鸡肠炎沙门氏菌ompA基因的克隆与B细胞表位预测

根据Gen Bank中的鸡肠炎沙门氏菌ompA基因序列,设计了1对引物,成功克隆出鸡肠炎沙门氏菌ompA基因,扩增产物大小为1053bp。采用DNA Star Protean程序,综合运用二级结构、亲水性、可塑性和抗原性指数等参数,对鸡肠炎沙门氏菌ompA基因的氨基酸序列进行了B细胞表位预测,为进一步研究鸡肠炎沙门氏菌表位疫苗和分子诊断技术的建立奠定基础。     

PRRSV-GP5基因的克隆及其蛋白结构和B细胞表位预测

应用RT-PCR扩增PRRSV-GP5目的基因,将纯化DNA与pMD18-T载体连接并转化入DH5α菌株,将阳性重组质粒进行测序和同源性对比。以此基因为材料,应用同源模型化的方法建立其3D结构和DNAStar软件预测其二级结构、亲水性、抗原指数、表面可及性及柔韧性,并综合分析了其B细胞抗原表位。结果表明,该基因高度保守,同时PRRSV-GP5蛋白呈现较规则的空间结构,其肽段32～36、51～53、140～142、146～151和196～197可能是其优势B细胞抗原表位区域,该结果将为PRRSV-GP5基因工程疫苗的研究和体外表达产物的应用提供理论依据。     

狂犬病病毒糖蛋白基因的克隆及其二级结构和B细胞抗原表位预测

对狂犬病病毒CVS株糖蛋白基因进行克隆与测序,推导出相应的氨基酸序列。然后采用Gam-ier-Robson法和Chou-Fasman法预测糖蛋白的二级结构,用Kyte-Doolittle法、Emini法和Jameson-Wolf法分别预测蛋白质的疏水性、表面可能性和抗原指数,并综合分析预测糖蛋白的B细胞抗原表位。结果表明,该蛋白结构中含有少量的α螺旋、较多的β折叠以及较为丰富的转角区域,在序列的121~126、133~137、161~165、191~193、201~204、214~216、221~225、264~267区域或其附近最有可能是B细胞抗原表位的优势区域。     

马立克氏病毒pp38基因的克隆测序和B细胞抗原表位预测

对Ⅰ型马立克氏病毒的pp38基N进行了扩增、克隆及序列测定。采用DNAStar Protean软件对pp38蛋白的二级结构、亲水性和抗原性指数等参数进行分析，并预测其B细胞表位分布。结果表明，pp38基N长873bp，包含完整的开放阅读框架，编码290个氨基酸。蛋白的B细胞表位可能位于第1～11，18～162，180-217和274-290位等氨基酸区域内或附近。本试验为pp38蛋白的表达和抗体制备奠定了理论基础。     

牛病毒性腹泻病毒HB-DCZ株E0基因的克隆与抗原表位预测

根据GenBank上发表的牛病毒性腹泻病毒(BVDV) Oregon C24V株E0基因的核苷酸序列设计1对特异性引物,应用PCR技术扩增BVDV HB-DCZ株E0基因.将PCR产物克隆到pMD18-T载体,克隆产物进行序列测定与分析.结果显示,HB-DCZ cDNA体外扩增获得特异性条带,约为687 bp.序列测定结果表明,HB-DCZ株E0基因由681个核苷酸组成,编码227个氨基酸.与已公开发表的BVDV其他毒株核苷酸和推导氨基酸序列同源性相似顺序依次为:CCSYD 99％和98.7％、QHZK10 98.4％和97.8％、VEDEVAC 98.2％和97.8％、Oregon C24V80.9％和89.9％、Yak 74.2％和81.1％.HB-DCZ与CCSYD、QHZK10以及VEDEVAC株的遗传距离较近,与国际标准毒株C24V、Yak株的遗传距离较远.运用Kyte-Doolittle方案预测氨基酸的亲水性,采用Karplus-Schulz方案预测蛋白质的柔性区域,按Jameson-Wolf方案预测抗原指数,利用Emini方案预测蛋白质的表面可及性.对预测结果综合分析,推测最有可能的B细胞表位位于N-端6～17、23～29、47～53、59～68、70～81、97～109、114～122、127～134、137～143、165～172、186～198和213～220.     

