锦鲤疱疹病毒组织灭活疫苗研制初探

本研究的目的是制备针对锦鲤疱疹病毒的组织浆灭活疫苗,用来控制目前集约化养殖鲤鱼大面积暴发的锦鲤疱疹病毒。利用现场采集的病死鱼内脏,匀浆后腹腔注射进行攻毒试验,采集攻毒后病死鱼的内脏匀浆后,加入0.5%甲醛制备组织浆灭活疫苗。确定所制疫苗无杂菌污染后,在实验室内对6组实验鱼采用不同的接种方法进行疫苗接种,同时设立阴性对照组。实验结果表明,所得疫苗可以在一定程度上降低死亡率,但不能100%的控制发病,具体原因有待进一步探讨。     

锦鲤疱疹病毒流行病学及诊断防治技术研究进展

锦鲤疱疹病毒病是由锦鲤疱疹病毒(Kio herpesvirus,KHV)引起的一种传染性疾病,主要是引起各生长阶段鲤鱼、框镜鲤、锦鲤等鳃坏死及间质性肾炎,死亡率高达60%～100%,疫情难以控制,已引起各国的高度关注。1998年锦鲤疱疹病毒病首次在以色列暴发,并迅速扩展至世界各地。2002年首次证实该病已传至     

有关锦鲤养殖的几个问题

几百年以前。在日本一个叫“霓戈塔”的小村子里,人们从食用的黑色鲤鱼中发现了一种彩色鲤鱼。在惊奇中人们开始了锦鲤的育种工作。经历了若干次的失败和考验,所有杂交锦鲤间多代持续的杂交产生了我们今天所见的五彩斑斓不同品种的锦鲤。     

锦鲤的观赏及养殖技术

介绍了13种锦鲤的品质特征与鉴赏方法，简要阐述了锦鲤的亲本选择、苗种培育、过滤池养殖及疾病防治等几个方面的问题。     

锦鲤的养殖技术

锦鲤源于中国鲤鱼,是日本的国鱼,至今养殖有200年的历史,主要可划分为13大类品系,约有100多种。锦鲤游姿高雅,体型优美,色彩艳丽,斑纹灿烂,被称为“水中活宝石”,是具有较高观赏价值的较大型鱼类。     

锦鲤疱疹病毒GZ1301株的分离与鉴定

2013年4月,广东省一锦鲤养殖场暴发不明病因疾病,濒死锦鲤在塘边游动缓慢直至死亡,死亡率高达100%。现场采样发现,发病锦鲤体长25 cm,眼球凹陷,胸鳍及腹鳍出现出血斑点,解剖发现内脏器官包括肝、脾、肾肿大。细菌分离结果显示,内脏器官肝脏和肾脏中未分离到细菌。提取自然发病鱼的肝、脾、肾、鳃组织DNA作为模板,采用世界动物卫生组织(OIE)推荐的锦鲤疱疹病毒(KHV)检测引物进行PCR扩增,均能扩增出预期大小的特异性产物。NCBI的Blast搜索结果显示,扩增序列与KHV胸苷激酶(thymidine kinase,TK)基因核苷酸序列同源性为99%。病鱼内脏组织研磨过滤除菌后,腹腔注射20尾锦鲤,可复制出与自然发病相似的症状,并于7 d内全部死亡。取病鱼的鳃和肾脏研磨过滤除菌后进行细胞感染实验,结果显示,组织滤液感染CCB细胞后,盲传5代可以观察到典型的细胞病变效应(CPE)。将出现典型CPE的CCB细胞进行超薄切片制备和电镜观察,电镜下病毒呈对称20面体,直径约100 nm。将出现典型CPE的细胞进行间接免疫荧光实验,可以观察到特异性荧光。根据TK基因全长序列建立系统进化树,证实该毒株为KHV亚洲型毒株,暂命名为KHV-GZ1301株。研究结果可为KHV起源进化、分类以及疾病防控提供重要材料。     

