葡萄灰霉病菌(Botrytis cinerea)的快速分子检测

为建立快速检测葡萄灰霉病菌的方法,根据ITS序列的差异,设计了1对葡萄灰霉病菌PCR检测的特异性引物TBCF/TBCR,并利用该引物通过常规和巢式PCR对葡萄灰霉病菌进行检测。结果显示,在优化的反应体系与扩增条件下,只有以葡萄灰霉病菌基因组DNA为模板的扩增体系中具有1条386 bp的条带,而其它病菌不产生扩增反应;其常规PCR对葡萄灰霉病菌基因组DNA的检测灵敏度为100 pg/25μL,而利用引物ITS1/ITS4和TBCF/TBCR通过巢式PCR扩增,其灵敏度可达10 fg/25μL。研究表明建立的PCR检测方法具有特异性强、灵敏度高、检测准确而操作简单快速等特点,可用于带菌土壤及发病组织中葡萄灰霉病菌的检测。     

葡萄灰霉病菌(Botrytis cinerea)的快速分子检测

为建立快速检测葡萄灰霉病菌的方法,根据ITS序列的差异,设计了1对葡萄灰霉病菌PCR检测的特异性引物TBCF/TBCR,并利用该引物通过常规和巢式PCR对葡萄灰霉病菌进行检测。结果显示,在优化的反应体系与扩增条件下,只有以葡萄灰霉病菌基因组DNA为模板的扩增体系中具有1条386 bp的条带,而其它病菌不产生扩增反应;其常规PCR对葡萄灰霉病菌基因组DNA的检测灵敏度为100 pg/25μL,而利用引物ITS1/ITS4和TBCF/TBCR通过巢式PCR扩增,其灵敏度可达10 fg/25μL。研究表明建立的PCR检测方法具有特异性强、灵敏度高、检测准确而操作简单快速等特点,可用于带菌土壤及发病组织中葡萄灰霉病菌的检测。     

基于线粒体DNA cox2基因的甜菜霜霉病的分子检测技术

[目的]建立甜菜霜霉病菌检测技术.[方法]利用等位基因特异性PCR(AS-PCR)的原理,依据线粒体DNA(mtDNA)基因cytochrome coxidase subunit Ⅱ(cox2),运用卵菌门通用引物(P-COX2F/P-COX2R)扩增甜菜霜霉病菌及6种对照霜霉病菌的目的片段,测序,比对,根据等位基因特异PCR(AS-PCR)原理设计测甜菜霜霉病菌的特异性引物,并对该引物的特异性、灵敏度加以验证;分析同源性,构建系统发育树.[结果]通用引物扩增的甜菜霜霉病菌以及其他霜霉病菌片段大小约为630 bp,经比对,该霜霉病菌与Peronospora schachtii同源性达99;,并设计出特异性引物BSP-F/BSP-R,特异性引物BSP-F/BSP-R可以检测到10-2ng/μL的模板浓度.[结论]建立的甜菜霜霉病菌快速检测技术,为口岸的进出境监测与检测提供了科学依据.     

云杉叶疫病根球壳孢菌的分子检测

从四川二郎山人工云杉林分离得到云杉叶疫病病原菌,采用真菌通用引物ITS1和ITS4扩增得到的序列与NCBI中的根球壳孢菌(Rhizosphaera kalkhoffi)相似度达99%。比较分析了NCBI及四川二郎山分离到的根球壳孢菌ITS区序列,采用软件primer5.0设计20个引物。通过对32株菌株DNA进行PCR扩增及产物测序,筛选得到3个特异性引物对ZYZ6、ZYZ7、ZYZ8。改变DNA模板浓度进行扩增检测,在25μL PCR反应体系中,引物对ZYZ6F/ZYZ6R检测灵敏度最高,可达到0.1 pg/μL。利用ZYZ6F/ZYZ6R对四川二郎山人工云杉针叶DNA进行检测,扩增得到310 bp左右的条带,测序结果与Gen Bank中根球壳孢菌相似度达99%。     

