糯玉米SSR—PCR反应体系优化与引物筛选

在利用SSR分子标记研究糯玉米（waxyCOrn）遗传多样性的过程中,为了获得清晰、重复性好的SSR扩增结果,对影响SSR—PCR的包括模板浓度、Taq酶的选择和用量、Mg2＋和dNTPs浓度等因素进行了筛选和优化,确定糯玉米SSR—PCR分析的最适扩增体系为：总体积20μl．1μl模板DNA（20ng／μl）、1UTaq酶、0．5umol／L引物、1．5mmol／LMgCl2、0．2mmol／LdNTPs、1XPCR—buffer。该反应体系可用于糯玉米遗传多样性的分析。     

蜡梅SSR反应体系建立及引物筛选

以素心蜡梅为材料,分别通过对影响蜡梅SSR扩增效果的模板DNA,dNTP,引物浓度,Taq酶和退火温度等因素的筛选,建立了其适宜的蜡梅SSR分子标记反应体系,同时筛选了适宜蜡梅SSR扩增引物.结果表明,蜡梅SSR扩增的适宜退火温度为55 ℃,在20μL反应体系中,蜡梅模板DNA质量浓度、dNTP引物浓度分别为5mg·L...     

水稻耐盐性SSR标记引物的筛选

[目的]针对两个典型的水稻品种(系)耐盐材料(02-11和津源85)和两个敏感材料(秋田小町和99-28),进行水稻耐盐相关的SSR标记的研究.[方法]选取水稻12条染色体上的565对SSR引物进行亲本间多态性筛选;选择适合的标记引物,并确定PCR扩增的最适退火温度.[结果]在565对引物组合中筛选出68对引物在4个材料间有多态性;明确了主要标记引物的通用退火温度为55℃.[结论]68对可作为该水稻群体耐盐QTL分析的SSR标记引物,为进一步进行水稻耐盐性分子鉴定和耐盐分子辅助育种提供参考.     

线辣椒SSR-PCR反应体系优化及多态性标记筛选

以循化线辣椒果实黄色突变体H0809和高代自交系0599-1为试材,采用L_9(3~4)正交试验设计,研究线辣椒SSR-PCR反应体系的主要成分对扩增结果的影响,并对420对SSR分子标记进行筛选。结果表明,最优的反应体系为:总体积20μL,基因组DNA 20 ng,dNTP 100μmol·L~(-1),引物0.6μmol·L~(-1),Mg~(2+)2.5 mmol·L~(-1),Taq DNA聚合酶1.5μmol;通过筛选,获得72对具有多态性的SSR标记,多态性率为17.1%,平均每个标记扩增出2.67个等位基因。本试验建立的SSR-PCR反应体系和筛选的多态性标记可用于线辣椒种质资源分析、分子标记辅助育种、分子遗传图谱构建及基因克隆等研究。     

荷花ISSR引物筛选及反应体系优化

利用加拿大哥伦比亚大学(UBC)公布的100条ISSR引物,以2个荷花品种的DNA为模板进行PCR扩增。采用单因素试验方法对荷花ISSR-PCR反应体系的5个因素(Mg2+、引物、dNTP、模板DNA、Taq酶)进行浓度优化,确定了荷花ISSR反应的25μL最佳扩增体系为:10×Taq Buffer 2.5μL,Mg2+3.0 mmol/L,dNTP 0.2 mmol/L,引物1.0μmol/L,Taq酶1.00 U,模板DNA 40 ng。筛选出8条扩增条带较好的ISSR引物,并对其引物进行梯度PCR试验,筛选出各引物对应的最佳退火温度,扩增共计获得61条ISSR条带。     

