EHV-1-XJ2015株在不同细胞系中增殖规律研究

为了研究马疱疹病毒1型(Equine herpesvirus 1,EHV-1)在不同细胞系中的增殖规律,试验将该病毒分别接种至Vero细胞、BHK-21细胞和MDBK细胞中进行连续传代培养,观察细胞病变(CPE)情况;对第3代收获的病毒gE基因进行PCR检测及同源性比对;按照Reed-Meunch方法分别测量3种细胞7个时间点的TCID_(50),并绘制一步生长曲线。结果表明:EHV-1对3种细胞有很好的亲嗜性,产生明显CPE;3种细胞都扩增出大小为438 bp的片段,与所选的参考株同源性在99.99%以上;EHV-1在感染3种细胞后0～12 h进入静止期,12～48 h进入快速增长期;感染BHK-21细胞后在36小时时达到最高病毒毒价,TCID_(50)为1×10~(-8.40)/0.1 mL,感染MDBK细胞及Vero细胞后在48小时时达到最高病毒毒价,TCID_(50)分别为1×10~(-7.35)/0.1 mL和1×10~(-5.80)/0.1 mL。说明BHK-21细胞适合作为EHV-1-XJ2015株体外研究的细胞系。     

BHV-1在牛胚气管细胞中的增殖规律研究

为研究牛疱疹病毒Ⅰ型(BHV-1)在牛胚气管细胞(EBTr)中的生长特性和增殖规律,参考文献设计合成特异性引物和探针,建立了TaqMan实时荧光定量PCR方法,检测BHV-1感染EBTr细胞6、12、24、48、72、96、120、144h后病毒的增殖规律,并观察对应时间点的细胞病变(CPE)。结果显示,用100TCID_(50)的BHV-1感染EBTr细胞,48h后开始出现细胞病变,72h细胞病变明显,120h细胞大部分变圆,开始脱落,144h细胞大面积脱落、崩解。实时荧光定量PCR检测结果表明,BHV-1感染EBTr在6h~24h内,病毒缓慢增殖,48h~96h,病毒增殖速度加快,拷贝数呈对数增长,120h~144h,BHV-1的含量仍然呈现升高的趋势,但增长速度变慢。结果证明,BHV-1能够在EBTr中产生CPE,而且CPE程度与病毒DNA增殖规律一致,该结果可以为深入研究BHV-1对EBTr细胞的致病机理提供基础资料。     

牛传染性鼻气管炎病毒诱导MDBK细胞线粒体损伤模型的建立

为探讨牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV）诱导MDBK细胞线粒体损伤的最适时间和浓度,本试验用0.5、1.0、1.5、2.0感染复数（multiplicity of infection,MOI） IBRV感染MDBK细胞6、12、24、36、48 h,采用透射电镜、流式细胞术等技术检测MMP和MPTP异常开放情况。结果显示,用不同MOI IBRV感染MDBK细胞12 h,感染组与对照组相比,MPTP均显著降低,且除2.0 MOI外均随接毒剂量的增加而降低;MMP在1.5 MOI后开始极显著降低;用1.5 MOI IBRV分别感染MDBK细胞6、12、24、36 h,感染组与对照组相比MPTP及MMP从6 h起均显著降低,且随着病毒感染时间的不断延长而降低。透射电镜结果显示,IBRV感染MDBK细胞6 h就可引起细胞线粒体损伤,出现部分空泡化,24 h线粒体完全空泡化,并且在线粒体周围可以看见病毒粒子。结果表明,IBRV感染可以诱导MDBK细胞线粒体损伤,且用1.5 MOI感染MDBK细胞6～24 h是诱导细胞线粒体损伤的最佳时间和浓度。该时间和浓度可用于IBRV相关药物研究,为进一步研究线粒体损伤提供理论依据。     

牛传染性鼻气管炎的研究——Ⅱ.病毒形态观察

我们在第一报中报道了牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的分离鉴定,本报报道IBRV的形态观察。 材料和方法 一、病毒:为第一报中分离的IBRV,在MDBK传代细胞传7代以上,毒价稳定在10~7 TCID_(50)//ml,命名为92-Y-IBRV。 二、病毒细胞悬液制取 病毒细胞悬液分别为BK-E·IBRVF_1,BK-E·IBRVF_3、BK-E·IBRVF_8和MDBK_(94)-E·IBRVF_7及BK正常细胞悬液,分别编号为(a)(b)(c)(d)和(e)。 1.分别取(a)(b)(c)和(e)细胞悬液,CPE分别为70％和80％以上,毒价稳定,置     

