结构基因从起始密码子ATG到终止密码子TGA共有1050个核苷酸残基，编码由439个氨基酸残基构成的多肽链，4种核苷酸残基的构成比分别为：G35．9％，11.33%,T11.81%,C40.95%,G C含量达76．85％，PRV Fa株gp63基因核苷酸序列与Nice株的相比，两者同源性达98．13％，仅存在3个核苷酸残基的缺失变异，氨基酸推导序列分析表明，糖蛋白gp63具有典型膜蛋白特征，与Nice株相比，同源性为97．42％，gp63基因起始密码子由3个连续的ATG组成，ATG上游区域内无启动子调控区序列。     

J、K亚群禽白血病病毒的分离和囊膜蛋白(gp85)基因序列分析

为了解现阶段我国禽白血病病毒(ALV)的流行特征和演化趋势,本试验于2021—2022年从国内某鸡场采集蛋清ALV衣壳蛋白(p27)抗原阳性的鸡血浆,接种鸡胚成纤维细胞(DF-1)分离病毒并进行亚群鉴定;采用聚合酶链式反应(PCR)技术扩增分离株的囊膜蛋白(gp85)基因片段,并对其进行测序,将基因序列与ALV不同亚群毒株进行比对和遗传进化分析;选取氨基酸变化差异较大的分离毒株进行间接免疫荧光鉴定。结果显示,共分离到7株ALV毒株(3株J亚群,4株K亚群),ALV-J分离毒株CAU4932、CAU4860和CAU2259的gp85基因片段长度为918 bp,编码306个氨基酸,分离毒株之间gp85基因核苷酸同源性为90.5%～95.2%,gp85蛋白氨基酸同源性为95.1%～99.3%;ALV-K分离毒株CAU7049、CAU5006、CAU7176和CAU7168的gp85基因片段长度为1 008 bp,编码336个氨基酸,分离毒株之间gp85基因核苷酸同源性为89.4%～92.3%,gp85蛋白氨基酸同源性为94.0%～99.7%。gp85蛋白氨基酸序列同源性比对发现,分离株gp8...     

广西麻鸡感染A亚群与J亚群禽白血病病毒的诊断

对疑似患有禽白血病的广西麻鸡进行病理剖检、接种DF-1细胞进行病毒分离以及对细胞培养上清进行p27抗原检测、细胞培养物进行PCR扩增,并对分离到病毒的gp85基因进行测序和分析比较。结果表明,从该病鸡同时分离到了A亚群禽白血病病毒(ALV-A)与J亚群禽白血病病毒(ALV-J),分别命名为ZS14-A株、ZS14-J株。对ALV-A gp85、ALV-J gp85基因的遗传变异分析结果显示,ZS14-A与6株国内外A亚群参考毒株之间的氨基酸同源性为86.3%~87.8%,其中与国外株MAV-1同源性最高,为87.8%。ZS14-J与7株国内外J亚群参考毒株之间的氨基酸同源性为83.4%~96.1%,其中与J亚群原型株HPRS103同源性最高,为96.1%。     

马立克氏病病毒不同致病型meq基因的比较研究

为了研究马立克氏病病毒（MDV）的meq基因与不同毒株致病性的关系，应用PCR技术扩增了不同致病型MDV毒株的meq基因，测定和比较了它们的核苷酸和氨基酸序列。这些毒株包括：国际通用Ⅰ型疫苗毒CV1988/Rispens株和中国特有的疫苗毒814株、强毒GA株（vMDV)、特超强毒648A株（vv MDV)以及6个广西分离到的野毒株。结果发现，MDV不同致病型的meq基因序列相对比较保守，它们相互间核苷酸和氨基酸序列的同源性均在95.6%-99.7%。但是，与所有测试的致病性MDV毒株相比，二个Ⅰ型疫苗毒CV1988/Rispens株和814株均在阅读框的核苷酸序列中缺失第575-577位3个碱基（CAC），导致一个氨基酸（脯氨酸）的缺失。该缺失性突变恰恰位于meq基因的多脯氨酸功能的一个重复序列（EELCAQLCSTPPPPI）之中。该缺失性突变与一个疫苗毒株失去致肿瘤性是否有关，还有待进一步研究。     

