隆林山羊ACSS2基因的克隆及序列分析

根据藏系绵羊的ACSS2基因序列设计克隆引物,并以隆林山羊肌间脂肪组织为模板克隆ACSS2基因并测序。利用在线生物信息学软件分析ACSS2蛋白的序列特性,分析不同物种间ACSS2基因的进化关系及三级结构,从而预测隆林山羊ACSS2基因的功能。结果发现,隆林山羊ACSS2基因CDS全长2 103bp,由18个外显子组成,编码701个氨基酸残基。与牛(NM_001105339)、人(NM_018677)、绵羊(XM_012114899)、小鼠(NM_019811)序列的ACSS2基因相比较,核苷酸相似性分别为97.9%、91.5%、97.6%和88.2%,氨基酸的相似度分别为98.4%、93.6%、97.4%和91.9%。其中绵羊较山羊多出13个氨基酸(G279-Q291,GKPKEKPKHIRPQ)。隆林山羊ACSS2蛋白与其他物种间具有相似的三级结构系统,且与绵羊和牛具有较近的亲缘关系,而与猪的亲缘关系较远。     

山羊c-Myc基因的克隆及序列分析

为了克隆出山羊c-Myc基因的CDS区序列,本研究利用RT-PCR技术,参照GenBank报道的绵羊、牛、猪、马等的c-Myc基因CDS区序列设计出特异性引物,从山羊胚胎皮肤组织中扩增出山羊c-Myc CDS区序列并进行序列分析。结果表明,山羊c-Myc基因CDS区全长1320 bp （包括终止密码子）,与绵羊c-Myc基因核苷酸序列（GenBank登录号：Z68501.1）比对仅有10处存在差异,其核苷酸序列同源性为99.17%,推导的氨基酸序列同源性为99.09%;与其他物种进行同源性分析结果显示,山羊c-Myc基因CDS区与猪、狼、人、大鼠、小鼠的核苷酸序列同源性分别为91.2%、92.0%、90.2%、86.9%、86.0%,推导的氨基酸序列同源性分别为93.6%、96.1%、92.3%、91.1%、89.6%;生物信息学软件分析结果表明,山羊c-Myc蛋白产物定位于细胞核并含有HLH结构域。本研究为进一步了解c-Myc基因的功能及探讨其在山羊体细胞重编程过程中的作用奠定了基础。     

山羊KIFI基因分子克隆及序列分析

利用Primer 3.0设计出1对特异性引物F和R,以成年山羊基因组DNA为模板,扩增山羊的KIFI基因,将其克隆至pGEM-T载体,转化后挑取阳性菌落进行酶切及测序鉴定。结果表明,克隆所得的472 bp序列(GenBank登录号：GQ988385),包括山羊KIFI基因的Exon 1全长、部分5′UTR和部分Intron 1序列。山羊KIFI基因的Exon 1序列编码116个氨基酸,与绵羊、牛、马、人和家鼠的同源性分别为98%、90%、90%、88%和84%。KIFI基因部分序列的克隆,为进一步研究KIFI基因多态性与绵、山羊绒用性能间的相关性奠定基础。     

山羊KIFI基因分子克隆及序列分析

利用Primer 3.0设计出1对特异性引物F和R,以成年山羊基因组DNA为模板,扩增山羊的KIFI基因,将其克隆至pGEM-T载体,转化后挑取阳性菌落进行酶切及测序鉴定。结果表明,克隆所得的472 bp序列(GenBank登录号:GQ988385),包括山羊KIFI基因的Exon 1全长、部分5′UTR和部分Intron 1序列。山羊KIFI基因的Exon 1序列编码116个氨基酸,与绵羊、牛、马、人和家鼠的同源性分别为98%、90%、90%、88%和84%。KIFI基因部分序列的克隆,为进一步研究KIFI基因多态性与绵、山羊绒用性能间的相关性奠定基础。     

