猪繁殖与呼吸综合征病毒-脂多糖刺激对中性粒细胞黏附猪肺微血管内皮细胞的影响

【目的】 研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)单独和联合脂多糖(LPS)刺激对肺脏募集中性粒细胞(Neu)的影响, 以及猪肺微血管内皮细胞(MVECs)在其中的作用。【方法】 取约10日龄仔猪的肺脏组织, 采用Ⅱ型胶原酶消化和差速贴壁法, 分离培养原代MVECs, 采用密度梯度离心法分离猪外周血Neu; 以PRRSV HN株或PRRSV-LPS刺激Neu和MVECs后, 将Neu加入培养MVECs的培养板, 孵育1 h, 4%多聚甲醛固定, 瑞氏染色, 观察并计数分析各组黏附的Neu数量; 采用免疫细胞化学染色法检测MVECs对P-选择素和E-选择素的表达; 采用虎红溶液染色法测定分析P-选择素和E-选择素抗体封闭MVECs时, PRRSV HN株或PRRSV-LPS刺激对Neu黏附于MVECs数量的影响。【结果】 分离培养的MVECs呈CD34免疫荧光染色阳性, 阳性率约为92%;PRRSV HN株刺激18 h, 黏附于MVECs的Neu数量显著增加(P<0.05);PRRSV-LPS联合刺激时, 黏附的Neu数量显著多于LPS单独刺激(P<0.05);PRRSV或PRRSV-LPS刺激Neu和MVECs二者时, 黏附Neu数量的增加比单独刺激MVECs或Neu更明显; 免疫细胞化学染色显示, MVECs强阳性表达P-选择素和E-选择素; 用P-选择素和E-选择素抗体封闭MVECs时, PRRSV或PRRSV-LPS刺激诱导的Neu黏附增加呈不同程度下降, E-选择素封闭时具有显著差异(P<0.05)。【结论】 PRRSV感染能促进Neu与MVECs黏附, 亦能增加后继LPS刺激时黏附的Neu数量, MVECs表达的E-选择素是介导PRRSV致Neu黏附增加的重要分子之一。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒与猪圆环病毒2型共感染猪组织中猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原的分布

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪圆环病毒2型(PCV2)同时感染猪50 d后,用免疫组化方法观察PRRSV抗原的分布.结果显示,单感染和共感染组在肺脏、脾脏、胸腺、扁桃体、颌下淋巴结、腹股沟淋巴结、肠系膜淋巴结、回肠和直肠中均可观察到PRRSV抗原阳性信号,且信号强度无显著差异;抗原信号的细胞分布范围也无差异,主要位于结缔组织的巨噬细胞、单核细胞、成纤维细胞、内皮细胞和淋巴细胞中.     

PRRSV间接免疫荧光检测法的建立和应用

以猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ATCC VR-2332株人工单独感染3头3周龄仔猪，并用PRRSV ATCC VR-2332株和猪圆环病毒2型(PCV2)联合感染2头3周龄仔猪，每日检查试验猪体温、采食情况及临床表现，并用HerdChek IDExx试剂盒测其血清抗体。PRRSV PCV2联合感染猪分别在感染后1、3周剖杀，PRRSV单独感染猪和健康对照猪分别在感染后1、2和3周剖杀，对全部试验猪的肺组织进行灌洗处理以获得肺泡巨噬细胞(PAM)．用PAM进行抹片，同时用肺组织直接进行触片做间接免疫荧光(IIF)检测。结果表明，用所获得的3株单克隆抗体均检测到人工感染猪肺组织中的PRRSV抗原。另外，用IIF检测7头临床疑似PRRS病猪的PAM抹片。其中沭阳县的2头猪呈现阳性反应；对这2头猪的肺组织进行病毒分离。在盲传到第4代时Marc-145细胞上产生明显的细胞病变，进一步证实用所获得的3株单克隆抗体检测临床样品的结果准确而可靠，且获得的3株单克隆抗体均可通过IIF用于检测猪肺组织中的PRRSV抗原。     

RNAscope原位杂交技术检测猪繁殖与呼吸综合征病毒RNA方法的建立

为了直观、高效、特异性地检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染细胞和组织中PRRSV RNA,本研究根据HP-PRRSV Hu N4株ORF7基因序列设计8对28 bp~36 bp双"Z"结构的寡核苷酸探针(PRRSV-Nprobes),建立了一种新的PRRSV RNA原位杂交检测的方法。该方法能特异性的检测PRRSV感染猪肺泡巨噬细胞(PAMs)中PRRSV RNA,而对猪圆环病毒2型(PCV2)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病毒(PRV)感染PAMs中的核酸呈现阴性。应用该方法检测PRRSV感染仔猪肺脏、腹股沟淋巴结和胸腺石蜡包埋组织切片中PRRSV RNA,在感染的腹股沟淋巴结中PRRSV RNA呈现集中分布,而PRRSV RNA在肺脏和胸腺中呈弥漫性分布。该方法可用于细胞和组织中核酸的定位及分布规律的研究,特别是用于病毒含量较少的潜伏感染的检测,为PRRSV实验室检测和致病机理研究奠定了良好的试验基础和技术支持。     

