MDR1基因shRNA真核表达质粒的构建

为了构建靶向MDR1基因的短发夹RNA(shRNA)真核表达重组质粒,试验针对MDR1基因序列选取3个干涉靶点,设计合成3条编码shRNA的DNA模板,分别定向克隆到真核表达质粒pSilencer 3.1-H1中构建重组质粒,再进行菌落PCR扩增和测序鉴定。结果表明:菌落PCR扩增得到与预期大小相同的阳性带,经DNA测序证实插入片段完全符合设计要求,序列无突变。说明成功构建了3个靶向MDR1基因的真核表达重组质粒pSilencer 3.1-H1 shRNA。     

猪A-FABP基因真核表达载体的构建及其组织表达

本实验以长白猪背最长肌为实验材料,进行组织RNA的提取及A-FABP基因的克隆,构建p EGFPN1-A-FABP真核表达载体,并通过脂质体转染成纤维细胞,48 h观察荧光表达。同时应用荧光定量PCR法检测猪7种不同组织(心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背最长肌、腿肌)中A-FABP基因的差异表达。结果表明:成功构建p EGFP-N1-A-FABP融合表达载体,并在细胞中表达绿色荧光蛋白;A-FABP基因在7种组织中均有表达,其中背最长肌和腿肌中A-FABP基因的表达量最高,与其他组织相比差异极显著(P0.01),而脾脏和肾脏中的表达量相对于心脏、肝脏和肺脏差异显著(P0.05),而A-FABP基因表达量在心脏、肝脏和肺脏中差异不显著(P0.05)。表明该基因能够在真核载体和细胞中表达,并且在猪不同组织的表达具有差异性。     

血红素氧合酶-2基因真核表达载体的构建

为构建血红素氧合酶-2（HO-2）真核表达载体pEF1α-HO-2-AcGFP,并观察其在小鼠脑血管内皮细胞中的表达情况。试验利用PCR技术从C57BL/6小鼠海马组织中扩增出HO-2基因cDNA序列,用双酶切法将此序列克隆到真核表达载体pEF1α-IRES-AcGFP上,构建HO-2的真核表达载体pEF1α-HO-2-AcGFP,重组载体经EcoRI和BamHI双酶切和测序鉴定。电穿孔法转染小鼠脑血管内皮细胞,48h后,实时定量PCR、Western blot检测HO-2在小鼠脑血管内皮细胞中mRNA和蛋白质水平的表达情况。结果表明,pEF1α-HO-2-AcGFP载体构建正确;重组载体转染小鼠脑血管内皮细胞后HO-2在mRNA水平表达量较空载体转染极显著增高（P〈0.01）,在蛋白水平表达量较空载体转染显著增高（P〈0.05）。表明HO-2基因的真核表达载体pEF1α-HO-2-AcGFP构建成功,为进一步研究其机制和功能奠定了基础。     

PLptn真核载体的构建 表达及其趋化活性测定

趋化因子是一种能够趋化和活化白细胞的细胞因子,在炎症和免疫反应中发挥着重要的作用,现在发现的趋化因子有CXC,CC,CX3C和 C共四族.淋巴细胞趋化因子(Lptn) 为趋化因子C家族成员,可由CD8+ T 细胞、NK 细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、γδT 细胞等多种细胞产生,主要作用于CD4+ T 细胞、CD8+ T 细胞、NK 细胞、B 细胞、中性粒细胞等[1].Lptn的结构、功能等在人及小鼠中研究较为深入,目前人和小鼠的Lptn单克隆抗体已实现商品化生产.Zavala-Flores L M等[2]已成功用乳酸杆菌表达了人淋巴细胞趋化因子,并在体外做了活性验证,而Lptn的研究在猪体内却未见相关报道.为此本研究构建了猪淋巴细胞趋化因子(PLptn)真核表达载体,并转染至猪脐静脉血管内皮细胞系(SUVEC),在体外测定了其趋化生物学活性,为进一步研究其功能奠定了基础.     