悬铃木SSR反应体系建立及引物筛选

以三球悬铃木组培苗为试验材料,对影响SSR-PCR扩增效果的退火温度、dNTP、引物浓度、Taq酶量及悬铃木DNA等因素的筛选,建立适宜的悬铃木SSR-PCR分子标记反应体系。结果表明,在20μL-1体积中,50℃退火温度、4 ng.μL-1模板DNA、0.2 mmol.L-1 dNTP、0.05 U.μL-1 Taq酶量和0.6μmol.L-1引物浓度是悬铃木的最适SSR反应体系。此外,利用该体系筛选出了54对适合悬铃木SSR扩增的引物。     

蜡梅AFLP反应体系优化及引物筛选

通过对影响AFLP反应体系主要因素的优化,建立了蜡梅的AFLP反应体系,并筛选出了适宜该体系分析的引物.结果表明,20μL蜡梅AFLP最佳酶切体系为模板600 ng DNA,3 U Pst I和3 U Mse I,在37℃下双酶切2 h;在20μL最佳连接体系中酶切产物为15μL,3 U T4连接酶,0.25μmol.L-1 Pst I接头,2.5μmol.L-1 Mse I接头,1μL 10×T4 Buffer,在22℃下连接10 h;在20μL最佳预扩反应体系中稀释10倍的连接产5μL,2.0mmol.L-1 Mg2+,2 U Taq酶,300μmol.L-1dNTP,0.5μmol.L-1 Pst I和Mse I引物(P+AGA/M+ATC);在20μL最佳选择性扩增反应体系中5μL稀释20倍的预扩增产物,2.0 mmol.L-1的Mg2+,2 U Taq酶,300μmol.L-1 dNTP,0.5μmol.L-1 Pst I和Mse I引物(P+AGA/M+ATC).最后,利用上面的体系筛选出了96对适宜于蜡梅AFLP分析的引物.     

葛根SCoT-PCR反应体系优化及引物筛选

[目的]优化葛根SCoT-PCR反应体系,筛选适用于葛根的SCoT引物,为利用SCoT分子标记进行葛根种质资源鉴定、遗传多样性分析及分子标记辅助育种提供技术支持.[方法]采用正交设计对SCoT-PCR反应体系中的DNA模板量、dNTPs浓度、Mg2+浓度、TaqDNA聚合酶量和引物浓度5个因素进行优化,利用最佳SCoT-PCR反应体系筛选出适用于葛根的SCoT引物,并对该体系进行验证.[结果]最佳葛根SCoT-PCR反应体系20.00μL:DNA模板50.00ng,dNTPs 0.25mmol/L,Mg2+1.50mmol/L,引物0.80μmol/L,TaqDNA聚合酶0.50U.利用该体系从36条SCoT引物中筛选出35条可从葛根中扩增出清晰条带的引物.使用3条引物对18个葛根材料进行PCR扩增,PCR产物表现出良好的重复性、稳定性和丰富的多态性.[结论]建立的最佳葛根SCoT-PCR反应体系和筛选获得的35条SCoT引物可适用于葛根种质资种鉴定、遗传多样性分析、相关分子标记开发等研究.     

蓝莓SRAP—PCR反应体系的建立优化及引物筛选

为进一步利用分子标记技术进行蓝莓品种鉴定及种质资源遗传多样性的分析,拟建立蓝莓新型SRAP标记(相关序列扩增多态性)的优化PCR体系并进行引物组合的筛选.运用改良CTAB法所提取的蓝莓幼嫩叶片的DNA,采用单因子试验,分析了模板DNA浓度、引物浓度、退火温度等影响SRAP-PCR的主要参数,建立了适合蓝莓SRAP-PCR的优化体系,20 μL的PCR反应体系:模板DNA浓度120 ng、引物浓度0.40μmoL/L、2×TaqPCR Master Mix 10 μL,剩余体积用去离子水补足;最佳PCR扩增程序的退火温度为50℃.并从80对SRAP引物组合中筛选出条带清晰且多态性丰富的15对引物组合.     