羊口疮病毒感染MDBK细胞的电子显微镜观察

为了研究羊口疮病毒(Orf V)粒子的形态,试验采用透射电镜对Orf V地方分离株感染的体外培养MDBK细胞进行了观察。结果表明:负染痂皮病料悬液的病毒粒子呈卵圆形线团样,表面呈绳索样缠绕结构,大小为150~200 nm×230~270 nm,病毒粒子外有双层被膜包裹;OrfV地方分离株感染MDBK细胞在48 h后可见细胞变圆、聚集、融合、拉网甚至脱落的细胞病变(CPE);超薄切片可见病毒粒子存在于细胞浆内,多呈椭圆形或卵圆形,获得囊膜成熟病毒粒子和未成熟病毒粒子的表面均呈现两种形态,即表面呈绳索样的病毒粒子和表面无绳索样的病毒粒子;细胞超微结构变化主要表现为细胞表面的微绒毛脱落,细胞浆空泡增多,内质网扩张呈囊状。说明OrfV能够在MDBK细胞内增殖。     

鸭肝炎病毒在鸭胚成纤维细胞上的适应性研究

将鸭肝炎病毒(DHV)E53鸡胚致弱株适应鸭胚成纤维细胞(DEF),连续传代至第16代时出现细胞病变(CPE),第21代时CPE呈现规律性,接毒后72 h CPE达80％,其病变特征是细胞间隙增宽、细胞崩解死亡、脱落.经病毒细胞培养物滴度测定、RT-PCR检测和间接免疫荧光法鉴定,证明DHVE53株能够在DEF上增殖.     

牛病毒性腹泻病毒LN-1株的分离鉴定及基因组序列分析

【目的】查明并掌握辽宁地区牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus, BVDV)的流行特性及生物学特点,为BVDV的防治提供理论基础和技术支持。【方法】采集辽宁省某养牛场疑似发生BVDV感染的病死牛脾脏组织,用牛传染性鼻气管炎病毒(Infectious bovine rhinotracheitis virus, IBRV)、牛呼吸道合胞体病毒(Bovine respiratory syncytial virus, BRSV)、牛副流感病毒3型(Bovine parainfluenza virus type 3,BPIV3)及BVDV基因特异性引物进行RT-PCR鉴定,将组织液接种MDBK细胞分离病毒。对细胞进行细胞病变效应(CPE)观察后再通过电镜观察、间接免疫荧光试验(IFA)鉴定病毒,PCR扩增病毒全基因组序列并对其进行遗传进化分析。【结果】BVDV特异性引物RT-PCR鉴定结果为阳性,在280 bp处有条带,与预期条带大小相符,其余病原特异性引物未扩增出条带,证明未感染其他病原;分离得到的毒株在MDBK细胞中培养未出现明显细胞病变效应;病毒纯化后,...     

传染性牛鼻气管炎病毒分离鉴定及特性分析

传染性牛鼻气管炎病毒(infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV)是牛的重要传染病病原,除能引起呼吸道疾病外,还可引起结膜炎、流产、脑炎和全身性感染。本试验从广东某牛场疑似IBRV感染牛中采取鼻拭子样品,用PCR和荧光PCR方法,初步诊断病牛感染IBRV。用MDBK细胞对初诊阳性病料进行病毒分离和鉴定,分离出1株传染性牛鼻气管炎病毒,命名为GD0109。细胞感染试验表明,该株病毒可以使MDBK细胞产生典型的圆缩、呈葡萄样聚集以及空洞等细胞病变。将GD0109与强毒的ATCCVR-2112TM株感染细胞裂解液分别接种MDBK细胞并盲传5代,对5代、10代、15代的病毒分别进行TCID50测定及中和试验,结果表明分离株和参考株VR-2112TM相似,提示该分离株为强毒株,并且具有良好的传代稳定性,为进一步疫苗生产打下良好的基础。     