大鼠BDNF基因真核表达载体的构建

从23日龄大鼠脑组织中抽提总RNA,应用RT-PCR技术扩增脑源性神经营养因子(BDNF)基因片段,将此片段克隆入T载体,酶切反应鉴定。然后双酶切BDNF-T载体和空质粒pEGFP(N1),将所获目的片段和线性空载体用T4 DNA连接酶连接,构建真核表达载体pEGFP(N1)-BDNF,并进行酶切反应鉴定及DNA测序。序列测定的结果与GenBank比较,所克隆的BDNF基因从起始密码子ATG到终止密码子TAG全长共750 bp序列完全相同。结果表明成功构建真核表达载体pEGFP(N1)-BDNF,为进一步研究BDNF基因表达,神经系统疾病治疗和生物制药奠定基础。     

猪带绦虫TS018基因真核表达载体的构建及其表达

采用PCR从重组克隆载体pGEM—TSO18中扩增出猪带绦虫六钩蚴TSO18基因，与毕赤酵母分泌性表达载体pPIC9k相连接，构建重组表达载体pPIC9k—TSO18，转化大肠埃希氏菌JM109，经测序证实，基因序列完全正确。制备重组质粒pPIC9k—TSO18，用SalⅠ线性化，并电转化毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115，使重组表达载体与酵母染色体发生同源整合。采用G418抗性梯度法筛选得到高拷贝重组菌株，以甲醇进行诱导表达，SDS—PAGE和Western-blotting分析结果表明，诱导表达的培养上清中表达出具有反应活性的16ku重组蛋白，目的蛋白约占培养上清液中蛋白总量的80％以上，诱导72h目的蛋白表达量为0．5mg／mL。     

表达3个外源基因真核表达载体的构建

为构建可以同时表达3个外源基因的真核表达载体,本实验以pCAGGs载体为骨架,引入SV40启动子及单疱疹病毒(HSV)TK基因的polyA序列,并且在β-actin启动子下游插入内部核糖体进入位点序列(IRES),构建了能够同时表达3个外源基因的真核表达质粒pCAGGs-IRES.本研究将PR8流感病毒的M基因、绿色荧光蛋白基因EGFP及H1N1猪流感病毒的HA基因,分别克隆于pCAGGs-IRES载体的3个启动子下游,转染细胞后,通过间接免疫荧光和western blot表明本实验构建的pCAGGs-IRES载体能同时表达3个外源基因.该载体有望为基因疫苗、基因操作及蛋白质相互作用等研究提供新的真核表达载体.     

奶牛MC4R基因真核表达载体的构建及其表达定位

奶牛黑素皮质素受体-4(MC4R)基因作为G蛋白偶联受体,是关系经济性状的重要候选基因。本研究从牛基因组中克隆得到MC4R基因的编码序列,将克隆片段与pc DNA3.1真核表达载体进行KpnⅠ和EcoRⅠ双酶切,连接形成重组表达载体,将载体瞬时转染到L02肝脏细胞,采用免疫荧光对细胞进行标记,通过激光共聚焦显微镜观察荧光活性,结果发现克隆的MC4R基因序列长度大约1 000 bp,成功构建真核表达载体MC4R-3.1,将载体转染肝脏细胞后Western blot检测蛋白表达,经过激光共聚焦观察荧光后发现MC4R蛋白的绿色荧光在细胞膜上有正常表达,可为进一步研究MC4R受体基因功能提供参考。     

猪Mx1基因真核表达载体的构建、鉴定及其表达

为获得转Mx1基因的阳性陆川猪成纤维细胞,本研究以干扰素诱导猪成纤维细胞Mx1基因表达,提取细胞总RNA,RT-PCR获得编码猪Mx1蛋白的cDNA;以pMSCV-IRES-GFP为骨架构建猪Mx1基因表达载体pMSCV-IRES-GFP-Mx1,并利用脂质体2000介导重组质粒转染陆川猪胎儿成纤维细胞,通过荧光观察和PCR检测分析结果表明Mx1蛋白基因整合进入陆川猪胎儿成纤维细胞。     