河南省2014-2015年猪流行性腹泻病毒流行株遗传进化分析

为监测和探究河南省猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)流行株变异情况,本试验对15株2014-2015年间河南省PEDV流行株S基因进行克隆及全序列测定,与河南省2011-2013年流行株以及国内、外代表毒株进行同源性及遗传变异分析,并对这些毒株S基因的N-糖基化位点及跨膜螺旋区域进行预测。结果表明:本试验得到的15株毒株之间S基因核苷酸同源性为97.0%~99.8%,氨基酸同源性为97.0%~99.5%;与2011-2013年河南流行株核苷酸同源性为97.1%~99.0%,氨基酸同源性为97.2%~98.8%,与其他地区流行毒株核苷酸同源性为92.2%~99.0%,氨基酸同源性为91.9%~99.0%;与经典毒株相比,S1区域N端存在15bp的插入和6bp的缺失,核苷酸同源性为91.7%~93.6%,氨基酸同源性为92.0%~93.6%。系统发育建树结果显示目前的流行毒株与经典毒株处于不同的2个群,流行毒株分处不同亚群。对N-糖基化位点及跨膜螺旋区域的预测得知2014-2015年河南省PEDV与经典株相比出现变异,与2010年暴发时相比存在部分突变,毒株之间存在部分差异,研制出有效的针对流行毒的疫苗依然是目前防控该病的重中之重。     

三黄鸡临床血管瘤病例中分离出A亚群与J亚群禽白血病病毒

为了解禽白血病病毒在广西鸡群中流行情况,采用DF-1细胞接种、细胞培养上清p27抗原检测、PCR扩增,对临床血管瘤型禽白血病的三黄鸡病料进行了病毒分离,并对分离病毒gp85基因进行测序和序列比较。结果表明,从1只病鸡同时分离到了一株A亚群禽白血病病毒(ALV-A)与一株J亚群禽白血病病毒(ALV-J),分别命名为HG01-A株和HG01-J株。ALV-A gp85与7株A亚群氨基酸同源性为85.8%~87.5%,与A亚群美国株MQNCSU同源性最高为87.5%,与A亚群原型株RSA同源性为86.9%。而ALV-J gp85与7株毒株核酸序列同源性为84.0%~93.8%,与广东株XX2-08以及四川株SCSM01同源性最高为93.8%,与英国原型株HPRS103同源性为90.2%。进化分析进一步表明,HG01-A与各参考株亲缘关系较远,HG01-J与SCSM01亲缘关系最近。本研究首次从同一只广西三黄鸡中同时分离到ALV-A及ALV-J,进一步完善了我国地方品种鸡群中禽白血病的流行病学信息。     

浙江省猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因的遗传变异分析

为了解2014-2016年浙江地区猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）ORF5基因变异情况,试验通过RT-PCR方法对从浙江省各地区采集的PRRSV阳性病料进行ORF5基因扩增,应用DNAStar和Mega 5.1软件对所测序列进行同源性和遗传变异分析。结果显示,54株2014-2016年浙江分离株ORF5序列之间核苷酸和氨基酸序列同源性分别为83.1%~100%和80.6%~100%,与经典株VR2332核苷酸和氨基酸序列同源性分别为83.8%~90.4%和81.6%~90.0%,与高致病PRRSV毒株JXA1核苷酸和氨基酸序列同源性分别为83.5%~99.5%和83.1%~99.0%。系统进化分析表明,54个毒株均为美洲型毒株,属于Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ 3个不同的基因亚型,其中基因亚型Ⅲ和Ⅳ毒株是浙江省近年来新出现的毒株。氨基酸序列分析结果显示,54个毒株在GP5蛋白的信号肽区域、非中和抗体表位的氨基酸序列变异较大,而在中和表位氨基酸序列变异较小。本研究结果表明,浙江地区PRRSV流行出现了新形势,多种基因亚型共同存在,其中以基因亚型Ⅰ毒株为主。