禽呼肠病毒在鸡胚成纤维细胞系中的增殖规律

为研究禽呼肠病毒(ARV)在鸡胚成纤维细胞(DF1)上的增殖规律,将ARV S1133株接种至DF1细胞,连续传代3次后观察细胞病变(CPE),RT-PCR检测病毒核酸。结果显示,ARV S1133株对DF1细胞有很好的亲嗜性,并出现典型的CPE。按照Reed-Meunch方法测量7个时间点的TCID50,并绘制生长曲线。结果显示,ARV感染DF1细胞后的0h~12h为静止期,12h~48h为快速增长期,并在48h达到最大的病毒效价,TCID_(50)为10~(-8.9)/0.1mL,为进一步研究ARV的致病机理,以及在DF1上研制禽呼肠病毒细胞灭活苗提供参考。     

小分子药物索非布韦对牛病毒性腹泻病毒体外复制的影响

试验旨在研究小分子药物索非布韦是否具有抑制牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus,BVDV）复制的作用。通过MTT法测定了不同时间和不同浓度索非布韦对牛肾细胞（MDBK）增殖的影响;采用免疫荧光染色试验筛选出能有效抑制BVDV复制的索非布韦最适浓度,用实时荧光定量PCR、致细胞病变作用（CPE）和病毒半数组织细胞感染量（TCID₅₀）测定的方法检测索非布韦对BVDV复制的影响。结果显示,索非布韦处理MDBK细胞24和48 h能极显著抑制细胞增殖（P<0.01）;与对照组相比,当索非布韦浓度为800 μmol/L时免疫荧光染色检测BVDV感染MDBK细胞的双链RNA（dsRNA）含量极显著降低（P<0.01）;实时荧光定量PCR检测发现,与DMSO处理组相比,BVDV感染索非布韦处理组MDBK细胞,BVDV 5'UTR mRNA含量在病毒感染24和48 h时极显著降低（P<0.01）;BVDV感染索非布韦处理组MDBK细胞病变现象明显减弱;索非布韦处理24 h后能极显著减弱BVDV感染MDBK细胞后子代病毒颗粒的形成组与释放（P<0.01）,降低病毒滴度。综合上述结果表明,小分子药物索非布韦能有效抑制BVDV体外复制。     

I型鸭肝炎病毒在鸭胚成纤维细胞系中的增殖特性研究

为研究I型鸭肝炎病毒(DHV-1)在鸭胚成纤维细胞系(DEF-h)中的增殖规律,本研究将DHV-1野毒株(ZJ-08株)接种DEF-h细胞,连续传代3次后,观察病毒对细胞的致病变效应(CPE),并对病毒核酸及其蛋白的表达和病毒增殖特性进行了鉴定。研究结果显示,DHV ZJ-08株能够在DEF-h中有效增殖,并产生典型的CPE,病毒蛋白在细胞中也获得了良好表达,并与DHV-1特异性抗体发生反应。一步生长曲线显示ZJ-08株病毒感染DEF-h 12 h开始增殖,36 h～60 h进入快速增殖期,72 h达到峰值,TCID50为10-4.3/mL。本实验为进一步的DHV-1的致病机理和细胞灭活疫苗的研制奠定了基础。     

国内外科技

原作者从有发热、咳嗽、流鼻涕及呼吸急促等的呼吸器官症状的19群牛的鼻汁中,用组织培养法分离出38株病毒。这些病毒接种于初代牛肾培养细胞和MDBK细胞后,出现的CPE与牛鼻病毒(BRV—1和BRV—2)的CPE是一致的。38株分离病毒的特性是:病毒在IUDR条件下继续增殖,证明了分离病毒是RNA型的,有抗乙醚性,对酸易感性,经56℃     

HEBP1基因敲除对牛病毒性腹泻病毒在MDBK细胞中增殖的影响

为研究血红素结合蛋白1(HEBP1)对牛病毒性腹泻病毒(BVDV)复制的影响,应用CRISPR/Cas9技术建立HEBP1基因敲除的MDBK细胞系;用BVDV TC株感染HEBP1基因敲除的MDBK细胞,用免疫荧光染色检测BVDV双链RNA(dsRNA)水平,观察BVDV致细胞病变效应(CPE)情况,实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)检测BVDV 5′UTR mRNA水平,Reed-Muench测定病毒滴度变化。结果表明,成功构建HEBP1基因敲除的MDBK稳定细胞系,敲除效率为72.41%;敲除HEBP1基因显著性抑制BVDV 5′UTR mRNA和dsRNA积累,减弱BVDV感染靶细胞的CPE,降低BVDV滴度。说明敲除HEBP1基因显著性抑制BVDV的复制,为抗BVDV研究提供新的思路和药物靶点。     