山羊Hairless基因片段的克隆及序列分析

为了探讨Hairless基因在山羊毛发生长中的特异性功能,选用已经报道的Hairless基因的保守序列设计引物,对内蒙古绒山羊的基因组DNA进行PCR扩增,将扩增的目的片段克隆后测序,得到一段长1985bp的DNA序列,共涉及3段外显子和2段内含子,分别与已公布的牛和绵羊Hairless基因的cDNA序列比对,确定该绒山羊Hairless基因的特异性。     

山羊BLG基因侧翼区的克隆及序列分析

克隆奶山羊β-乳球蛋白基因5′、3′调控区并对其进行序列分析。从徐淮奶山羊组织中提取基因组DNA,采用高保真长模板PCR法克隆得到山羊β-乳球蛋白基因4.2 kb的5′调控区和1.8 kb的3′调控区。将纯化后的PCR产物克隆到pGEM-TEasy载体中,经酶切鉴定和序列测定验证克隆的正确性。部分序列分析表明,5′区与GenBank中登录的山羊和绵羊BLG基因5′区同源性分别为100%和95%;3′区同源性则分别为99%和93%。克隆得到的奶山羊BLG调控区与山羊BLG伪基因显著不同,5′区和3′区同源性分别为83%和88%。结果表明,克隆得到的奶山羊BLG调控区可用于构建乳腺特异性表达载体,为指导外源基因在转基因动物乳腺中的高效表达奠定了基础。     

隆林山羊肌细胞生成素基因的序列分析与结构预测

为了丰富优良地方品种隆林山羊的肌细胞生成素(myogenin,MyoG)基因遗传学基础信息,并探究其序列结构及其对山羊肌肉的发育分化调控机理。本研究设计1对特异性引物,采用PCR和克隆技术成功获得隆林山羊MyoG基因2419 bp长的DNA序列。结果表明,该基因包括3个外显子、2个内含子、部分5'UTR和3'UTR区,编码区DNA序列长675 bp,共编码224个氨基酸,该氨基酸序列无信号肽序列和跨膜结构。经同源性分析可知,隆林山羊MyoG编码区核苷酸序列及其编码的氨基酸序列与其他物种比对结果和氨基酸系统进化树的聚类结果相符,均显示隆林山羊与哺乳动物中的绵羊、牛和野猪的亲缘关系最近,氨基酸同源性达到95%以上。因此隆林山羊MyoG基因在哺乳动物中具有较高的保守性,而MyoG基因的克隆、序列分析和结构预测将为今后该基因的表达与调控、肉质改良、山羊开发利用等研究提供了更充分的分子生物学基础信息和理论依据。     

广西隆林山羊MyoG基因的序列分析与结构预测

为了丰富优良地方品种隆林山羊的MyoG基因遗传学基础信息,并探究其序列结构及其对山羊肌肉的发育分化调控机理,设计1对特异性引物,采用PCR和克隆技术成功获得隆林山羊MyoG基因2419bp长的DNA序列,其包括3个外显子,2个内含子和部分5'UTR和3'UTR区,编码区DNA序列长675bp,共编码224个氨基酸.结构预测分析表明,MyoG所编码的氨基酸序列无信号肽序列和不存在跨膜结构.隆林山羊MyoG编码区核苷酸序列及其编码的氨基酸序列与其他物种比对结果和氨基酸系统进化树的聚类结果相符,均证明隆林山羊与哺乳动物中的绵羊、牛和野猪的亲缘关系最近.隆林山羊MyoG基因的克隆、序列分析和结构预测为今后该基因的表达与调控、肉质改良、山羊开发利用等的研究提供了更充分的分子生物学基础信息和理论依据.     

山羊Toll样受体2基因的克隆及序列分析

为了研究山羊Toll样受体2(TLR2)基因,试验采用RT-PCR技术,根据已发表的牛、猪、绵羊TLR2基因序列的保守区设计1对引物,扩增山羊TLR2基因的cDNA,连接T载体,克隆测序得到长度为2355 bp的序列,提交至GenBank(序列号为Gu984768.1),分析TLR2基因的核酸和氨基酸序列并与其他物种的...     

