A型塞内卡病毒VP1蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

A型塞内卡病毒(SVA)是一种新兴的猪病原体,可引起母猪水泡样病变和仔猪急性死亡。本研究将SVA的VP1基因分别克隆到原核表达载体pCold-I和pCold-TF,并将测序正确的重组质粒VP1-pCold-I、VP1-pCold-TF转化BL21(DE3)大肠杆菌中,诱导表达重组蛋白。结果显示：VP1-pCold-I表达的目的蛋白在沉淀(包涵体)中,VP1-pCold-TF表达的蛋白为可溶性蛋白。分别纯化上述表达的蛋白,并免疫BALB/c小鼠,经四次免疫后得到多克隆抗体。经Western blot和间接免疫荧光(IFA)鉴定,制备的多克隆抗体具有良好的Western blot效价和IFA效价,为相关基础研究和应用研究提供了工具。     

A型塞内卡病毒VP2蛋白原核表达及其多克隆抗体的制备

本研究旨在表达A型塞内卡病毒(Senecavirus A,SVA)的衣壳蛋白VP2,并制备其多克隆抗体。以SVA GD01/2017分离株RNA为模板,RT-PCR扩增VP2基因序列,并克隆至原核表达载体pET-30a(+)中构建重组质粒pET-30a-SVA-VP2。经测序鉴定后,将重组质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞,利用IPTG进行诱导表达。在非变性条件下,利用Ni-NTA琼脂糖树脂从菌体裂解液上清中纯化重组SVA VP2蛋白,并免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。利用Protein A Sepharose CL-4B树脂从兔血清中亲和层析纯化多克隆抗体,并对其进行间接免疫荧光分析。结果显示,重组SVA VP2蛋白以可溶性和包涵体两种形式在大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞内进行表达,分子质量约为47ku;制备的兔抗VP2蛋白多克隆抗体效价高达1∶64 000,该多克隆抗体仅识别SVA,与猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、脑心肌炎病毒、猪瘟病毒和猪伪狂犬病病毒等常见猪病原无交叉反应,表明制备的多克隆抗体具有良好的特异性。重组SVA VP2蛋白及其多克隆抗体的成功制备为猪塞内卡病毒病血清学检测方法的建立提供了良好的生物材料。     

A型塞内卡病毒VP2蛋白多克隆抗体的制备及间接ELISA检测方法的建立

【目的】制备A型塞内卡病毒(Senecavirus A,SVA)VP2蛋白多克隆抗体,建立检测SVA抗体的间接ELISA方法,以期为SVA致病机制及诊断提供研究基础。【方法】利用同源重组技术将VP2基因克隆至原核表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒pET-28a-VP2,并转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行IPTG诱导表达,表达产物经纯化后皮下多点注射新西兰大白兔制备多克隆抗体。利用间接免疫荧光试验(IFA)、Western blotting和中和试验鉴定多克隆抗体的特异性、反应性和中和活性。以VP2为抗原包被酶标板,通过矩阵优化、临界值确定、特异性鉴定及敏感性和重复性分析建立检测SVA抗体的间接ELISA方法。采集50份临床血清样品,分别用间接ELISA与IFA方法进行检测,分析间接ELISA方法的符合率。【结果】重组VP2蛋白以包涵体形式表达,大小为40 ku。制备的多克隆抗体能与重组VP2蛋白和SVA特异性结合,与其他病毒无交叉反应,且具有较高的中和活性。经对间接ELISA条件的优化,确定VP2包被浓度为4μg/mL,阳性血清稀释浓度为1∶250,封闭液为5%脱脂...     