IBDV和NDV共感染对DF-1细胞的协同致病作用

为研究传染性法氏囊病病毒(IBDV)和新城疫病毒(NDV)共感染对DF-1细胞的致病作用,本试验将IBDV和NDV以单独/共同形式感染DF-1细胞,镜下观察可见共感染组最早在感染48 h后出现细胞病变现象(CPE),其他感染组在72 h后出现明显CPE;细胞活性检测结果显示共感染组在48 h出现明显下降,在72 h显著低于其他组。感染上清中共感染组与单感染组病毒增殖曲线基本一致,均表现为24～72 h处于病毒增殖期。荧光定量PCR检测结果显示,共感染组细胞内NDV核酸载量均显著高于单感染组,其IBDV核酸载量在48 h高于单感染组;共感染组MDA5转录水平在24 h显著低于其他组,在48 h显著高于其他组;各感染组Ⅰ型IFN转录水平受到明显抑制,其中共感染组IFN-β转录水平显著低于单感染组。本研究结果表明IBDV与NDV共感染导致细胞病变加剧并促进胞内病毒复制,明确了病毒共感染具有协同致病作用;还发现病毒共感染导致MDA5-IFN信号通路出现异常,这为下一步解析IBDV与NDV共感染对宿主天然免疫系统的影响及协同致病机制奠定基础。     

牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV）在MDBK细胞上的培养条件优化

本试验旨在探索对牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV HL-2株）敏感的细胞种类及其在相应细胞上的培养特性和培养条件。将IBRV HL-2病毒液接种不同传代细胞，结果表明MDBK细胞对IBRV HL-2株敏感，能产生明显的细胞病变。对各种条件进行优化，结果表明接种时间、接毒量、维持液血清含量、培养基种类均对收获的病毒液病毒含量有影响。通过优化，得出最佳培养条件如下：在细胞传代后24 h接种，弃掉营养液，加入含2%血清的MEM作为维持液，接入0.01感染复数（moi）的病毒液，接种后44±2 h收获，所获得的病毒液病毒含量最高。     

不同毒力牛传染性鼻气管炎病毒感染MDBK细胞的差异蛋白组学

毒力不同的中传染性鼻气管炎病毒(IBRV)株感染宿主细胞后,会产生不同的临床免疫反应,目前关于强弱IBRV毒株感染宿主细胞后的差异蛋白质组学研究尚未报道。本研究使用基于双向电泳与MALDI-TOF/MS的蛋白质组学技术,对比分析了MDBK细胞感染IBRV强毒株LN01/08与弱毒株LNM前后蛋白质组变化,共鉴定了8个差异蛋白。结果显示,丙酮酸激酶(PKM2)、肌切蛋白(SCIN)、转化生长因子(TGFBR1)及热应激蛋白90(Hsp90)在IBRV LN01/08株与IBRV LNM株感染组中表达量发生显著差异,其中PKM2和TGFBR1在IBRV LN01/08株组中高表达,Hsp90在IBRV LNM株感染组和MDBK细胞对照组中高表达,在IBRV LN01/08感染组中无表达。     

金丝桃素可溶性粉体外抗犊牛病毒性腹泻-黏膜病病毒的实验研究

为了探讨金丝桃素可溶性粉抗犊牛病毒性腹泻-黏膜病病毒(BVD-MDV)的作用机制,试验过程中采用先给药后接毒、先接毒后给药和同时给药接毒3种不同的途径,分别在72、96、120 h观察病毒致牛肾原代细胞(MDBK)的病变(CPE)情况.结果表明,病毒的TCID50为10-6/0.1 mL,金丝桃素可溶性粉的TC0为2.5 g/L;药物质量浓度在0.3～2.5 g/L范围内同时给药和接毒组细胞生长良好,细胞单层完整,视野中未见大量圆细胞或死细胞,而其余2种给药途径细胞病变明显.结果提示,金丝桃素可溶性粉对BVD-MDV有显著的直接杀灭作用.     