白芨属SRAP引物筛选及反应体系优化

为给白芨种质遗传多样性评价、分子标记辅助育种和遗传改良研究提供基础,建立适于白芨SRAP-PCR扩增的反应体系,利用L16(45)正交试验设计对白芨SRAP-PCR反应体系中的各影响因子进行探索.结果表明:Mg2+浓度为影响白芨SRAP-PCR反应的关键因素;在优化的20μLSRAP-PCR反应体系中各组分的最适含量为10×Buffer 2.0 μL,Mg2+2.5 mmol/L,dNTPs 0.5 mmol/L,引物0.2μmol/L,Taq酶1.0U,模板DNA 2.0 ng/μL.利用SRAP反应体系,从72对SRAP引物组合中筛选出条带清晰、扩增稳定、多态性好的引物15对.     

广西莪术SSR-PCR反应体系优化和引物筛选研究

以广西莪术(Curcuma kwangsiensis S.G.Lee et C.F.Liang)嫩叶为材料,采用单因素和正交试验设计建立和优化SSR-PCR反应体系和反应程序,对最适宜退火温度(Tm)进行筛选优化,对17对已公布的姜黄属通用性引物进行扩增试验,筛选出多态性好、条带清晰的引物。结果表明,建立了适合广西莪术SSR分析的反应体系和扩增程序,即在15μL体系中,DNA模板为30 ng/μL,3μL,Mix(包含DNTP、Mg2+、1×buffer、Taq酶)为5μL,dd H2O为6μL,引物为各0.5μL时,分析效果较好,扩增程序为94℃预变性5min;94℃变性30 s,根据不同引物的退火温度复性30 s,72℃延伸1.5 min,共35个循环;最后72℃延伸5 min;反应结束后,4℃保存。同时筛选出在试验材料中能产生较清晰主带的引物共12对,初步验证了应用SSR分子标记分析在广西莪术遗传多样性的可行性。     

糯玉米SSR-PCR反应体系优化及多态性引物筛选

用L25(56)正交设计建立和优化糯玉米SSR-PCR反应体系;利用370对SSR引物对糯玉米两亲本及F1进行扩增,筛选抗丝黑穗病的相关引物。结果表明:20μL糯玉米SSR-PCR最优反应体系为1.5 U DNA聚合酶,1.0 nmol/μL镁离子,80 ng模板DNA,0.1 pmol/μL引物,0.15μmol/μL d NTPs,1倍扩增缓冲液;370对SSR引物对两亲本及F1进行扩增的条带显示,有差异且条带清晰的引物为87对。确立了糯玉米SSR-PCR最优反应体系,筛选并得到了87对多态性引物。     

大豆SSR-PCR反应体系优化

应用单因素试验和L16(45)正交设计对影响大豆SSR-PCR的主要参数进行优化,建立适合大豆SSR-PCR反应的最佳体系。各因素不同水平对PCR反应结果均有影响,优化后的大豆SSR反应体系为:2.0 mmol/L Mg2+、1.00μmol/L引物、0.150 mmol/L dNTP、0.5 UTaq酶、50ngDNA模板。运用优化后的反应体系对大豆进行多态性引物的筛选,从140对引物中筛选出扩增条带清晰、多态性丰富的SSR引物45对。     

水稻SSR-PCR技术反应体系的优化

以水稻为材料,研究了SSR-PCR反应体系中Mg2+、dNTPs、引物、TaqDNA聚合酶及模板DNA浓度时水稻SSR扩增效果的影响.结果表明,在试验设计范围内,Mg2+和dNTP浓度对扩增影响较大,引物浓度在1.6～3.0μmol·L-1范围内对扩增影响较小,TaqDNA聚合酶和模板DNA浓度对扩增影响也很小.确定的最佳反应体系为20μL,Mg2+浓度为1.75 mmol·L-1、dNTPs为0.20 mmol·L-1、引物为2.4 μmol·L-1、Taq DNA聚合酶为0.75U、模扳DNA为45ng.     