鸡传染性支气管炎病毒陕西分离株M蛋白基因的变异及其B细胞表位稳定性

以陕西8株鸡传染性支气管炎病毒（AIBV）分离株M蛋白的基因序列为基础，应用DNAStar软件中的MegAlign模块对其进行了同源性分析；用Kyte-Doolittle方法、Jameson—Wolf方法、Karplus—Schulz方法、Plot—Emini方法和Garnier-Robson方法综合预测了其中4株代表毒株的M蛋白B细胞抗原表位和二级结构。结果，8株AIBV的M蛋白主要在10～40aa和90～175aa处存在无规律的点突变，与参考毒株H52、M41、SAIB20、LX和Gray的M蛋白的核苷酸序列和预测的氨基酸序列的同源性分别介于87．4％～99．5％和96．3％～99．5％；分离株间的核苷酸序列和预测的氨基酸序列同源性分别介于91．8％～99．8％和95．4％～100％。4株代表株的M蛋白B细胞优势抗原表位都在159～164aa和181～193aa肽段区（这2个区域都包含了无规则卷曲和β-转角结构）或其附近。结果表明，AIBV分离株的M蛋白基因相对保守，只存在无规律的点突变，该变异对AIBVM蛋白B细胞表位的稳定性无影响。     

B细胞抗原表位预测方法的研究进展

抗原表位是抗原分子的主要功能单位。B细胞抗原表位的准确定位对疫苗设计、诊断试剂的研发及高通量抗体的制备均具有重要意义。作者对目前常用的B细胞线性表位预测方法和B细胞构象表位预测方法进行概述,并对不同预测方法进行比较,旨在为病原微生物抗原表位研究提供一定的理论参考。     

2株PEDV贵州分离株M基因的克隆及相似性分析

为了解贵州省猪流行性腹泻病毒(PEDV)分离株M基因的变异及分子进化情况,试验采用RT-PCR扩增、目的基因克隆与测序及生物信息学软件对贵州省分离的PEDV-GZAS株和PEDVGZHZ株M基因进行序列分析。结果表明:经RT-PCR扩增,得到的片段大小为695 bp;测序结果证实,贵州分离株M基因核苷酸序列大小为695 bp;贵州分离株PEDV-GZAS株与PEDV-GZHZ株之间同源性为84.2%;PEDV-GZHZ株与瑞士疫苗株(AF353511)之间的同源性为97.7%,与中国贵州(KF150217)、泰国(FJ158546)和美国(KF272920)分离株同源性最高为99.4%;贵州分离株PEDVGZAS株与瑞士疫苗株(AF353511)之间的同源性为97.5%,与中国贵州(KF150217)、泰国(FJ158546)和美国(KF272920)分离株同源性最高为99.3%;此次分离的2株分离株都与中国河南(EU287429)分离株同源性最低为83.1%。PEDV贵州分离株PEDV-GZAS株M基因与泰国(FJ158546)分离株遗传进化关系最近,与中国河北(JF508465)分离株亲缘关系较近;PEDV-GZHZ株与PEDV-GZAS株及参考毒株之间遗传进化关系较远。     

1型鸭疫里氏杆菌的分离鉴定及其ompA基因B细胞表位预测

本研究从贵州发病鸭中分离到1株致病菌,经生化试验、16S rRNA序列分析、血清学试验和动物回归试验,鉴定为1型鸭疫里氏杆菌(RA),药敏试验结果表明,其对头孢拉定、头孢曲松钠、头孢噻肟和氟苯尼考高度敏感;同时根据GenBank中鸭疫里氏杆菌ompA基因序列,设计1对引物,成功克隆出鸭疫里氏杆菌ompA基因,扩增产物大小为1149 bp。采用DNAStar Protean程序,综合运用二级结构、亲水性、可塑性和抗原性指数等参数,对鸭疫里氏杆菌ompA基因的氨基酸序列进行了B细胞表位预测,为进一步研究鸭疫里氏杆菌表位疫苗和分子诊断技术的建立奠定基础。     