A型塞内卡病毒VP1蛋白的原核表达及纯化

【目的】实现A型塞内卡病毒(Seneca virus A,SVA)VP1蛋白在大肠杆菌中的高效可溶性表达,以建立SVA抗体液相芯片技术检测方法。【方法】根据GenBank收录的SVA VP1基因序列(登录号：KY747514.1),基于大肠杆菌的密码子偏好性优化合成VP1基因,克隆到pCold TF载体,构建重组质粒pCold TF-VP1。将重组质粒pCold TF-VP1转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,进行IPTG诱导表达。通过优化诱导时间及IPTG浓度得出最佳诱导表达条件。采用His标签镍柱纯化VP1重组蛋白,将纯化后的SVA VP1蛋白与荧光微球进行偶联,偶联好的微球与阴阳性血清反应,利用Luminex 200系统上机检测背景及阴阳性血清的中值荧光强度(MFI),从而判断阴阳性,以用于猪血清中SVA抗体的检测。【结果】重组质粒pCold TF-VP1成功转入大肠杆菌BL21感受态细胞,并以可溶性蛋白形式表达。经诱导表达在约82 ku处出现阳性条带。当重组菌株诱导条件为16℃、IPTG终浓度为1.2 mmol/L、诱导时间为3 h时,VP1蛋白表达量最高;经Wester...     

A型塞内卡病毒VP1蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

为制备抗A型塞内卡病毒(SVA)VP1蛋白的单克隆抗体,并初步应用于A型塞内卡病毒的检测,本研究构建了SVA VP1原核重组表达质粒pET30a-GST-VP1(528 bp)。将重组质粒转化大肠埃希菌BL21感受态细胞并大量表达VP1重组蛋白,利用纯化的VP1重组蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0细胞)进行融合,经过细胞亚克隆筛选,获得杂交瘤细胞。将其选为腹水生产细胞株,最后纯化单克隆抗体,通过Western blotting和间接免疫荧光试验对其进行鉴定。结果显示,本研究获得1株能够稳定分泌抗VP1重组蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞,其亚型重链为IgG2a、轻链为Kappa链;Western blotting和间接免疫荧光检测显示,该单克隆抗体能够特异性识别SVA病毒粒子。本研究成功制备的抗SVA VP1蛋白单克隆抗体可为进一步研究A型塞内卡病毒VP1蛋白的生物学功能及A型塞内卡病毒致病机制提供有效途径。     

A型塞内卡病毒VP1结构蛋白在昆虫杆状病毒中的表达与鉴定

目前在昆虫杆状病毒表达系统（baculovirus expression vector system,BEVS）中表达A型塞内卡病毒（Senecavirus A,SVA）结构蛋白VP1尚未见报道。本研究将VP1基因通过限制性酶切位点插入杆状病毒载体pFastBac I,然后将鉴定正确的重组载体转化至DH10Bac感受态细胞,经蓝白斑筛选,对鉴定正确的菌落提取质粒。将质粒转染Sf9昆虫细胞,待有明显细胞病变后收获重组杆状病毒rBac-I-VP1,并进行病毒滴度测定。随后通过蛋白免疫印记（Western Blot）和间接免疫荧光（IFA）鉴定VP1蛋白表达情况。结果显示,重组杆状病毒rBac-I-VP1滴度为6.8×105 pfu/mL;Western Blot可检测到相对分子质量约27 kDa的表达产物,且其能够被SVA兔阳性多克隆血清识别;IFA试验显示,VP1蛋白能够在Sf9细胞内表达。结果表明,本研究利用BEVS表达的SVA VP1蛋白具有良好的免疫反应性,为其后期功能研究及SVA诊断试剂研制提供了技术基础。     

猪细小病毒VP2的原核表达与多克隆抗体制备

克隆猪细小病毒(PPV)VP2基因全长1 740bp,构建其原核表达载体后进行蛋白的表达与纯化,接种家兔制备多克隆抗体。用PCR方法扩增PPV VP2全长基因,扩增产物克隆至表达载体pET-32a并转化至E.coli BL21(DE3)感受态中。分别用不同诱导时间、IPTG浓度、温度诱导表达VP2重组蛋白,经SDS-PAGE电泳切胶回收纯化目的蛋白。对家兔进行3次免疫后,采集血清制备抗体。PCR扩增得到1 740bp的VP2基因片段;构建原核表达载体pET-32a-VP2,经37℃,IPTG浓度1.0mmol/L诱导表达4h可得分子质量大小约为82ku目的蛋白;间接ELISA检测抗体效价可达1∶12 800;Western blot证明所制备的抗体能够有效的应用于PPV VP2抗原的检测。本研究成功构建了表达PPV VP2基因的原核载体,获得了VP2蛋白,制备了兔抗多克隆抗体,为建立检测PPV VP2蛋白ELISA方法奠定了基础。     