家兔Zfx基因shRNA干扰载体构建及验证

研究主要是为了构建出针对家兔Zfx基因的shRNA重组载体及效果验证。根据家兔Zfx基因mRNA序列特征,设计出3条shRNA片段,再与线性化的pLL 3.7载体进行连接重组,最后经过qRT-PCR检测Zfx基因mRNA表达量筛选出有效重组表达载体并通过体内试验进行效果验证。结果表明:试验组shRNA-c和shRNA-f干扰效率分别为74%和67%,与空白对照组相比差异极显著(P<0.01);试验组shRNA-e干扰效果为17%,与空白对照组相比差异不显著(P>0.05)。用shRNA-c和shRNA-f进行体内试验,结果显示,两试验组雄性率分别为44.92%(P>0.05)和33.16%(P<0.01)。本试验成功构建针对家兔Zfx基因的重组载体,体内试验显示子一代出现性别偏移,说明Zfx基因对动物的性别决定有一定作用,关于导致体内验证出现反转的原因仍需进一步验证。     

猪Mx1基因真核表达载体的构建及表达

根据GenBank中猪Mx1基因序列设计并合成引物,对Mx1基因ORF区全长1 992个碱基进行扩增。将扩增片段与pVax1载体连接,构建pVa-Mx1-ORF真核表达载体。将构建的表达载体导入BHK-21和HEK-293细胞进行表达,用RT-PCR和间接免疫荧光对表达产物进行鉴定。结果表明,所构建的pVa-Mx1-ORF表达载体在BHK-21和HEK-293细胞中成功表达。     

绵羊NYD-SP27基因真核表达载体的构建及表达

为了构建绵羊NYD-SP27基因重组真核表达载体,进一步研究该基因的功能,试验根据GenBank中公布的绵羊NYD-SP27基因序列设计引物,克隆绵羊NYD-SP27基因,将其连接至真核表达载体pmcherry-n1中,在目的基因和红色荧光蛋白之间通过猪捷申病毒2A肽(P2A)连接以实现共表达,将重组质粒pmcherry-Flag-NYDSP-P2A转染至HEK-293FT细胞中,48 h后通过荧光显微镜可观察红色荧光,构建NYD-SP27真核表达载体成功。结果表明:重组质粒pmcherry-Flag-NYDSPP2A在HEK-293FT细胞中得以表达;P2A在NYD-SP27蛋白和红色荧光蛋白翻译过程中已起到自我剪切的作用。     

猪IL-2基因真核表达载体的构建及在酵母中的表达

用真核表达引物从pGEM-IL-2重组质粒中扩增出猪IL-2基因，将目的基因和真核表达载体pPIC9K连接转入E．coli的JM109中，得到了猪pPIC9K-IL-2重组表达质粒。通过电激法将经SalⅠ酶切线性化的pPIC9K-IL-2质粒转化到巴斯德毕赤酵母GS115感受态细胞中，利用甲醇诱导表达，经SDS-PAGE电泳分析，表明在摇床水平及发酵罐中均表达出约17ku大小的分泌性目的蛋白，采用Sephadex G-100分子筛层析对其表达产物进行纯化，纯化结果理想。     

牛HSL基因shRNA干扰载体的构建及筛选

HSL基因所编码的激素敏感性脂酶对脂质代谢具有重要的调控作用,不仅能催化水解脂肪组织中的甘油三酯,还能水解不同组织的胆固醇酯,在机体能量供应和类固醇生成中发挥重要作用。为进一步研究HSL基因功能,本试验设计并构建4个HSL基因shRNA干扰载体,并将干扰载体转染到牛胎儿成纤维细胞中以及和设计构建过表达载体共转染到293T细胞中,转染48 h后,分别检测细胞内牛HSL基因的mRNA和蛋白质表达水平,筛选出具有较高干扰效率的shRNA表达载体。结果表明,在牛胎儿成纤维细胞中,4个shRNA载体在转染48 h后,shRNA-731组细胞中HSL基因的mRNA表达量显著低于shRNA NC对照组(P0.05),且干扰效率最佳;同时,在shRNA载体与过表达载体共转染293T细胞中,HSL基因的mRNA和蛋白表达水平显著低于shRNA NC对照组(P0.05)。本研究为进一步探讨HSL基因功能提供了有效工具,也为研究其与牛脂肪代谢相关关系奠定了理论基础。     

