冷冻原肠中细菌基因组DNA提取方法的建立

为建立冷冻原肠中细菌基因组DNA的直接提取法,采用震荡洗脱、金属网过滤和梯度离心相结合的方法,对2份冷冻原肠样品进行前处理;对经前处理后的原肠样品,采用酚/氯仿法提取细菌基因组DNA,然后进行琼脂糖电泳和OD_(260)/OD_(280)比值测定;以细菌基因组DNA为模板,用PCR技术扩增细菌16S rDNA并构建克隆文库,并从2个文库中各随机挑取3个菌落进行16S rDNA的PCR鉴定和DNA测序。结果显示:样品提取的DNA浓度、纯度较高,OD_(260)/OD_(280)比值介于1.8～2.0;挑取的6个菌落中,1个为阴性,剩余5个为阳性,为肠球菌属(Enterococcus)和魏斯氏菌属(Weissella)的5种细菌。结果表明,本研究提取的原肠细菌基因组DNA质量较好,可用于非培养法研究冷冻原肠中细菌的多样性。本研究解决了因缺乏原肠细菌基因组DNA提取方法,无法进一步应用现代分子生物学方法研究冷冻原肠细菌的多样性、菌群组成结构和动态变化等难题。     

奶牛瘤胃微生物DNA提取法的研究与优化

试验通过对提取瘤胃微生物DNA常用的方法进行比较,优化出一种可以获得完整瘤胃微生物总DNA片段的方法,使其能进一步满足PCR的扩增要求以及后续的分子生物学研究。试验的瘤胃液样本取自3只装有瘘管的荷斯坦奶牛,将方法适当改进。结果表明:珠磨-CTAB法提取的总DNA片段长度大于20 kb,OD260/OD280在1.8以上,DNA的提取效果最稳定。同时对所提的DNA样本应用PCR方法进行了检测,成功扩增出长度分别为1 500 bp、1 000 bp左右的瘤胃细菌和古细菌的16S rDNA序列。结果证明了该方法所提取的瘤胃微生物DNA可以应用到后续的试验研究工作中。     

不同处理方法对细菌气溶胶样本基因组DNA回收率的影响

为分析不同处理方法对空气中细菌气溶胶样本基因组回收率的影响,本研究利用玻璃纤维滤膜采集空气样品中的微生物气溶胶后,针对采样膜的不同处理(钢珠敲打、研磨、MOBIO PowerWater试剂盒)进行DNA提取方法比较,结果表明利用MOBIO PowerWater DNA Isolation Kit对采样膜进行基因组DNA的提取能获得高纯度的DNA(OD_(260nm)/OD_(280nm)=1.82);利用荧光定量PCR技术对所回收基因组进行定量分析,验证该处理方法的样品DNA得率最高,达到15.81%。起始模板浓度的对数与对应的CT值成反比且具有极强的线性关系,其线性相关系数R~2为0.9985。本研究将对养殖场等环境空气中病原体气溶胶样本处理具有重要指导意义。     

不同前处理方法对生鲜乳中布鲁氏杆菌DNA检测结果的影响

为了研究不同前处理方法对生鲜乳中布鲁氏杆菌DNA检测结果的影响,试验采用PBS冲洗法、4℃过夜法、离心法三种方法对乳样进行前处理,用多功能酶标仪和琼脂糖凝胶电泳法对提取的DNA质量进行评估。结果表明:采用4℃过液法得到的OD_(260)/OD_(280)值最高且得到的条带最亮,采用PBS法得到的DNA浓度最高。因此,采用4℃过夜法提取乳样中布鲁氏杆菌基因组DNA的效果最好。     

鸡基因组DNA不同提取方法的比较

为选择适合鸡全血DNA提取的方法,满足鸡育种中基因检测对DNA的要求,试验研究了酚-氯仿、试剂盒和优化盐析法提取鸡全血DNA。优化盐析法提取鸡血液基因组DNA,经核酸蛋白定量仪检测,优化盐析法所得DNA的纯度OD_(260)/OD_(280)达1.855±0.036,所提DNA质量较好,利用DNA样本为模板进行PCR扩增,可以得到满意的扩增效果。与酚-氯仿、试剂盒的方法相比,优化盐析法节约了时间和成本,所需仪器简单,是一种较好的提取鸡全血DNA的方法,适合生产中大批量鸡血液基因组DNA提取。     