草莓角斑病菌PCR检测研究

[目的]研究草莓角斑病菌的快速检测方法。[方法]根据草莓角斑病菌的hrp基因,设计了1对引物XF-F/R,进行该病菌PCR特异性扩增。[结果]该引物可特异性地扩增草莓角斑病菌的DNA、菌悬液、人工接种样品。[结论]该检测方法特异性强、灵敏度高,可适用于草莓角斑病菌的检测。     

红枣中链格孢菌的多重PCR检测

为快速、灵敏并且特异性地检测红枣中链格孢菌,选取2对链格孢菌特异引物,优化多重PCR检测中的引物比例、退火温度、d NTP浓度及Mg2+浓度等条件,结果表明多重PCR扩增出了预计的链格孢菌PCR产物,优化的条件为Alt-F2\R2∶Alt-F1\R1=3∶1、退火温度52℃、d NTP浓度0.05 mmol/L、Mg2+浓度1.5 mmol/L。该方法在检测红枣链格孢菌中具有很好的应用和开发前景。     

巢式PCR检测油茶根腐病菌的研究

为建立油茶Camellia oleifera根腐病菌层生镰刀菌Fusarium proliferatum的巢式聚合酶链式反应（PCR）快速检测体系．扩增层生镰刀菌核糖体DNA基因间隔序列（ITS）区并测定其序列,比较该序列与GenBank中近似种的ITS序列差异．设计了特异性引物GF1和GR2,利用该对引物与ITS1和ITS4进行巢式PCR扩增检测层生镰刀菌。结果显示,巢式PCR对层生镰刀菌的检测灵敏度可达100ag基因组DNA,比常规扩增方法提高了1万倍。利用设计的GF1／GR2特异性引物与ITS区通用引物进行巢式PCR扩增．可灵敏地扩增出油茶根腐病菌层生镰刀菌DNA。     

旱稻孢囊线虫的快速分子检测

根据旱稻孢囊线虫(Heterodera elachista)和常见孢囊线虫的ITS序列比对分析,设计1对旱稻孢囊线虫特异性引物He–F/He–R,特异性片段长度为281 bp。运用该特异性引物及建立的DNA提取方法和PCR体系,可特异性检测旱稻孢囊线虫单条2龄幼虫,可以从混合有1条旱稻孢囊线虫的0.1 g水稻根组织中特异性检测出目的DNA片段。特异性引物He–F/He–R与通用引物D2A/D3B结合,运用一步双重PCR检测方法可快速鉴定单孢囊,也可从初始分离的田间土壤总线虫样品中直接检测出旱稻孢囊线虫。     

番茄溃疡病菌分子检测技术

对中国三类检疫性有害生物番茄溃疡病菌(Clavibactermichiganensissubsp.michiganensis)进行PCR检测方法的研究。利用1对特异性引物ClaF1ClaR2,对5个番茄溃疡病菌进行特异性扩增,得到了一段长250bp的PCR产物,参试的其他棒形细菌以及其他属的植物病原细菌均无扩增产物。该检测方法特异性强、灵敏度高,在50pg的模板DNA浓度下还能检测到很强的条带。利用此引物可以检测到1×105个菌体。     

一种快速、特异性检测小麦中链格孢菌（Alternaria alternata）的巢式 PCR 方法

为建立检测小麦中链格孢菌（Alternaria alternata ）的方法,从河南省小麦黑胚籽粒上分离得到7个优势 A．alternata 病原菌株,对其 rDNA 的内部转录间隔区序列（ITS）进行测序,序列比较表明,分离到的病原菌株与 GenBank 公布的 A．alternata 的 ITS 区序列一致性达到99％～100％。根据 Alternaria 属菌株（A．alternata、A．tenuis、A．tenuissima）和麦类根腐离蠕孢菌（Bipolaris sorokiniana ）的 ITS 序列比对结果,设计出1对 A．alternata 特异性引物 Aa1F/Aa1R。利用多种河南省小麦的主要病原真菌对该引物的特异性进行验证,只有在 A．alternata 中能特异性地扩增出1条443 bp 的 DNA 片段。以真菌通用引物 ITS1/ITS4为外侧引物、特异性引物Aa1F/Aa1R 为内侧引物进行巢式 PCR 扩增,能检测到 A．alternata DNA 的最低质量浓度为50 pg/μL。因此,建立的巢式 PCR 方法能够快速、特异地检测小麦中的 A．alternata。     