猪圆环病毒2型去除NLS的cap蛋白基因的克隆与B细胞抗原表位的预测

本试验克隆了猪圆环病毒2型去除核定位信号的ORF2基因,并对其B细胞抗原表位进行预测.根据新分离毒株PCV2-871[1]的已知序列设计一对引物,PCR扩增其去掉核定位信号的ORF2基因,命名为pcv-581,利用引入的双酶切位点BamH Ⅰ/HindⅢ将其连接到表达载体pQE-32中,命名为pQE-pcv581转化大肠杆菌M15中,同时采用DNAStar软件对去除NLS的ORF2基因进行B细胞抗原表位的预测,为单克隆抗体的制备和抗原表位的鉴定奠定基础.     

猪内源性反转录病毒囊膜蛋白基因的克隆及其蛋白二级结构和B细胞表位预测

猪内源性反转录病毒（PERV）是与猪-人异种移植病原安全性密切相关的一类病毒。env基因编码病毒的囊膜蛋白,它与病毒的亚型分类、宿主感染范围、细胞的嗜性以及对宿主细胞的感染机制、诱导宿主产生中和抗体等密切相关。本研究利用RT-PCR的方法,从五指山小型猪外周血淋巴细胞中扩增PERV的囊膜蛋白基因并进行测序,随后用生物信息学相关软件和方法,对PERV-Env蛋白二级结构及B细胞表位进行预测。经综合分析评价,结果发现PERV-Env蛋白有18个可能的B细胞优势抗原表位区域,7个可能的糖基化位点。该分析预测结果不但有利于PERV疫苗的设计、单抗及诊断试剂研制,而且将有助于分析Env蛋白的功能及PERV对人源细胞的感染机制。     

狐源犬瘟热病毒F蛋白B细胞抗原表位基因的克隆表达

为了研究犬瘟热病毒的抗原表位区段,试验以犬瘟热病毒基因组序列为材料,根据预测的F蛋白N端含有抗原指数较高的区域,选择可能含有潜在的B淋巴细胞优势抗原表位的片段,将其连接到原核表达载体pGEX-6p-1上进行B淋巴细胞抗原表位基因的克隆表达。结果表明:该区段能够在原核载体上高效表达。     

犬瘟热病毒贵州分离株H基因的克隆及其序列分析

根据GenBank中犬瘟热病毒Onderstepoort株序列设计特异性引物,以犬瘟热病毒贵州分离株(CDV-GZ1)RNA为模板,应用RT-PCR对病毒H蛋白编码基因进行了扩增、克隆及序列分析.测序结果表明,CDV-GZ1 H基因ORF由1 824 bp组成,可编码607个氨基酸;与已发表23株其它CDV H基因核苷...     

犬瘟热病毒贵州分离株N基因的克隆及序列分析

根据GenBank中发表的犬瘟热病毒Onderstepoort株N蛋白基因序列设计两对特异性引物,采用RT-PCR扩增犬瘟热病毒贵州分离株(CDV-GZ1)的N基因,并进行克隆与序列分析。结果显示,CDV-GZ1株N基因的ORF全长1572 bp,其编码氨基酸序列与国外Shuskiy株和01-2689株的同源性分别为98.9%和97.1%,与部分国内分离株同源性在95%以上,说明N蛋白是保守性较强的结构蛋白。     

RHDVCD株VP60主要抗原表位基因的克隆与序列分析

本实验用RHDVCD株人工感染家兔,发病死亡后,取肝脏匀浆,用Trizol试剂从匀浆上清中提取病毒RNA。根据Genbank已发表序列保守区设计并合成引物,采用RT-PCR方法扩增了RHDV衣壳蛋白VP60主要抗原表位基因。PCR产物纯化后,进行序列测定。测序结果表明,VP60主要抗原表位基因长525bp。该序列与已发表的其它13株RHDVVP60同一核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行同源性比较。结果显示,CD株核酸序列与WX-84株同源性最高为97．5％,与其它毒株的同源性在92．0％～96．6％之间。氨基酸序列与WX-84株、墨西哥Mexi—co-89株同源性最高为99．4％,与其它毒株的同源性在96．6％N98-3％之间。     