表达O型口蹄疫病毒VP1蛋白的重组塞内卡病毒的构建与鉴定

A型塞内卡病毒(SVA)是近年来新流行的一种传染性病原,与口蹄疫病毒(FMDV)具有相似的基因组结构,所致临床症状也十分相似。为了研发一种新型的基因工程活载体疫苗,用于预防塞内卡病毒感染和口蹄疫,以SVA全长感染性克隆pSVA-GX01为基础,在SVA 2A与2B基因之间插入O型FMDV的VP1基因,经双酶切及测序鉴定,成功获得了重组质粒pSVA-FMDV-VP1-O。将重组质粒转染BHK-21细胞,拯救获得重组病毒rSVA-FMDV-VP1-O,间接免疫荧光试验鉴定显示,该重组病毒可在细胞中表达O型FMDV的VP1蛋白。对该重组病毒进行体外生长增殖特性以及遗传稳定性分析表明,重组毒株和亲本毒株在BHK-21细胞上具有相似的增殖特性,插入的FMDV VP1基因可在细胞传代过程中稳定存在6代。研究结果为开发以塞内卡病毒为载体构建表达口蹄疫病毒VP1蛋白的重组基因工程活载体疫苗提供了参考。     

A型塞内卡病毒VP2蛋白抗原区的原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

为建立高效的A型塞内卡病毒(SVA)的血清学检测方法,本研究经PCR扩增SVA VP2基因的优势抗原区域(VP2-1基因)后构建重组质粒p ET-32a-VP2-1,将其转化大肠杆菌感受态细胞并经IPTG诱导表达重组VP2蛋白(rVP2),表达产物经镍柱亲和层析法纯化后利用western blot鉴定,结果显示,在42 ku处出现特异性条带,表明r VP2可以与SVA阳性血清特异性反应。以r VP2为包被抗原,经反应条件的优化,建立了基于SVA VP2抗原区的间接ELISA抗体检测方法。本研究建立的间接ELISA检测方法的最适抗原包被浓度为2μg/mL,5%脱脂乳的PBST作为封闭液37℃孵育1 h,待检血清的最适稀释度为1∶500,兔抗猪Ig G-HRP稀释度为1∶10 000,最佳显色时间为10 min。当检测样品的S/P值<0.201时,样品检测结果为阴性;当检测样品的S/P值≥0.201时,结果为阳性。利用该方法检测SVA,猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪瘟病毒(CSFV)等阳性血清,结果显示,除SVA检测为...     

D型流感病毒NP蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

该研究旨在对D型流感病毒(influenza D virus, IDV)NP蛋白进行原核表达并制备多克隆抗体,为D型流感快速诊断技术奠定基础。采用PCR技术扩增D/bovine/Mississippi/c00046N/2014毒株的NP片段编码区,并对其序列进行跨膜区、信号肽、疏水键、抗原性及结构域分析,筛选出最优区段以制备多克隆抗体。该研究将IDV NP最优编码区序列插入原核表达载体pET-B2M,构建pET-B2M-NP重组阳性质粒,经PCR和测序鉴定后将重组阳性质粒转化至大肠杆菌Trelief^TM 5α中;IPTG诱导表达后采用镍柱亲和层析法纯化重组NP蛋白,并免疫新西兰白兔制备多克隆抗体。序列分析结果显示,1～500氨基酸区段无跨膜区和信号肽序列,局部亲水性好且具备良好的免疫原性,为制备重组NP蛋白的最佳抗原区段。经测序验证构建了pET-B2M-NP重组阳性质粒,转化后经IPTG诱导,主要以包涵体的形式表达了相对分子质量大小约为72 kDa的蛋白,符合预期。间接ELISA结果显示,制备的多克隆抗体效价达1∶100000且免疫原性良好。Western blo...     