小鼠MyoD基因真核表达载体的构建与检测

为了最终建立诱导小鼠iP S细胞为成肌细胞的方法,试验在克隆小鼠Myo D基因的基础上,将其与pc DNA3.1载体连接,以构建真核表达载体;采用脂质体法将重组质粒转染到小鼠胚胎成纤维细胞中,利用Real-time PCR技术、免疫荧光检测和流式分析等技术对转染前后细胞的Myo D基因表达情况进行检测。结果表明:成功克隆获得Myo D基因,并构建真核表达载体Myo D-pc DNA3.1;转染Myo D-pc DNA3.1的小鼠胚胎成纤维细胞经免疫荧光检测后在荧光显微镜下呈现表达Myo D基因的红色;Real-time PCR检测其Myo D基因相对表达量提高至8.926±0.010;经BD Accuri-C6个人型流式细胞仪检测,约有93%的转染细胞表达Myo D蛋白,在荧光倒置显微镜下可观察到表达Myo D蛋白而呈现的绿色荧光。说明已成功构建特异表达Myo D基因的真核表达载体Myo D-pc DNA3.1。     

抗菌肽Cecropin P1基因真核表达载体的构建

选择大肠杆菌偏爱密码子，人工设计合成3条抗菌肽Cecropin P1基因寡核苷酸片段，通过PCR扩增得到抗菌肽Cecropin P1基因的全序列，并将其克隆到T-easy载体上，经双酶切重组于真核表达质粒pcDNA3.1（+）上，经酶切鉴定和序列分析，抗菌肽Cecropin P1基因表达载体构建成功。抗菌肽Cecropin P1基因表达载体的成功构建，为进一步研究其抗菌活性、抗菌机理及应用等打下基础。     

柔嫩艾美耳球虫Serpin基因真核表达载体的构建及其瞬时表达

为了解柔嫩艾美耳球虫(E.tenella) Serpin基因的生物学特性,本研究采用PCR技术扩增去除信号肽后的Serpin基因,得到1 204 bp的特异性片段,并构建重组表达质粒pVAX1-Serpin,将其瞬时转染HeLa细胞.间接免疫荧光检测表明Serpin基因在HeLa细胞中得到了表达,western blot显示表达蛋白分子量约为47 ku,具有较好的反应原性.该研究结果为E.tenella Serpin核酸疫苗的研究奠定了基础.     

猪睾丸ACE启动子驱动的SPAG6 shRNA真核表达载体的构建

本文旨在研究猪睾丸ACE启动子驱动的SPAG6 shRNA在猪睾丸支持细胞（ST）中的干扰作用。利用PCR法从ST细胞基因组中扩增猪睾丸ACE启动子,构建重组质粒ACE-pIRES2-DsRed、ACE-pGL3-basic,通过红色荧光蛋白表达和双荧光素酶报告基因检测试验检测猪睾丸ACE启动子在ST细胞中的转录活性;根据SPAG6 mRNA靶序列设计合成3条siRNA序列,通过脂质体转染至ST细胞,利用实时荧光定量PCR及Western Blot检测siRNA的干扰效率;基于人miR-30a结构设计SPAG6 shRNA,构建重组载体ACE-sh-SPAG6-pcDNA3.1,Western Blot检测其对SPAG6的干扰效果。结果表明,成功构建重组质粒ACEpIRES2-DsRed、ACE-pGL3-basic,并证明猪睾丸ACE启动子在ST细胞中具有较强的转录活性;各试验组均能对靶基因SPAG6 mRNA的表达产生抑制作用,以siRNA-3的作用最佳。siRNA-3转染48 h后,SPAG6蛋白表达量显著下降（P<0.001）,成功筛选出SPAG6基因的最佳干扰序列;成功...