应用聚合酶链式反应(PCR)检测锦鲤疱疹病毒

为建立并优化锦鲤疱疹病毒检测方法,针对目前国内集约化养殖鲤鱼大面积流行的病死现象进行有针对性的检测,对在疫区采集到的病鱼肾脏、肝胰脏、肠等组织,提取基因组DNA,应用锦鲤疱疹病毒特异性引物进行PCR反应,同时设立阴性对照(TE buffer)。通过1%琼脂糖凝胶进行鉴定,与阴性对照比较,在484bp处出现特异性目的条带。经序列测定,所得PCR产物的基因序列与NCBI上锦鲤疱疹病毒的同源率达到99%以上。对同一批次的样品进行重复检测,结果表明该方法具有较好的可重复性,可据此判定结果。通过对锦鲤疱疹病毒的检测,确定了疫区引起框镜鲤(Cyprinus carpio)和建鲤(Cyprinus carpio var Jian)大批死亡的病原为锦鲤疱疹病毒(Koi Herpesvirus,KHV),从而对疫区控制、防治方案的制定提供了理论依据。建议尽快在鲤鱼主要养殖区开展KHV流行病学、诊断与检测及免疫预防等方面的研究。     

锦鲤疱疹病毒ORF72基因克隆及结构功能分析

于辽宁丹东采集感染锦鲤疱疹病毒的活鲤Cyprinus carpio样品,经DNA提取、PCR扩增、重组质粒构建步骤成功克隆锦鲤疱疹病毒ORF72基因,并利用生物信息学软件分析ORF72蛋白结构与功能,构建系统进化树。结果显示:ORF72基因开放阅读框共1113bp,编码蛋白由370个氨基酸组成,理论相对分子质量为40.5KD;ORF72蛋白主要由α螺旋、β折叠、无规则卷曲3种二级结构组成;N端35个氨基酸序列为信号肽序列。跨膜结构分析表明:ORF72蛋白无跨膜区,保守结构域预测表明ORF72含有一个保守结构域,抗原表位分析表明,抗原性较好。结构预测显示:ORF72氨基酸序列存在2个潜在的N-糖基化位点、1个潜在的O-糖基化位点、19个潜在的磷酸化位点。系统进化树分析发现,其与锦鲤疱疹病毒美国株、以色列株属同一分支。     

锦鲤养殖技术

锦鲤是从鲤鱼突变品系中选育而成的一种名贵观赏鱼类，它有绚丽的色彩和变幻多姿的花纹，具有很高的观赏价值，深受人们的喜爱，养殖前景看好。     

锦鲤疱疹病毒3型ORF126基因克隆及生物信息学分析

为研究锦鲤疱疹病毒3型(KHV-3)ORF126基因编码蛋白的功能,我们对该蛋白的结构特征进行研究分析。本实验采用PCR扩增技术获得KHV ORF126基因的完整序列,构建pMD19-T-ORF 126重组质粒,应用生物信息学方法分析ORF126基因编码蛋白的理化特征。结果显示:KHV ORF126基因翻译合成273个氨基酸;ExPasy预测该蛋白的理论分子量为29.9kDa,等电点为5.11;信号肽的切割部位最可能位于第19~20位氨基酸之间;跨膜区位于第145~168位氨基酸;抗原表位预测显示抗原性良好;编码蛋白不含N-糖基化位点,含有4个O-糖基化位点和17个磷酸化位点。     

锦鲤疱疹病毒天津株的分离与鉴定

为分析近年来天津地区养殖鲤(包括锦鲤)暴发性死亡的病因,利用病原菌分离、细胞培养、电镜观察、组织病理切片、人工感染实验、PCR和荧光定量PCR检测、基因分型等方法对患病鱼及病原进行了研究。结果显示,在患病鱼体表未发现大量寄生虫;在肝、脾、肾等内脏组织中未能分离到细菌;在鳃组织中发现大量的圆形病毒颗粒;使用患病鱼组织滤液感染锦鲤鳍条原代细胞,可观察到典型的细胞病变效应(CPE),注射患病鱼组织滤液和产生病变的细胞上清液可分别导致健康锦鲤93.3%和86.7%的死亡率;通过病理组织切片观察,主要病变组织为鳃、肝脏和肾脏。采用世界动物卫生组织(OIE)推荐的锦鲤疱疹病毒(KHV)检测方法进行PCR检测发现KHV呈阳性,且KHV在鳃组织中含量最高,肾脏次之,脑组织中最少。结合TK基因全长序列建立系统进化树和基因型分析,证实此次分离到的KHV为亚洲型毒株,属于I++II–基因型,将其命名为KHV-TJ1601株。这是我国华北地区首次报道KHV I++II–基因型的存在,可为KHV的进化分析和疫苗制备提供基础资料。     