流行性出血病病毒VP7蛋白原核表达及其多克隆抗体的制备

研究旨在表达流行性出血病病毒（EHDV） VP7蛋白并制备其多克隆抗体,为EHDV检测方法的建立提供材料。试验通过大肠杆菌进行VP7重组蛋白的诱导表达,通过镍离子亲和层析与透析进行重组蛋白的纯化与复性并免疫家兔制备多克隆抗体,通过间接ELISA、Western blotting与间接免疫荧光试验（IFA）分析多克隆抗体的效价与反应原性。结果显示,在37℃与IPTG （0.1 mmol/L）的诱导下,VP7重组蛋白（分子质量46 ku）以包涵体形式高效表达,纯化与复性处理后的重组蛋白纯度达94.52%,可与不同血清型的EHDV阳性血清特异性结合。制备的兔抗VP7蛋白多克隆抗体效价达1∶24 000;以制备的多克隆抗体为一抗,通过IFA与Western blotting检测到EHDV感染细胞中VP7蛋白的表达。本研究在大肠杆菌中实现了EHDV VP7蛋白的高效表达,制备的兔抗VP7蛋白多克隆抗体具有良好的反应原性与特异性,为EHDV诊断抗原的制备与血清学检测方法的建立提供了试验材料。     

牦牛EPF的原核表达及多克隆抗体制备

本试验旨在制备牦牛早孕因子(early pregnancy factor,EPF)多克隆抗体,为牦牛妊娠早期高效快速诊断技术研究奠定基础.采用RT-PCR方法,从牦牛胎盘和卵巢组织中提取RNA,反转录为模板后进行EPF基因扩增,并将其克隆到改造后的载体pET28-His10-Sumo上,构建pET28-His10-Su...     

猪丁型冠状病毒N蛋白原核表达及其多克隆抗体的制备

【目的】表达与纯化猪丁型冠状病毒(Porcine deltacoronavirus, PDCoV)的核衣壳(nucleocapsid, N)蛋白,并制备其多克隆抗体(polyclonal antibody, PcAb)。【方法】以PDCoV CHN-HN-1601分离株基因组RNA为模板,利用RT-PCR扩增PDCoV全长的N基因编码序列,将其克隆至原核表达载体pET-28a(+)中构建重组质粒pET-28a-PDCoV-N。经酶切和测序鉴定后,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,利用0.5 mmol/L IPTG于37℃诱导表达12 h。在非变性条件下,利用Ni-NTA琼脂糖树脂从菌体裂解液上清中纯化N-端和C-端均携带6×His标签的重组N蛋白,并将其免疫新西兰白兔制备抗血清。利用Protein A/G琼脂糖树脂从免疫兔的抗血清中亲和层析纯化多克隆抗体,并对多克隆抗体进行Western blotting和间接免疫荧光试验(IFA)鉴定及抗体效价的间接ELISA测定。【结果】重组PDCoV-N蛋白以可溶性和包涵体两种形式表达,分子质量约为42 ku;上清可溶性N蛋白的...     

猪瘟病毒E0蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

为表达猪瘟病毒E0蛋白并制备其多克隆抗体,本研究构建E0蛋白的原核表达载体,转化至BL21(DE3)菌株,IPTG诱导表达,亲和层析及切胶回收纯化重组蛋白。SDS-PAGE和Western blot分析显示E0重组蛋白主要以包涵体形式表达,亲和层析纯化获得了E0重组蛋白,用其免疫Balb/c小鼠4次制备E0重组蛋白的多克隆抗体。间接ELISA显示,免疫小鼠血清中E0蛋白抗体效价为1∶50 000。获得的E0蛋白多抗能与病毒感染细胞及E0-EGFP融合表达细胞中天然结构的E0蛋白发生特异性反应。本研究制备的E0重组蛋白及其多克隆抗体为进一步研究E0蛋白的功能和免疫原性奠定了基础。     