番茄Cf-5基因的SNP分子标记开发

根据已知的叶霉病抗性基因Cf-5基因序列,设计了3对嵌套引物。以4份抗病材料和4份非抗病材料DNA为模板,扩增番茄Cf-5基因并比较了抗感材料Cf-5基因的序列,在580、2 879 bp位点分别有T与C、G与T的碱基替换,设计了等位基因特异引物,获得了稳定的等位基因PCR产物,成功地开发了抗叶霉病基因Cf-5的SNP标记,为培育抗叶霉病番茄品种奠定了基础。     

周口地区番茄白粉菌的鉴定

[目的]鉴定周口地区番茄白粉菌的形态学及分子生物学.[方法]通过显微学对周口地区的番茄白粉病菌分生孢子及孢子梗的形态、大小进行观察对比,并分析了核糖体DNA转录间隔区（ITS）和进化树.[结果]在扫描电子显微镜下病菌分生孢子呈圆柱形或椭圆形,无支链;目的序列同来自日本番茄上的O.neolycopersici（AB094991）和来自美国番茄上的O.neolycopersici（AB163915）同源性最高聚为一支,与来自韩国绣球花上的O.hortensiae（JQ669944）等由于寄主植物不同而另聚为一条分支.[结论]不同物种的白粉菌间的遗传距离较远,来自周口地区的番茄白粉菌为O.neolycopersici.     

小麦秆锈菌特异性SSR分子标记的开发

 【目的】研发简单、快速、准确的分子检测技术用于小麦秆锈菌的准确诊断和秆锈病的早期预警。【方法】采用FIASCO法构建秆锈菌基因组微卫星富集文库,分离微卫星DNA序列,设计合成小麦秆锈菌的特异性引物。【结果】根据小麦秆锈菌基因组微卫星富集文库,设计1对小麦秆锈菌特异性微卫星引物Pgtfssr1(f/r),可在来自中国不同麦区的20份小麦秆锈菌分离物基因组DNA中扩增出395 bp的特异性片段,而在小麦条锈菌、小麦叶锈菌和其它麦类病原真菌中未扩增出该特异性片段。病菌侵入寄主30 h后便可检测到特异性DNA片段的存在,灵敏度达到1 ng•μL-1模板DNA浓度水平。【结论】成功研发出小麦秆锈菌的特异性SSR分子标记,为小麦秆锈病早期诊断在生产上的应用奠定了基础。     

猕猴桃AFLP分析体系的建立及其组培变异苗的动态检测

为减少猕猴桃组培过程中变异苗带来的损失,对‘Hort 16A’猕猴桃组培继代苗进行AFLP动态监测。通过试验建立了猕猴桃基因组DNA多态性的AFLP分析体系,并对R7 R11五代75个样本进行遗传多样性分析。研究结果表明：AFLP分析体系DNA最适用量为300 ng,内切酶最适用量为1 U,酶切最适时间为4 h,T4 DNA ligase最适用量为1 U,adpter最适用量为15 μL,ATP最适用量为2 μL,预扩增引物（100 μmol·L-1）最适用量为08 μL,选择性扩增Taq酶最适用量为025 μL （5 000 U·mL-1）,筛选出条带数最多的引物有8对。在遗传多样性分性中,共得到494个条带,其中多态性条带为310条,多态性比例为627%。猕猴桃组培苗继代到第9代还能较好地保持基因遗传稳定性,从第10代开始,变异率随着继代次数的增加呈明显上升趋势。     

八倍体草莓DNA指纹图谱的构建与初步遗传分析

为对草莓品种进行分子鉴定,从59对SSR引物中筛选出18对多态性好的引物,采用毛细管电泳检测方法对84份八倍体草莓品种进行标记分析,检测每个标记等位变异大小,并进行初步遗传分析。将每个引物对84份草莓扩增的带型按照一定原则进行数字标注,为了简化编码,引物P1~P18分别编号为字母A~R,将引物编号与相应的带型编码进行组合得到该样品在特定引物的扩增产物编码,按照18对引物顺序串联这些编码形成该品种的DNA指纹图谱。结果表明:18对SSR引物共扩增得到多态性条带150个,不同引物扩增到多态性条带数4~17个,共检测到377个带型;各引物的多态性信息含量(PIC)值为0.494~0.908,平均值为 0.738;利用18对SSR引物共构建了84个草莓品种的DNA指纹图谱。聚类分析结果表明:在遗传相似系数为0.99时能将所有品种区分开,一些来源相同的品种被优先聚在一起。综上,本研究成功构建84个草莓品种的DNA指纹图谱,这些品种遗传关系较近。     