蒌蒿DNA提取、RAPD优化及引物筛选初报

为了能从分子水平探讨蒌蒿资源的遗传多样性、蒿属的系统分类和种质资源的鉴定,在此,报道采用小量法(SDS法)和大量法(CTAB法)提取蒌蒿DNA,建立优化的RAPD-PCR体系,并进行引物初步筛选。结果显示,两种抽提方法都可有效抽提出高质量的DNA,大量法得率要明显高于小量法,但小量法抽提的DNA也足够RAPD-PCR反应几十至上百次,不同的实验室可根据实验的需要进行选择。对两种方法抽提的DNA,都进行PCR扩增体系梯度摸索,最优的RAPD-PCR反应条件为:25μl反应体系中,含DNA模板约20ng,10×TaqDNA聚合酶缓冲液2.5μl,2μldNTPs(2.5mM),Mg2 2μl(25mM),TaqDNA聚合酶0.15μl(5U/μl),引物0.5μl(25μM),其余以双蒸水补充。在剔除了重复性差,条带模糊和单态的引物后,有九个引物表现稳定,扩增出来的条带清晰、多态性高。     

决明DNA提取、SRAP-PCR优化及引物筛选

以决明幼叶为试验材料,对6种DNA提取方法进行比较,并通过单因子梯度比较试验,对SRAPPCR扩增体系中DNA和引物浓度进行优化,在此基础上再对引物进行筛选,随后对不同方法提取的DNA运用优化的SRAP-PCR体系再次进行扩增验证。结果表明改良CTAB法是决明DNA提取的最佳方法;20μL的SRAP-PCR体系中模板最佳质量浓度为2.5mg/L,引物浓度为0.4μmol/L;运用优化体系从180对引物组合中筛选出扩增条带清晰、多态性丰富的SRAP引物72对。     

万寿菊SS-PCR反应体系的优化

实验材料为色素万寿菊雄性不育两用系'9901AB',通过对SSR-PCR反应体系中的主要因素dNTPs、引物及模板DNA进行最优条件筛选,建立了适合于万寿菊雄性不育两用系的SSRPCR反应体系:2.5μL 10×buffer、40 ng模板DNA、2μL 10μmol·μL1引物、1.0 U Taq酶、1.2μL2.5...     

割手密(S.spontanuem L.)SSR-PCR反应体系的优化

以广西割手密(S.spontanuem L.)79-9为材料,利用SDS法提取基因组DNA,采用正交试验设计优化建立了一套适用于割手密的SSR-PCR反应体系,即在25μL反应体系中包含10×PCR Buffer(Mg2+free)、模板DNA30 ng、Mg2+2.5 mmol/L、dNTP 0.24 μmol/L、引物0.6μmol/L、Taq DNA聚合酶1.5 U.运用该体系对其它4份割手密进行了检验,扩增带型清晰,证明该体系稳定可靠.     

正交设计优化稻瘟病菌SSR-PCR反应体系

[目的]筛选最佳的稻瘟菌SSR—PCR反应体系。[方法]利用正交设计对稻瘟菌SSR—PCR反应体系中的5个因素（TaqDNA聚合酶、Mg2＋、模板DNA、dNTP、引物）在4个水平上进行优化试验,筛选出各反应因素的最佳水平并进行退火温度梯度试验筛选最佳的退火温度。[结果]稻瘟菌SSR-PCR反应的最佳体系为：反应总体积为20μl,raqDNA聚合酶1．0U,Mg^2＋ 2．0mmol／L,DNA100ng,dNTP50la,mol／L,引物（ms355～356）0．4μmol/L,最佳退火温度为58．5℃。在此体系下可从稻瘟菌材料基因组DNA中扩增出300bp左右清晰的目的条带,说明该体系稳定,适用于稻瘟菌基因组DNA的SSR标记。[结论]该研究为稻瘟菌的分子标记、遗传多样性研究和分子育种奠定了基础。