波尔山羊线粒体融合蛋白2基因的克隆及序列分析

线粒体融合蛋白2(mitofusin-2,MFN2)是位于线粒体外膜上的跨膜蛋白,也是外膜的信号分子和药物作用靶蛋白,它在细胞增殖、分化、凋亡和多种疾病中起着重要作用。为深入研究山羊MFN2基因在炎症疾病过程中的分子作用机制,本试验采用RT-PCR的方法克隆了波尔山羊MFN2基因,并对其进行了序列测定及其编码蛋白的结构分析。结果显示,克隆得到的波尔山羊MFN2基因大小为2 441 bp,其编码的蛋白由705个氨基酸组成。波尔山羊MFN2基因种间同源性低,存在Fzo-mitofusin结构域、DLP-2结构域,是结构保守蛋白;存在1个潜在跨膜区,位于576—595位氨基酸(loop1);不存在信号肽。试验首次克隆了波尔山羊MFN2基因,为探索山羊MFN2基因与炎症发生之间关系的分子机制提供了基础数据。     

山羊HABP4基因的克隆、序列分析及功能预测

旨在克隆简州山羊HABP4基因,鉴定与HABP4互作蛋白的mRNA表达水平并分析其相关性,为进一步探讨HABP4基因在调控山羊细胞凋亡中的作用奠定基础。于四川省简阳大哥大牧业有限公司随机选取10月龄左右,体重为55 kg左右的健康简州大耳羊公羊（16只）,清晨空腹屠宰后迅速采集各山羊心、肝、脾、肺、肾、小肠、大肠、瘤胃和胰腺9个组织样本,TRIzol法提取组织总RNA,并反转录cDNA。RT-PCR技术克隆山羊HABP4基因cDNA序列,利用在线软件进行生物信息学分析;利用实时荧光定量PCR （RT-qPCR）技术检测HABP4基因在不同组织中的表达量（n=16）以及分析在胰腺（n=16）组织中与该HABP4蛋白可能存在相互作用的10个蛋白的mRNA表达特性及其相关性。结果,成功扩增山羊HABP4基因1 496 bp,包含5'UTR 61 bp,CDS区1 254 bp,3'UTR 181 bp,编码417个氨基酸残基。HABP4 mRNA在山羊各组织中均有表达,在胰腺中表达水平最高,且与UAB52呈极显著正相关,和RPL32、RPS9呈显著正相关,推测其在细胞定位、新陈代谢、多生物过程及生物过程负调节以及翻译起始、核糖体转录、细胞质代谢等方面发挥着重要作用。本研究成功克隆山羊HABP4基因cDNA全长1 496 bp,其可能与UAB52、RPL32和RPS9呈显著正相关。这些结果也为进一步探讨HABP4在调控细胞凋亡过程中的作用提供了参考数据。     

山羊ADD1基因部分序列的克隆与分析

提取湘东黑山羊基因组总DNA，用所设计的3对引物以聚合酶链式反应扩增山羊ADD1（Adipocyte Determination and Differentiation factor-1）基因，并进行克隆测序。序列分析表明所克隆的山羊ADD1基因包含exon 2～8、intron 2～7序列，将序列提交GenBank，获2个登录号：DQ480338、DQ487874；对编码序列（exon 2～8）与牛、人同区域进行Blast对比，同源性分别达到了96．14％和83．82％，所翻译氨基酸序列与牛属同源性更高达97．9％；此外，通过不同引物的测序结果比较，分别在exon6的第42处和intron6的第82处发现了一个碱基突变（C→T）和碱基插入／缺失（G／-），前者属于沉默突变，未引起氨基酸的变化。     