间接免疫荧光试验（ⅡF）检测PRRSV方法的应用

用PRRSV ATCC VR-2332株人工单独感染了3头3周龄仔猪，并用PRRSV ATCC VR-2332株和猪圆环病毒2型(PCV2)联合感染了2头3周龄仔猪，同时设立了3头健康对照猪。攻毒后每日记录试验猪体温、采食、临床表现等，并用HerdChek IDEXX Kit测其血清抗体。PRRSV PCV2联合感染猪分别在感染后1周、3周剖杀，PRRSV单独感染猪和健康对照猪分别在感染后1周、2周和3周剖杀。对肺组织进行灌洗处理以获得肺泡巨噬细胞(PAM)，用PAM进行抹片，同时用肺组织直接进行触片作ⅡF检测。ⅡF试验结果表明，用所获得的3株单抗均检测到了人工感染猪肺组织中的PRRSV抗原。另外，用ⅡF检测临床疑似PRRS的7头猪的PAM抹片，其中沭阳2头猪呈现阳性反应。对这2头猪的肺组织进行病毒分离，结果在盲传到第四代时在Marc-145细胞上产生明显的细胞病变，进一步证实了所获得的3株单抗检测临床样品的准确性和可靠性。综合以上试验结果，证实了所获得的3株单抗均可通过ⅡF试验用于临床检测肺组织中的PRRSV抗原。     

间接免疫荧光试验(IIF)检测PRRSV方法的应用

用PRRSV ATCC VR-2332株人工单独感染了3头3周龄仔猪,并用PRRSV ATCC VR-2332株和猪圆环病毒2型(PCV2)联合感染了2头3周龄仔猪,同时设立了3头健康对照猪.攻毒后每日记录试验猪体温、采食、临床表现等,并用HerdChek IDEXX Kit测其血清抗体.PRRSV+PCV2联合感染猪分别在感染后1周、3周剖杀,PRRSV单独感染猪和健康对照猪分别在感染后1周、2周和3周剖杀.对肺组织进行灌洗处理以获得肺泡巨噬细胞(PAM),用PAM进行抹片,同时用肺组织直接进行触片作IIF检测.IIF试验结果表明,用所获得的3株单抗均检测到了人工感染猪肺组织中的PRRSV抗原.另外,用IIF检测临床疑似PRRS的7头猪的PAM抹片,其中沭阳2头猪呈现阳性反应.对这2头猪的肺组织进行病毒分离,结果在盲传到第四代时在Marc-145细胞上产生明显的细胞病变,进一步证实了所获得的3株单抗检测临床样品的准确性和可靠性.综合以上试验结果,证实了所获得的3株单抗均可通过IIF试验用于临床检测肺组织中的PRRSV抗原.     

抗独特型抗体对猪繁殖与呼吸综合征病毒感染的免疫作用

用PRRSV感染SPF猪，血清检测结果显示，机体不仅产生抗PRRSV抗原的各种抗体(Ab1)，而且产生针对这些抗体的抗独特型抗体(Ab2)。根据各种蛋白质的等电点不同，应用IEF技术分离纯化出PRRSV感染猪血清中的不同IgG。分别以纯化的抗PRRSV—GP5蛋白、抗PRRSV-M蛋白的Ab2免疫SPF猪各5头，7d后经鼻腔感染PRRSV，定期采集血样进行病毒分离或鉴定试验。抗PRRSV-GP5蛋白的Ab2免疫的猪，其血样自感染后3～7d均检出PRRSV；3头猪在感染后14～63d未检出PRRSV；2头猪在感染后14～35d检出PRRSV，从42～56d转为阴性，其中1头猪在63d时检出PRRSV。抗PRRSV—M蛋白的Ab2免疫的猪，其血样自感染后3～7d均检出PRRSV；2头猪在感染后14～63d未检出PRRSV；3头猪在感染后14～35d检出PRRSV，从42～56d转为阴性，其中1头猪在63d时检出PRRSV。抗PRRSV—GP5和抗PRRSV—M蛋白的Ab2免疫作用显著，可作为PRRSV-GP5和PRRSV—M蛋白的替代抗原产生具有中和效应的抗体，保护机体免受PRRSV的感染。     