一株MDBK细胞的低血清悬浮驯化研究

研究选取一株背景清晰、纯净的MDBK贴壁细胞,通过直接驯化和逐级降低血清相结合的办法,获得了一株可以在低血清培养基中全悬浮培养的MDBK细胞。该细胞在含0.5%胎牛血清的培养基中悬浮培养48 h后的细胞密度稳定在5.0×10⁶/mL以上,培养72 h后细胞密度最高可达1.16×10⁷/mL,且细胞形态良好,活力在93%以上,具有良好的传代稳定性。应用筛选获得的悬浮培养MDBK细胞株分别接种伪狂犬病毒和传染性牛鼻气管炎病毒后,检测病毒敏感性。细胞在24 h均发生了皱缩,72 h大部分死亡。悬浮培养的MDBK细胞对传染性牛鼻气管炎病毒的滴度在24 h达到最大值107.6TCID50/mL,对伪狂犬病毒的滴度在48 h达到最大值107.6 TCID50/mL,说明虽然细胞的培养方式发生了改变,但并没有影响上述两种病毒在该细胞上的增殖特性。对MDBK细胞的全悬浮驯化研究可为相关病毒类疫苗规模化生产及工艺的升级改进提供细胞学基础资料。     

牛结节性皮肤病病毒感染MDBK细胞后转录组差异表达分析

旨在探索牛结节性皮肤病病毒(lumpy skin disease virus,LSDV)与宿主细胞的相互作用,采集了具有典型临床症状的牛皮肤病变组织,接种MDBK细胞进行病毒分离,采用透射电镜观察病变组织及病毒感染后的MDBK细胞,同时对感染后24 h的MDBK细胞进行转录组学分析,筛选差异表达基因并将其按功能分类,分...     

中药金银花体外抗牛病毒性腹泻病毒的作用研究

为了研究中药金银花是否具有抗牛病毒性腹泻病毒(BVDV)活性的作用,试验首先测定了金银花对牛肾细胞(MDBK细胞)的最佳用药浓度,用该浓度的金银花对在细胞内和细胞外两种状态的BVDV进行试验。细胞外试验中,把BVDV与金银花在体外混合,作用0,6,12 h后接种MDBK细胞,以研究金银花在细胞外抗BVDV活性作用。细胞内试验中,将BVDV先接种至MDBK细胞,然后用含金银花的细胞维持液培养1 h,最后用细胞维持液继续培养24,36,48 h,以观察金银花对BVDV复制的影响。采用免疫荧光试验、病毒半数组织细胞感染量(TCID_(50))测定及荧光定量PCR方法,检测金银花对BVDV活性和复制的影响。结果表明:当金银花浓度为2.5×10~(-2) g/mL时,对细胞的毒性最小。因此,用该浓度的金银花对BVDV在细胞内和细胞外两种状态进行试验。细胞外试验组免疫荧光试验结果显示,金银花与BVDV作用0 h,培养72 h后,仍有特异性荧光;而金银花与BVDV作用6 h和12 h,培养72 h后则无特异性荧光出现,表明在细胞外金银花对BVDV活性起到了良好的抑制作用。随着金银花与BVDV在体外作用时间的增加,病毒对照组TCID_(50)极显著高于试验组(P0.01)。BVDV与金银花作用0,6,12 h后感染细胞,试验组与病毒对照组样品中BVDV mRNA相对含量均差异极显著(P0.01)。细胞内试验组免疫荧光试验结果显示,金银花作用24 h样品仍有少量特异性荧光,而作用36 h和48 h样品则无特异性荧光。随着金银花与BVDV作用时间的增加,病毒对照组TCID_(50)逐渐增大;而试验组TCID_(50)基本不变,与病毒对照组差异极显著(P0.01)。细胞内的BVDV与金银花作用36,48 h后,试验组与病毒对照组样品中BVDV mRNA相对含量差异极显著(P0.01)。说明金银花可对细胞内外的BVDV活性起到良好的抑制作用,可以抑制BVDV的活性。