绵羊瘤胃微生物基因组DNA提取方法的探讨

本研究针对瘤胃内容物成分复杂、微生物种类繁多,且难于培养和分离这一特点,本着为采用免培养技术研究瘤胃微生物提供前期样本这一目的,对现在常用的五种基因组DNA提取方法进行了比较。试验结果得出应用珠磨-SDS/CTAB/PVP法所提瘤胃微生物基因组DNA质量及纯度较好,总DNA长度大于20kb,OD260/OD280在1.7以上。同时对所提的DNA应用PCR方法进行了检测,可以成功扩增出瘤胃中的古细菌、真细菌和真菌16/18SrDNA片断,进一步证明了此方法的优越性及可行性,为后续一些分子生物学试验提供质量较高的DNA模板。     

水牛全血基因组抽提方法优化

[目的]通过比较三种提取水牛全血基因组DNA的方法,获得一种安全、高效、快速的DNA提取方法,为水牛基因功能的研究奠定基础。[方法]收集43头水牛抗凝血样,每份血样随机分为等量3份,每份血样2mL,分别使用试剂盒改良法、试剂盒说明书法及酚仿抽提法提取全血基因组DNA。比较分析三种方法提取的同一头牛三份血样DNA的含量、OD260/280值、琼脂糖凝胶电泳和基因扩增结果。[结果]三种方法提取DNA的含量由高到低依次为试剂盒改良法、酚仿抽提法、试剂盒说明书法,各组间差异显著(1376.72±127.54VS 1121.32±81.64VS 326.18±21.17,P0.05)。三种方法提取DNA的OD-260/280值依次增加,试剂盒改良法与试剂盒说明书法OD260/280值差异不显著(1.85±0.0017 VS1.86±0.0021,P0.05),与酚仿抽提法OD260/280值有显著差异(1.85±0.0017VS 1.88±0.0029,1.86±0.0021VS 1.88±0.0029,P0.05)。三种方法提取DNA琼脂糖凝胶电泳结果显示,试剂盒改良法和试剂盒说明书法DNA条带清晰、光密度高,酚仿抽提法条带模糊有拖带现象。三种方法所提取的基因组PCR扩增stat5基因获得较清晰准确的条带,扩增效果良好。[结论]试剂盒改良法用于水牛全血基因组的提取比试剂盒说明书法和酚氯仿法更安全、高效、便捷。     

不同介质冷冻保存鸡血样基因组DNA提取效果比较

以-20℃保存10年的仙居鸡血样为试验材料,研究不同保存介质(乙醇和裂解液)对基因组DNA效果的影响,以确定更适合的保存介质长期保存血样。琼脂糖凝胶电泳检测结果显示:裂解液保存10年的家禽血样中提取的DNA条带清晰,没有降解现象;75%乙醇保存10年的血样中提取的DNA条带有弥散拖尾现象,DNA降解严重。两种不同介质保存的血样提取的DNA的OD_(260)/OD_(280)值在1.8~1.9之间,纯度均较高,两者之间差异不显著。裂解液保存的血样提取的DNA浓度极显著高于75%乙醇保存的血样提取的DNA浓度(P0.01)。说明75%乙醇保存的血样可以常温保存一段时间,适合长途运输,但不太适合长期-20℃冷冻保存血样;裂解液保存的血样更适合较长时间-20℃冷冻保存。     

一种快速鸡血样DNA提取方法的研究

本试验优化了鸡血样DNA提取方法,通过分光光度仪检测浓度达到216.35±100.02 ng/μL,OD260/OD280值1.83±0.28,与血液基因组提取试剂盒提取的DNA比较,差异显著(P0.05)。DNA样品经琼脂糖凝胶电泳检测带型清晰、整齐,无拖尾现象。结果显示,本法提取的鸡血样DNA在纯度和浓度上能够满足鸡分子基因检测的需求。     

东北梅花鹿瘤胃微生物基因组的DNA提取

为了优化东北梅花鹿瘤胃微生物DNA的提取方法,试验将鹿麻醉后采用穿刺法采集瘤胃液,采用物理、化学相结合的方法提取瘤胃微生物DNA,筛选东北梅花鹿瘤胃微生物DNA提取的理想方法。结果表明:提取东北梅花鹿瘤胃微生物基因组DNA的最理想方法是粪便基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN)的反复冻融法。     