II型PCV和PRRSV单独与共同感染未吃初乳猪病例人工复制

3周龄剖腹产不吃初乳(CD/CD)猪分别感染II型猪圆环病毒(PCV-2),猪繁殖-呼吸综合征病毒(PRRSV),PCV-2和PRRSV共同感染,比较这些病毒的单独或联合作用。并于接种后不同日龄及猪濒死时剖检。接种后第10天(10DPI),PCV-2和PRRSV共同感染猪出现严重的呼吸困难、昏迷,偶尔出现黄疸,10DPI后,91%死亡,20DPI时,全部死亡。PCV-2单独感染猪出现昏迷,散发性黄疸,42%出现渗出性皮炎,死亡率26%。PRRSV感染猪出现呼吸困难和昏迷,至28DPI时恢复。PCV-2感染猪和PCV-2/PRRSV共同感染猪皆出现与断奶后仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)相同的组织病变。PCV-2/PRRSV共同感染猪亦出现严重的增生性间质肺炎和更相似的肝病变,出现极大量的含有PCV-2抗原的细胞。PRRSV感染猪出现中等程度的增生性间质肺炎,但未出现支气管或肝病变以及淋巴组织萎缩。研究结果表明:1PCV-2共感染能加重PRRSV对CD/CD猪引起的间质性肺炎的严重程度;2是PCV-2而不是PRRSV引起PMWS的淋巴组织萎缩,肉芽肿性炎症,坏死性肝炎等特征病变。     

Ⅱ型PCV和PRRSV单独与共同感染未吃初乳猪病例人工复制

3周龄剖腹产不吃初乳(CD／CD)猪分别感染Ⅱ型猪圆环病毒(PCV—2)，猪繁殖—呼吸综合征病毒(PRRSV)，PCV—2和PRRSV共同感染，比较这些病毒的单独或联合作用。并于接种后不同日龄及猪濒死时剖检。接种后第10天(10DPI)，PCV—2和PRRSV共同感染猪出现严重的呼吸困难、昏迷，偶尔出现黄疽，10DPI后，91％死亡，20DPI时，全部死亡。PCV—2单独感染猪出现昏迷，散发性黄疽，42％出现渗出性皮炎，死亡率26％。PRRSV感染猪出现呼吸困难和昏迷，至28DPI时恢复。PCV—2感染猪和PCV—2／PRRSV共同感染猪皆出现与断奶后仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)相同的组织病变。PCV—2／PRRSV共同感染猪亦出现严重的增生性间质肺炎和更相似的肝病变，出现极大量的含有PCV—2抗原的细胞。PRRSV感染猪出现中等程度的增生性间质肺炎，但未出现支气管或肝病变以及淋巴组织萎缩。研究结果表明：①PCV—2共感染能加重PRRSV对CD／CD猪引起的间质性肺炎的严重程度；②是PCV—2而不是PRRSV引起PMWS的淋巴组织萎缩，肉芽肿性炎症，坏死性肝炎等特征病变。     

人工感染PRRSV JXA1株仔猪肾脏组织病理变化及病毒分布

为了解感染猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)仔猪肾脏组织的主要病变和病毒主要分布的细胞类型,试验取人工感染PRRSV JXA1株的仔猪肾脏组织制作石蜡切片,采用HE染色法观察其病理变化,采用免疫组织化学方法检测病毒GP5蛋白和N蛋白在肾脏组织内的分布。结果表明,感染仔猪的肾脏组织呈现广泛性充血和出血,大量的炎症细胞浸润;感染仔猪肾脏组织的免疫组织化学染色,PRRSV GP5蛋白和N蛋白呈广泛性阳性着色,阳性细胞包括肾小球毛细血管内皮细胞、肾小管周围毛细血管内皮细胞、肾小管上皮细胞和肾间质等。说明PRRSV感染仔猪病毒粒子能够侵入肾脏组织,感染肾血管内皮细胞和肾小管上皮细胞等。     

口蹄疫146S病毒粒子抗原对微血管内皮细胞分泌IL-1的影响

白介素1（IL-1）是免疫与炎症反应启动的重要调节因子。为了研究微血管内皮细胞（microvascular endothelial cells,MVECs）在口蹄疫病毒（foot and mouth disease virus,FMDV）免疫反应中的作用,本试验采用ELISA方法检测了FMDV 146S抗原对体外培养大鼠心肌膜MVECs分泌IL-1α和IL-1β的影响。研究结果发现,正常情况下大鼠心肌膜MVECs能够低水平的分泌IL-1α和IL-1β,FMDV 146S刺激后其分泌量显著增加。结果表明,MVECs通过上调IL-1分泌,在FMDV抗原的免疫反应中发挥重要的调控作用。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒2型共感染对猪体内病毒动态及免疫反应的影响

将猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)单感染和共感染6周龄健康仔猪,采用实时定量PCR(Real-time PCR)对血清、组织(心、肝、肺、肾、胰、脾、胸腺、扁桃体、腹股沟淋巴结、肠系膜淋巴结)中的PRRSV和PCV2载量进行检测,分别采用间接ELISA和间接IFA对血清中的PRRSV和PCV2特异性抗体进行检测,采用MTT法对猪外周血淋巴细胞(PBLC)的增殖能力进行检测.结果,PRRSV/PCV2共感染组血清、组织中PRRSV的载量均显著高于PRRSV单感染组,PCV2的载量均显著高于PCV2单感染组;共感染组PRRSV和PCV2特异性抗体阳转的时间均晚于并且效价均显著低于PRRSV或PCV2单感染组;共感染组和单感染组PBLC的增殖能力均受到抑制,其严重程度依次为:PRRSV/PCV2组>PRRSV组>PCV2组.由此表明,PRRSV和PCV2在猪体内对彼此的增殖具有促进作用;PRRSV和PCV2共感染对猪的免疫抑制具有加重作用.     

志贺样毒素Ⅱ型变异体对大鼠肠黏膜微血管内皮细胞分泌IL-8 IL-6和PGI2的影响

志贺样毒素Ⅱ型变异体[1](SLT-Ⅱe)是猪水肿病大肠杆菌导致仔猪形成水肿病的主要致病因子.研究证明,SLT-Ⅱe能损伤小肠上皮细胞和血管内皮细胞[2],引起细胞分泌功能障碍,进而导致微血管舒缩和通透性发生变化,最终形成猪水肿病.本试验通过研究SLT-Ⅱe作用大鼠肠黏膜微血管内皮细胞(MVECs)后,其培养上清液中IL-8、IL-6和PGI2的浓度变化,以期从SLT-Ⅱe影响微血管内皮细胞分泌功能方面,探讨SLT-Ⅱe对大鼠肠黏膜MVECs的损伤机制.     

PRRSV感染致断奶仔猪肺脏和外周免疫器官的病理损伤

用PRRSV ATCC VR-2332株感染8头28日龄仔猪,同时设立2头健康对照猪.PRRSV单独感染猪分别于感染后7,17,25 d各剖杀2,3,3头,对照组于17,25 d各剖杀1头.剖杀后采集脾脏、肺脏和全身主要淋巴结(颌下淋巴结、肺门淋巴结、腹股沟淋巴结和肠系膜淋巴结)等免疫器官,用甲醛溶液固定,组织石蜡切片以观察显微病理变化.试验组猪的抗体和抗原检测结果均表明,感染后7 d血清PRRSV抗体和免疫器官组织PRRSV抗原部分呈阳性;剖检和石蜡切片结果均显示,试验猪于攻毒后,随着病程的发展,发生了不同程度的间质性肺炎及相应的显微病变,PRRSV单独感染能引起免疫器官以淋巴细胞及巨噬细胞变性坏死为特征的急性炎症变化,造成免疫损伤,进而引起免疫抑制.     

基于核衣壳蛋白的欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒双重识别酶联免疫吸附早期检测方法的建立

精确并快速地检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染对猪场至关重要。提高改善防控程序,如检测引入后备母猪、监测血清阴性猪群等,需要更加快速、敏感的检测方法。标准的血清学检测技术主要检测IgG抗体,本研究建立一种双重识别酶联免疫吸附试验(DR-ELISA)方法用于检测针对欧洲型PRRSV的特异性抗体。这种新检测方法能同时检测到PRRSV的IgM和IgG抗体,对识别猪群早期感染及因只能检测到IgG抗体的常规试验方法而造成的漏检有所帮助。DR-ELISA的基础是抗体对抗原的双重识别。本研究以PRRSV重组的核衣壳蛋白(N蛋白)作为包被和酶联抗原。为评估该方法在检测PRRSV早期感染的敏感性,连续采集并检测69头感染PRRSV猪的血清。标准检测方法的试验结果表明,其对感染后14d血清的检测敏感性很低,而DR-ELISA在感染7d可检测到阳性血清率可达88.4%,表明DR-ELISA方法在检测感染早期有很强的敏感性。为评估新检测方法的效力,进一步的研究结果表明,DR-ELISA检测欧洲型PRRSV早期感染敏感并精确。     