香蕉枯萎病镰刀菌ITS序列的PCR扩增及其分子检测

根据香蕉枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.cubense)ITS序列设计合成的三条引物:FusF1(5′AACCC CTGTGAACATACCACTTG3′)、FusR1(5′GAGGAACGCGAATTAACGCGAC3′)和FusR2(5′GACGATTACCAGTAGCGAGGGT3′)构成引物对A(FusF1/R1)和B(Fus F1/R2),对尖廉孢菌古巴专化型病菌进行PCR特异扩增试验,结果表明,两对引物对引起香蕉枯萎病的镰刀菌全基因组DNA分别有338bp和408bp的特异扩增产物;在镰刀菌种以上的阶元有较好的分辨力;对目标菌株的检测下限分别是A(100fg)、B(10pg);而且B对香蕉感染枯萎病的病组织有相应的扩增产物,表明该引物对可用于香蕉枯萎病的早期鉴定和病原菌的检测。     

鸡MC4R基因新突变位点的发现

[目的]为深入研究鸡MC4R基因和分子育种提供参考。[方法]采用饱和酚/氯仿法从鸡血中提取DNA,利用PCR-SSCP和DNA测序的方法,对京海黄鸡MC4R基因的单核苷酸多态性进行分析。[结果]对PCR产物进行SSCP分析,2对引物均表现出多态性。引物A得到2种基因型(AA型和AB型)。引物Z也得到2种基因型(CC型和CD型)。将测序结果与发表的鸡MC4R基因序列的比较结果进行比较,发现2个单核苷酸多态位点,其中A引物扩增序列中的多态位点为662 bp处G→C的点突变造成的,而Z引物扩增序列中的多态位点是由于在733～734 bp插入了一个C碱基引起的。[结论]该研究中未检测到BB和DD纯合基因型,这可能与在京海黄鸡培育过程中采用分子标记方法进行选择有关。     

利用SRAP分子标记技术鉴定大白菜种子纯度

以大白菜品种多抗3及其父母本为研究材料,利用SRAP（相关序列扩增多态性）分子标记方法,通过对54对SRAP标准引物的筛选,获得了能区分大白菜多抗3及其亲本的引物Me4F/Em3R。采Me4F/Em3R引物对对5份多抗3系列商品种子纯度进行检验,种子的纯度分别为75.5%、72%、80.5%、68%和73%,与田间种植...     

红掌毁灭炭疽菌的分子检测

根据GenBank中炭疽属Colletotrichum不同种的ITS序列差异,设计了毁灭炭疽菌Colletotrichum destructivum的特异性引物F1/ITS4,由此建立的PCR检测体系可以从80个毁灭炭疽菌菌株中扩增得到1条486 bp的特异性条带,而扩增其他近似或相关种的菌株时没有相应的特异性条带.该...     

安徽淮北番茄曲叶病的病原鉴定初报

采用分子手段鉴定了安徽淮北番茄曲叶病的病原.从安徽淮北番茄温室采集番茄叶片样本,用CTAB法从番茄叶片中提取总DNA.利用简并引物PA、PB进行PCR扩增,从大部分样本中扩增出双生病毒500 bp特异性条带.将扩增片段克隆并测序,该片段序列全长541 bp,与我国报道的番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)各个分离物序列相似性均很高,达到95.9%～99.4%,可以初步明确侵染安徽淮北番茄的双生病毒为番茄黄化曲叶病毒(TYLCV).安徽淮北TYLCV 500 bp片段序列与山东TYLCV相似性最高,达99.4%,而且从构建的系统关系树也可以看出,安徽淮北TYLCV与山东TYLCV的亲缘关系最近,推测安徽淮北番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)可能来源于山东.