犊牛盲肠微生物总DNA的提取方法

采用反复冻融法、玻璃珠法和超声波+反复珠磨的方法提取犊牛盲肠的微生物总DNA,并对以上三种方法进行比较,从中确定最佳的方法,以实现普通实验条件下成功提取符合PCR扩增要求的DNA.经紫外分光光度分析表明,超声波+反复珠磨的方法所得的DNA的A<,260>/A<,280>的比值为1.81,0.8%琼脂糖凝胶电泳结果显示,所提DNA片段分子量大于20 kb,适于酶解和PCR扩增要求.以提取的DNA样品为模板,利用细菌通用引物,对其16S rDNA进行PCR扩增,获得了1.7 kb大小特异性很好的预期条带.这是研究犊牛盲肠微生物的关键一步.     

应用羽毛无损鉴别鹌鹑早期性别的方法

试验旨在探寻一种无损、价廉、耗时短,可用于大批量鹌鹑早期性别鉴定的方法。采用4种不同方法(试剂盒法、加热法、碱裂解法和碱裂解-乙醇洗涤法)提取鹌鹑羽毛样品的基因组DNA,使用凝胶电泳检验DNA质量,紫外分光光度计测定其浓度和纯度;选择最佳的羽毛DNA提取方法,应用PCR法检测3日龄鹌鹑的性别。基因组DNA提取电泳结果显示,仅碱裂解-乙醇洗涤法提取的DNA与试剂盒提取的DNA出现条带的位置相同;紫外分光光度计测定结果表明,试剂盒法获得的DNA浓度值远低于其他3种方法,其中碱裂解法浓度最高;OD₂₆₀/OD₂₈₀比值以试剂盒法和碱裂解-乙醇洗涤法(裂解10 min)为高,OD₂₆₀/OD₂₃₀比值以试剂盒法最高,碱裂解-乙醇洗涤法(裂解10 min)次之。PCR结果显示,除碱裂解法原液无目的条带外,其余各组均出现目的条带;碱裂解法操作步骤少、时间最短,加热法和碱裂解-乙醇洗涤法次之。综合分析选择碱裂解-乙醇洗涤法对70只鹌鹑进行性别鉴定,羽毛PCR鉴定性别结果与性腺解剖结果的符合率为100%,卡方分析检...     

一种禽类血液基因组DNA高效提取通用方法的建立

为了建立一种适合禽类血液的廉价、高效、通用的基因组DNA提取方法,试验采用鸡、鸭、鹅、鸽、火鸡、麻雀6种禽类血液为材料,提取的禽类血液DNA经微量分光光度计分析、基因组DNA凝胶成像分析以及PCR扩增效果检测。结果表明:提取的6种禽类血液DNA质量较好(OD260/OD280值范围为1.80~1.84,OD260/OD230值范围为2.21~2.30),基因组DNA电泳主条带和PCR扩增产物条带清晰、整齐、无拖带。说明本方法能够完全适用于大批量禽类血液基因组DNA的提取,且DNA纯度较好,满足后续相关分子生物学试验要求。     

秦川牛瘤胃微生物DNA提取方法的比较试验

[目的]本试验的目的是优化秦川牛瘤胃微生物DNA提取方法。[方法]针对秦川牛特有的生理及生物学特性,采取珠磨法、反复冻融法、液氮研磨法、超声波法提取微生物DNA,并获得一种提取秦川牛瘤胃胃微生物DNA的最佳方法。[结果]珠磨法、反复冻融法提取的DNA片段较完整,DNA含量较高。[结论]珠磨法和反复冻融法是较科学的提取方法。     

蒙古马肠道细菌总DNA提取方法的比较

本试验采集蒙古马新鲜粪便样品,采用酚－氯仿抽提法和2种细菌基因组DNA提取试剂盒法进行样品中细菌基因组DNA的提取。通过DNA浓度和纯度的测定,并将其作为模板扩增细菌16S rDNA V3区特异性片段对提取效果进行比较,从而找出更适合蒙古马粪便中细菌基因组DNA的提取方法。结果显示,3种提取方法得到的基因组DNA均能用于PCR扩增的模板,其中B试剂盒法提取的DNA数量较多,且纯度高,更适合用于提取蒙古马肠道微生物细菌基因组DNA及后续的蒙古马肠道微生物多样性等分子生物学试验。     