非洲猪瘟病毒VP73蛋白主要抗原表位区的原核表达及多克隆抗体的制备

构建重组原核表达载体pET32a-VP73,将pET32a-VP73转化BL21感受态细胞,经IPTG诱导,VP73蛋白主要抗原表位区可稳定高效的表达,SDS-PAGE结果表明,IPTG终浓度为1.0 mmol/L,诱导5 h蛋白质表达量最高,表达蛋白为融合蛋白,分子质量约为42 ku。蛋白质纯化后,经SDS-PAGE及Western blotting鉴定,确定表达产物为非洲猪瘟病毒VP73主要抗原表位区融合蛋白。将纯化的蛋白质免疫新西兰大白兔,免疫前后收集血清。用间接ELISA方法测定血清抗体效价,并以非洲猪瘟阳性血清、兔免疫前后血清及猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征、猪伪狂犬病阳性血清为一抗,确定该蛋白质的特异性。结果表明,制备的抗血清效价达到1∶1024000,能与纯化的VP73主要抗原表位区蛋白质发生反应。制备的多克隆抗体为VP73蛋白的免疫学研究和非洲猪瘟血清学诊断奠定了基础。     

犬冠状病毒N蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

本研究旨在克隆犬冠状病毒（canine coronavirus,CCV）N基因,体外表达N蛋白,并制备抗该蛋白质的多克隆抗体,用于CCV的诊断及其抗原的检测。参考GenBank中CCV的N基因序列（登录号：KY063618.2）,选择CCV流行毒株的N基因,通过对该基因密码子进行优化和基因合成,最后选择一段有效基因构建重组表达质粒pET-B2M-N,将成功构建的重组质粒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,挑取阳性克隆提取质粒,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,通过0.5 mmol/L IPTG 30 ℃进行诱导表达。结果表明,优化诱导条件后成功表达出大小约为49 ku的重组蛋白。将重组蛋白与弗氏佐剂按一定比例混合,每隔2周免疫G767、G768两只日本大耳白兔数次,用间接ELISA检测G768抗体效价可达1∶512 000,选用G768抗体进行抗体纯化,纯化后浓度可达10 mg/mL,用间接ELISA、Western blotting和间接免疫荧光试验对N蛋白纯化后制备的兔多克隆抗体进行检测分析,表明表达的重组N蛋白免疫原性良好,制备的多克隆抗体具有良好的反应原性。本研究为犬冠状病毒抗原抗体检测以及靶标CCV诊断试剂盒的建立奠定了一定的基础。     

1型鹅星状病毒ORF2蛋白原核表达及其多克隆抗体的制备与鉴定

[目的] 利用原核表达系统表达1型鹅星状病毒（Goose astrovirus 1,GAstV-1）结构蛋白ORF2,并制备其多克隆抗体。[方法] 根据GAstV-1 TZ03株基因序列,对ORF2基因序列进行大肠杆菌密码子偏爱性优化和合成,将其克隆至原核表达载体pET-30a（+）,构建重组质粒pET-ORF2,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,IPTG诱导表达重组蛋白,通过SDS-PAGE和Western blotting鉴定重组蛋白;将鉴定正确的重组蛋白纯化后免疫家兔制备多克隆抗体,以间接免疫荧光试验鉴定多克隆抗体的特异性。[结果] 酶切和测序结果显示,成功获得重组质粒pET-ORF2;SDS-PAGE结果显示,表达的重组蛋白分子质量约为70 ku,主要以包涵体形式存在;Western blotting结果表明,该蛋白能与抗His标签鼠单克隆抗体发生特异性反应。间接ELISA检测制备的兔抗ORF2蛋白多克隆抗体效价达1：128 000;间接免疫荧光试验结果显示,制备的多克隆抗体能与GAstV-1发生特异性反应。[结论] 原核表达的GAstV-1 ORF2重组蛋白具有良好的免疫原性,制备的兔源多克隆抗体具有较高的效价和特异性,为研制GAstV-1相关诊断试剂奠定了基础。