锦鲤疱疹病毒CJ株ORF27基因克隆及生物信息学分析

为了解锦鲤疱疹病毒中国吉林株（KHV-CJ）ORF27基因编码蛋白的结构特征和进化关系,采用镜鲤尾鳍原代细胞增殖KHV-CJ,提取其DNA,经PCR扩增,获得ORF27基因,将其克隆在pMD18-T载体中,构建重组质粒。应用生物信息学方法初步分析KHV-CJ ORF27基因的结构和功能,并与GenBank上公布的三株KHV构建系统进化树。结果显示：获得207bp的ORF27基因,编码69个氨基酸;预测ORF27编码蛋白的理论分子质量为7366.62Da,等电点为4.487;抗原表位预测显示抗原性良好;编码蛋白存在1个N-糖基化位点、4个O糖基化位点和5个磷酸化位点;系统进化树分析表明与锦鲤疱疹病毒美国株（KHV-U）属同一分支。     

锦鲤养殖技术

锦鲤在动物分类系统上属于鲤鱼的变种,是一种大型观赏鲤。因为它体色鲜艳似锦,斑纹变幻多端,体色五彩缤纷,所以称它为锦鲤。1生物学属性锦鲤是世界上公认的名贵观赏鱼类,由于其个     

锦鲤疱疹病毒单交叉引物等温扩增检测方法的建立

本文根据锦鲤疱疹病毒(Koi herpes virus,KHV)保守的DNA聚合酶(Sph)基因,设计一组单交叉扩增引物,以构建的Sph基因重组质粒作为标准DNA模板,采用单交叉引物等温扩增技术(Single cross priming amplification,SCPA)进行扩增及优化反应体系,并结合核酸试纸条技术(Nucleic acid test strip detection method),建立了快速可视化检测锦鲤疱疹病毒的单交叉引物等温扩增检测方法(KHV-SCPA)。KHV-SCPA法可在63℃下60min内实现循环扩增,扩增产物经凝胶电泳呈现梯形条带,可特异性地检测出KHV,灵敏度较之常规PCR方法提高约1000倍。结合核酸试纸条检测技术,在3~5min内可对反应产物进行可视化检测。KHV-SCPA检测方法不依赖昂贵的仪器设备与专业技术人员,可应用于锦鲤疱疹病毒的现场快速检测中,为锦鲤疱疹病毒病的准确快速诊断和有效防控提供了技术支撑。     

锦鲤疱疹病毒主要囊膜蛋白基因的PCR扩增与序列分析

为了进一步研究锦鲤疱疹病毒主要囊膜蛋白（KHV-MEP）的功能及锦鲤疱疹病毒（KHV）的感染机制,根据KHV-MEP基因序列设计并合成1对引物,从自然感染KHV发病的锦鲤（Cyprinus carpio Koi）肝组织总DNA中扩增获得特异性基因片段。将所得基因片段克隆到pMD18-T Simple Vector载体中,获得重组质粒T-KMEP;酶切鉴定后进行序列测定,并采用氨基酸亲水性分析软件TMpred对其编码氨基酸序列进行分析;在对该片段所编码氨基酸可能抗原位点分析的基础上,进行PCR改造构建原核表达载体,获得重组表达载体pBV-KMEP1和pBV-KMEP2。所获得的基因片段大小为771bp,该基因片段与GenBank中已登录的KHV-MEP基因（AB178537）的同源性为100%,是一个完整的开放阅读框,所编码的蛋白由256个氨基酸组成,分子量为28.2kD,等电点（PI）为8.65。该序列含有4个跨膜区,可构成主要抗原决定簇。结果显示所获得的目的基因片段就是锦鲤主要囊膜蛋白全基因。     