高致病性猪蓝耳病直接免疫荧光诊断方法的建立及其应用

以临床"高热综合征"病例中分离的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)HBR变异株接种试验猪制备抗血清,采用硫酸铵盐析法提取血清中免疫球蛋白(IgG),并用异硫氰酸荧光素(FITC)对IgG进行荧光标记,建立了一种直接免疫荧光诊断方法(FA),用于检测病毒感染单层细胞及动物脏器组织切片中PRRSV抗原.本试验对PRRSV感染MARC-145细胞增殖动力学检测结果表明,接种后16 h可检测到抗原阳性细胞,接种后60 h～72 h达到病毒增殖高峰;对病毒人工感染猪脏器组织抗原分布检测结果显示,腹股沟淋巴结、空肠、睾丸、脾脏、下颌淋巴结、肠系膜淋巴结和扁桃体抗原阳性检测率较高;对临床10个猪场送检的38份病料平均阳性检出率为63.2%(24/38).该方法具有特异性强、敏感性和重复性好等特点,与RT-PCR检测结果符合率为96.3%,对几种已知猪病毒抗原无交叉反应,标记的荧光抗体于4℃保存6个月稳定.FA为PRRS的临床诊断提供了一种快速、便捷、敏感、特异的检测方法.     

断奶后多系统衰竭综合征病猪中存在沙门氏菌和猪繁殖与呼吸系统综合征病毒共感染

调查了曾经暴发沙门氏菌病的四个猪场的14头病猪,发现在这些猪的肿胀淋巴结中出现带有淋巴细胞排空的肉芽肿性炎症。应用免疫标记和PCR方法在病变部位检测到猪圆环病毒2(PCV2)抗原和PCV2DNA。此外,在这些病猪的肺脏中检测出猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV),分离到猪霍乱沙门氏菌。在9头沙门氏菌感染猪中,有5头为沙门氏菌、PMWS与PRRSV并发感染,其数量(55.6%)远远高于沙门氏菌与PMWS感染猪(22.2%)或沙门氏菌与PRRSV感染猪(22.2%)。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒在猪肺组织精细切片中感染特性的研究

为研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)在猪肺脏组织中的感染特性,本研究建立了高度分化的猪呼吸系统体外培养模型-猪肺组织精细切片(PCLS)。该培养体系包含肺脏组织中多种相关细胞并能够体现出肺脏组织的生理结构和生物学功能。本研究针对制备的猪PCLS进行生物学活性的鉴定,利用评估支气管上皮细胞纤毛摆动百分比的方法检测支气管上皮细胞纤毛活性,结果显示猪PCLS制备良好,在制备10 d以后仍保持95%以上的纤毛活性;利用活/死细胞染色法测定制备的猪PCLS体外培养后活细胞的比例,结果显示制备的猪PCLS在体外培养7 d后支气管上皮细胞和肺泡细胞仍为活细胞;利用间接免疫荧光试验测定猪PCLS中上皮细胞、杯状细胞和肺泡巨噬细胞(PAM)的完整性与分布情况,结果显示制备的猪PCLS上皮细胞和杯状细胞保存完整且猪PCLS中包含丰富的PAM。利用6株不同PRRSV分离株(HuN4、XD-15、WK-34、WK-38、LCL-75和DL-1510)以2.5×10~5TCID_(50)/片的剂量感染猪PCLS,检测不同PRRSV分离株在猪PCLS中的感染特性,结果表明不同PRRSV分离株在该培养体系中表现出不同的增殖能力。本研究表明猪PCLS可用于PRRSV的体外感染试验。本研究为PRRSV的体外研究提供了新的模型与方法,同时也为其它猪呼吸道病原体提供了新的研究平台。     

福尔马林固定病料对于免疫组化检测组织中PRRSV抗原的影响

本刊译：据兽医诊断研究杂志报道，WG Van Alstine等研究发现福尔马林对自然感染和实验室人工感染PRRSV的猪组织中的病毒抗原有一定的影响。     

PRRSV SC-1株在人工感染仔猪体内的分布

为研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)在感染猪体内各器官组织的分布,用PRRSV SC-1株人工感染健康断奶仔猪,接毒后23 d,无菌采集试验猪器官组织,用RT-PCR检测其中病毒核酸分布情况。结果显示,心脏、脾脏、肺脏、肾脏、支气管淋巴结、肠系膜淋巴结、腹股沟淋巴结、髂内淋巴结内有病毒核酸,在所有试验猪的肺脏、腹股沟淋巴结都检测到了病毒核酸。本研究结果为PRRS诊断及病毒分离鉴定提供了一定参考依据。