犬传染性肝炎病毒单克隆抗体的研究 Ⅴ.单克隆抗体亲和层析纯化犬传染性肝炎病毒

应用四株识别抗原位点不同、亲和力不等的ICHV单克隆抗体与CNBr活化的Sepharose 4B交联,制备亲和层析柱纯化CAV-1。纯化的CAV-1 OD_(260)/OD_(280)=1.108、1%琼脂糖电泳出现一条带,电镜观查可见完整的ICHV粒子。     

一种高效提取桑树根围土壤微生物总DNA的方法

为了建立桑树根围土壤微生物群落结构的分子生态学试验技术体系,采取不同的细胞裂解方法及DNA沉淀方法直接提取桑树根围土壤微生物总DNA,并以采用试剂盒提取的桑树根围土壤微生物总DNA为参照,筛选出一种能有效提取高纯度、多样性土壤微生物总DNA的方法:以十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、溶菌酶、蛋白酶K、十二烷基磺酸钠(SDS)为裂解液,经反复冻融裂解细胞,在DNA提取液中添加聚乙烯吡咯烷酮K30(PVP K30)、牛血清蛋白(BSA)、CaCl2去除腐殖酸,并结合聚乙二醇8000(PEG8000)沉淀和纯化DNA。该方法简便、快速,获得的桑树根围土壤微生物基因组DNA分子长度在23 kb以上,土壤鲜样的微生物DNA产率为11.2μg/g,且纯度较高,D(260 nm)/D(230 nm)=1.42,D(260 nm)/D(280 nm)=1.37,可直接用于PCR扩增及变性梯度凝胶电泳(DGGE)分析。     

鹌鹑肠道微生物总DNA的最佳提取方法

为了获取高质量、较完整的肠道菌群基因组DNA,试验采用常规的饱和苯酚/氯仿法(方法一)、牛瘤胃DNA的提取法(方法二)和对上述两种方法进行优化后得到的肠道微生物DNA的提取法(方法三)对鹌鹑肠道微生物总DNA进行了提取,并对结果进行了比较。结果表明:应用方法一和方法二提取的DNA浓度比较低,电泳显示样品DNA条带没有方法三明亮;以方法三提取的肠道总DNA为模板,采用细菌通用引物,对其16S rDNA V3可变区进行PCR扩增,得到较清晰的图谱,条带整齐。说明采用方法三提取鹌鹑肠道微生物DNA较完整,可用于后续的分子生物学试验研究。     

大肠埃希菌质粒DNA提取方法的优选

采用酚/氯仿少量提取法、异丙醇沉淀法、煮沸法以及微波炉法提取细菌质粒,然后分别对各种方法所提取的质粒进行琼脂糖凝胶电泳分析,并用紫外分光光度计测定其OD值,对其优劣性进行全面的分析.结果表明,异丙醇提取法所提取的质粒DNA纯度和产量高(其DNA片段荧光较强,具有清晰的亮带,OD260/ OD280约为1.77,DNA样品浓度约为195 μg/mL),且重复性好,具有结果稳定的特点,达到了分子生物学试验要求,适合大多数实验室使用.     

4种改良CTAB法提取石榴成熟叶片DNA的比较研究

【目的】研究从成熟石榴叶片中提取高质量基因组DNA的方法。【方法】根据成熟石榴叶片组织中富含多酚、多糖的特点,以峄城中国石榴种质资源圃20种石榴成熟叶片为材料,分别采用改良CTAB法(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ)4种方法提取成熟石榴基因组DNA,通过琼脂糖凝胶、紫外分光光度计分析、ISSR扩增等方法检测所提取DNA的质量。【结果】改良的CTAB Ⅳ法能从各个石榴品种的成熟叶片中提取出基因组DNA,琼脂糖电泳胶孔干净,无拖带,且DNA的纯度和完整性都较好,OD260 nm/OD280 nm的比值均在1.8~2.0之间,无降解现象,其质量、产量都高于其他改良CTAB法。经ISSR- PCR扩增结果表明,此方法提取的基因组总DNA完全适于ISSR分析。其主要的步骤是：在石榴叶片的研磨中添加Vc、PVP等抗氧化物质,加入CTAB提取液后65 ℃水浴30 min后冷却至室温,离心条件为15℃,10 000 r/min,10 min,DNA粗提液用氯仿抽提3次,可获得高质量的DNA。【结论】改良的CTAB Ⅳ法能有效地从石榴成熟叶片中提取到高质量的基因组DNA。