锦鲤疱疹病毒-CJ株ORF81基因的克隆及生物信息学分析

为了解锦鲤疱疹病毒中国吉林株(KHV-CJ) ORF81蛋白的结构特征和进化关系,用框镜鲤尾鳍原代细胞增殖KHV-CJ,提取其DNA,经PCR扩增,获得ORF81基因,将其克隆到pMD18-T载体中,构建重组质粒.应用生物信息学方法初步分析KHV-CJ ORF81基因的结构和功能,并与GenBank上已公布的3株KHV构建系统进化树.结果显示,获得了长771 bp的ORF81基因,编码256个氨基酸;预测ORF81基因的理论分子量为28 246.50 u,等电点为8.404;疏水性大于亲水性;信号肽切割部位最可能位于29位的S(丝氨酸);有4个跨膜区;抗原表位预测显示抗原性良好;结构预测显示,不存在N-糖基化位点、存在6个O-糖基化位点和11个磷酸化位点;系统进化树分析显示,与锦鲤疱疹病毒以色列株属同一分支.     

四川地区一株锦鲤疱疹病毒的分离鉴定及系统进化分析

2015年5月,四川某鲤养殖场暴发一种传染性疾病,导致鲤大面积死亡,死亡率高达80%。为研究此次疾病病因和流行规律,将病料进行解剖、细菌学检查、病理组织观察、PCR鉴定、病毒分离和系统进化分析。结果显示,发病鱼眼球凹陷,胸鳍及腹鳍出现出血斑,病鱼鳃严重坏死,肾脏肿大。细菌检查为阴性。组织病理学观察,病变最明显的是鳃和肾脏。病鱼鳃丝血管扩张充血,鳃小片呼吸上皮细胞肿胀、脱落。鳃丝基部的上皮细胞大量增生,层次增多。肾小管上皮细胞组织结构紊乱,细胞肿胀,管腔变狭小,有崩裂和坏死现象。提取病鱼的肾脏和鳃组织DNA为模板,针对世界动物卫生组织(OIE)推荐的检测锦鲤疱疹病毒(KHV)的Sph基因进行PCR检测,出现特异性扩增产物。将病鱼的肾脏和肝脏组织研磨过滤灭菌后,腹腔注射20尾健康鲤,实验组表现为急性死亡(累积死亡率为90%),出现与自然发病鱼相同的症状。将组织匀浆接种到普通鲤脑细胞系(CCB),盲传3代后可稳定地观察到典型的细胞病变。细胞培养物染色超薄切片电镜观察结果显示,病毒为有囊膜的球状,病毒粒子直径为180~200 nm。对分离株的TK基因全长序列进行系统发育分析,证实该毒株属于KHV亚洲1型毒株。本研究首次报道我国西南地区养殖鲤中KHV感染引起大面积死亡,为KHV起源进化、分类以及疾病诊断和防控提供重要依据。     

巨型锦鲤饵料管理

锦鲤寿命较长,容易饲养,近年来锦鲤还成了“网红”用词,喻为好运气。优质的锦鲤一直价格昂贵,淘汰的次品价格也远超普通食用鲤鱼,养殖的利润丰厚,为竞争激烈的水产养殖业提供了一种较好的养殖选择。     

锦鲤养殖的水质调控

随着科学技术的发展加上人类的需求越来越大,锦鲤的养殖变得越来越集约化、工厂化,锦鲤养殖水体也更容易恶化,水体里边的污染物质浓度也更高,水体内的组成也更加复杂,污染治理也更加难以下手,通过对水体生物因素、物理因素、化学因素的评价来判断水质的好坏,再根据情况从注入新水、培养水生植物、用微生物制剂调控水质、培养藻类等方法中选择适合的方法去调控水质,建立水中的生态平衡、物质循环平衡。     

鲤鱼患锦鲤疱疹病毒病的诊断和防控

近几年来我国养殖鲤鱼的锦鲤疱疹病毒病危害十分严重,全国主要鲤鱼养殖地区都有流行,池塘养殖、网箱养殖到小型湖泊养殖等各种养殖模式发病率、死亡率都很高。由于对该病的宣传力度不够,绝大多数鲤鱼养殖业者和基层鱼病防控单位甚至还不知道有这种疾病或知之甚少,鲤鱼患该病后错误地当成