新型鸭肝炎病毒GD1株VP1结构蛋白的基因分析及B细胞抗原表位预测

对新型鸭肝炎病毒(DHV)GD1株VP1结构蛋白基因进行了扩增、克隆及序列测定。采用DNAStar Protean软件对VP1蛋白的二级结构、可塑性、亲水性、表面可能性及抗原指数等参数进行分析,综合预测其B细胞表位分布。结果表明,VP1基因长720 bp,编码240个氨基酸。与国内和韩国分离的新型毒株的氨基酸序列相似性最高,分别为99.6%,92.9%和92.5%。与台湾新型DHV的序列相似性均较低,分别为80.6%,80.2%,与传统的Ⅰ型DHV毒株的序列相似性最低,相似度仅为25.5%。较1型DHV存在多个氨基酸的插入和较多氨基酸位点的突变,高变区主要集中在180～220位。VP1结构蛋白的二级结构较为复杂,含有较多的β片层结构和转角结构,有多个区域为B细胞优势表位。该方法预测的B细胞表位结果有较高的准确度,为试验确定新型DHV毒株的VP1结构蛋白的B细胞表位和新的多表位疫苗设计提供了理论基础。     

猪链球菌2型溶血素B细胞表位预测

目的预测猪链球菌2型(SS2)溶血素(SLY)B细胞表位。方法以DNAstar分析为主,综合分析二级结构、亲水性、表面可及性及抗原性指数,辅以吴玉章氨基酸抗原指数计算方法进行SS2溶血素B细胞表位预测。结果推测最有可能的B细胞表位位于溶血素N端第74～85、231～244区域位。结论应用多参数预测SS2溶血素的特征,为表位疫苗的研制奠定了基础。     

产气荚膜梭菌贵州分离株α-毒素基因的克隆与鉴定

提取了A型产气荚膜梭菌贵州分离株的染色体DNA，经聚合酶链反应(PCR)扩增并回收获得了1条242bp的特异性片段，将该基因片段克隆到质粒载体pUC19中，并转化至大肠埃希氏菌JM109中；经氨苄青霉素(Amp)抗药性和显色反应筛选及重组质粒酶切分析、PCR鉴定和Southern-blotting检测，表明该重组质粒是产气荚膜梭菌α-毒素基因的克隆。     

绵羊痘病毒ORF121基因的序列分析及其B细胞表位预测

选取GenBank上4株不同绵羊痘毒株ORF121基因序列,采用DNASTAR软件对该基因序列进行同源性分析,并以B细胞表位分析参数及蛋白质二级结构分析数据,综合预测ORF121蛋白B细胞表位.结果表明:4株不同绵羊痘毒株OBF121基因核苷酸序列的同源性为99%;在ORF121蛋白的肽链中,35～46、76～82、160～167区段亲水性强,35～45、54～83、90～124、130～139、144～158和160～167区段柔韧性好,37～45、112～116、129～137和143～167区段抗原指数高,33～45、78～83和159～167区段表面可及性高,30～57和151～170区段可形成一定的空间构象.结果说明ORF121基因在不同的绵羊痘病毒流行株之间非常保守,ORF121蛋白35～45、160～167区段可能是B细胞表位优势区,具有潜在的疫苗或/和诊断价值.     

绵羊痘病毒ORF121基因的序列分析及其B细胞表位预测

选取GenBank上4株不同绵羊痘毒株ORF121基因序列,采用DNASTAR软件对该基因序列进行同源性分析,并以B细胞表位分析参数及蛋白质二级结构分析数据,综合预测ORF121蛋白B细胞表位。结果表明：4株不同绵羊痘毒株ORF121基因核苷酸序列的同源性为99％;在ORF121蛋白的肽链中,35～46、76～82、160～167区段亲水性强,35～45、54～83、90～124、130～139、144～158和160～167区段柔韧性好,37～45、112～116、129～137和143～167区段抗原指数高,33～45、78～83和159～167区段表面可及性高,30～57和151～170区段可形成一定的空间构象。结果说明ORF121基因在不同的绵羊痘病毒流行株之间非常保守,ORF121蛋白35～45、160～167区段可能是B细胞表位优势区,具有潜在的疫苗或／和诊断价值。