山羊Ets-1基因cDNA的克隆与序列分析

根据GenBank已收录的牛(Bos taurus)、人(Homo sapiens)和小鼠(Mus musculus)等物种Ets-1基因序列的同源保守区域,设计特异性引物,采用RT-PCR和RACE技术,分离并克隆了西农萨能奶山羊(Capra hircus)Ets-1基因的cDNA序列。该序列全长2 263 bp(GenBank登录号HQ589338),包括5’UTR 331 bp,CDS 1 326bp和3’UTR 606 bp,编码441个氨基酸组成的蛋白质。核苷酸序列分析发现,山羊编码序列与牛、猪、人、小鼠等的相应序列同源性分别为98%、94%、92%和90%,3’UTR相应序列为96%、83%、81%和77%,5’UTR相应序列为98%、85%、82%和71%。氨基酸序列分析发现,山羊与牛、猪、人和小鼠的Ets-1的相似性较高,均在95%以上。蛋白质结构分析发现,其蛋白质分子量为50 340.8 D,等电点为5.08,具有典型的螺旋-转角-螺旋结构域,不存在跨膜结构,并且整个序列不含信号肽。     

牦牛SCD基因的克隆和生物信息学分析

为研究牦牛硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD)基因的生物学功能,以正在培育的无角牦牛新品种为研究材料,设计引物对其SCD基因的CDS区进行基因克隆,并利用EMBOSS等程序进行生物信息学分析。结果表明:无角牦牛SCD基因CDS区长度为1 080 bp,蛋白编码359个氨基酸残基;相比普通牛,无角牦牛新品种SCD基因的扩增片段共检测出7个碱基差异,分别为1次A颠换为C、2次C颠换为A、1次A转换G、2次C转换T、1次T颠换为A;对氨基酸序列比对发现,仅第1、第6、第7处的差异使得对应的氨基酸发生变化;牦牛SCD基因编码蛋白的分子式为C1922H2912N506O514S11,分子量约41.7 k D,理论等电点(p I)为9.23,消光系数83 895,不稳定系数44.41,疏水指数86.96,平均亲水性-0.235,属不稳定可溶性碱性蛋白质,在哺乳动物网织红细胞内的半衰期30 h;牦牛SCD基因编码蛋白的二级结构由α螺旋、β折叠、延伸链以及随机卷曲结构构成;该蛋白也具有低复杂结构以及跨膜结构。     

山羊促性腺激素释放激素1基因外显子克隆及序列分析

促性腺激素释放激素1(gonadotropin-releasing hormone 1,GnRH1)是GnRH存在于脑下垂体的主要形式,它在调节生殖内分泌系统产生促性腺激素方面起着主要作用。根据牛GnRH1基因全序列设计3对引物,采用PCR-SSCP技术检测GnRH1基因外显子2、3和4在高繁殖力山羊品种（济宁青山羊）、中等繁殖力山羊品种（波尔山羊）和低繁殖力山羊品种（内蒙古绒山羊和安哥拉山羊）中的单核苷酸多态性,分析该基因对山羊高繁殖力的影响;并对山羊GnRH1基因3个外显子进行克隆测序,推导出编码的氨基酸序列,然后将山羊核苷酸和氨基酸序列与牛、人、狗、黑猩猩、猴、大鼠和小鼠7个物种的序列进行同源性比较。结果表明,在4个山羊品种中均未检测到GnRH1基因3个外显子的多态性;8个物种的核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为73.6%～99.3%和62.0%～97.8%。可见,哺乳动物GnRH1基因外显子2、3和4序列保守性较强,该区域可能不是影响山羊高繁殖力的功能结构域。     

山羊骨形态发生蛋白2基因外显子克隆及序列分析

设计4对引物,采用PCR-SSCP技术检测骨形态发生蛋白2（bone morphogenetic protein 2,BMP2）基因外显子2、3在济宁青山羊、安哥拉、波尔、内蒙古绒山羊4个品种共191个个体中的单核苷酸多态性,分析该基因对济宁青山羊高繁殖力的影响,并对济宁青山羊BMP2基因2个外显子进行克隆测序。结果表明,4对引物的扩增片段在4个山羊品种中均无多态性;山羊扩增片段核苷酸和氨基酸序列与人、黑猩猩、牛、犬、大鼠、小鼠6个物种的同源性分别为86.5%～91.3%和88.8%～99%;与其他物种相比,山羊BMP2扩增片段推导氨基酸序列存在3处特有突变,分别是位于第131、353、365位的脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸变为苏氨酸(P131T)、天冬氨酸(V353D)、脯氨酸(L365P)。可见,哺乳动物BMP2基因外显子2、3序列保守性强,该区域可能不是影响山羊高繁殖力的功能结构域。     

山羊脑多头蚴线粒体nad1基因的克隆及序列分析

本研究旨在阐明脑多头蚴湖南分离株线粒体烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)脱氢酶亚单位1基因(nad1)部分序列(pnad1)的遗传变异情况,并用pnad1序列重构脑多头蚴与其他带科绦虫的种群遗传关系。利用聚合酶链反应(PCR)扩增脑多头蚴的pnad1,应用ClustalX 1.81程序对序列进行比对,再用Phylip3.67程序MP法和Mage4.0程序NJ法绘制种系发育树,并用Puzzle5.2程序构建最大似然树,同时利用DNAStar 5.0中的Megalign程序进行同源性分析。结果显示,所获得的pnad1序列长度分别均为430 bp,湖南分离株与已知多头带绦虫位于同一分枝。由于脑多头蚴pnad1序列种内相对保守,种间差异较大,故均可作为种间遗传变异研究的标记,从而为脑多头蚴的分子流行病学和其相关疾病的诊断奠定基础。     

山羊ACSS2基因的克隆、序列分析及组织表达研究

本研究旨在对山羊乙酰辅酶A合成酶2(acetyl-CoA synthetase 2,ACSS2)基因进行克隆和生物信息学分析,并检测其在山羊不同泌乳时期乳腺组织中的表达量变化。以山羊乳腺组织RNA为模板,采用RT-PCR方法扩增并克隆山羊ACSS2基因完整CDS区序列,对测序结果进行生物信息学分析,并对ACSS2基因在山羊不同泌乳时期乳腺组织中的表达量进行分析。结果显示,山羊ACSS2基因CDS区序列长2 106 bp,编码701个氨基酸;山羊ACSS2基因与牛、马、人、犬、猪、小鼠和鸡的同源性分别为97.8%、92.0%、91.3%、91.3%、91.1%、88.1%和73.3%。蛋白理化性质分析结果表明,ACSS2蛋白分子质量为78.72 ku,理论等电点为6.03,属于酸性蛋白;跨膜结构和信号肽分析表明,ACSS2蛋白不含跨膜结构和信号肽;结构域分析表明,该蛋白含有1个乙酰辅酶A合成酶N端结构域。亚细胞定位分析结果表明,该蛋白主要分布在内质网(44.4%)、线粒体(33.3%)、细胞质(11.1%)和细胞核(11.1%)中。蛋白质结构预测发现ACSS2蛋白含有α-螺旋(29.10%)、延伸链(21.54%)、β-转角(9.84%)及无规则卷曲(39.52%)。实时荧光定量PCR分析结果表明,ACSS2基因在不同泌乳时期均有表达,其中在泌乳中期表达量最高,在干奶期表达量最低。本试验结果为进一步研究山羊ACSS2基因在脂质代谢过程中的功能及转录调控机制提供了参考。     

山羊催乳素受体基因部分片段的克隆与序列分析

采用PCR技术扩增出济宁青山羊催乳素受体基因长892 bp的片段，该片段含有97 bp的部分外显子8序列（外显子8全长为100 bp）、683 bp的内含子8、70 bp的外显子9及42 bp的部分内含子9。将该片段克隆到pGEM-T Easy质粒中，重组质粒用PCR进行阳性克隆鉴定，然后测定核苷酸序列，并推导其氨基酸序列。该序列与绵羊、母牛、人、大鼠、小鼠的催乳素受体基因mRNA的对应序列的核苷酸同源性分别为99.4 %、97.01%、89.22%、89.22%、88.02%，氨基酸同源性分别为100%、94.55%、81.88%、81.82%、83.64%。