基于表达序列标签数据库(dbEST)的电子克隆技术

传统的克隆ｃＤＮＡ的方法是采用克隆原位杂交筛选ｃＤ ＮＡ文库或是利用基因特异引物 (ＧＳＰ)进行ｃＤＮＡ末端快速扩增 (ＲＡＣＥ) ,其特点是费时费力、花费高、成功率低。随着基因组测序和生物信息学技术的迅猛发展 ,尤其是国际联合序列数据库 (Ｇｅｎｂａｎｋ +ＥＭＢＬ +ＤＤＢＪ)中的序列数目与日俱增 ,因此 ,基于ｄｂＥＳＴ的电子克隆 (ｉｎｓｉｌｉｃｏｃｌｏｎｉｎｇ)技术在ＣＤＮＡ克隆方面与传统的方法相比具有事倍功半的优势。随着ＥＳＴ数据库的进一步完善 ,电子克隆已成为克隆新基因的主要方法之一。1　表达序列标签表达序列…     

生物肥料在农业可持续发展中的应用前景

阐述了生物肥料在现代可持续农业中的重要性及目前生产中应用较多的几种生物肥料的特性。同时,重点介绍了巴基斯坦国家生物技术与基因工程研究所研制的BIOPOWER系列生物肥料产品的应用现状,并对其发展前景进行了展望。     

基因库（GenBank）的电子邮件检索

１９８２年，美国国立卫生研究院（ＮＩＨ）、美国国立医学图书馆（ＮＬＭ）和美国国家生物技术信息中心（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ　Ｂｉｏｔｅｃｈｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ， ＮＣＢＩ）等机构开始建立ＤＮＡ序列数据库（ＧｅｎＢａｎｋ）。这些数据每１８个月增加一倍，由于大量的表达序列标识（ＥｘｐｒｅｓｓｅｄＳｅｑｕｅｎｃｅ　Ｔａｇｓ，ＥＳＴ）收入基因库，现在基因库中的数据每１５个月就增加一倍，并且有加速的趋势。 基因库中的基因数据出自３００００多种不同的物种，现在每月有６００多种新的物种加…     

大肠杆菌肠毒素ST1-LTB融合基因的高效表达

用限制性核酸内切酶ＥｃｏＲⅠ和ＨｉｎｄⅢ双酶切含大肠杆菌肠毒素ＳＴ１—ＬＴＢ融合基因的质粒ｐＸＳＬＴ１,回收０８４ｋｂ的ＳＴ１—ＬＴＢ融合基因,再将载体ｐＥＴ—２８ｂ（＋）用ＥｃｏＲⅠ和ＨｉｎｄⅢ双酶切,然后将其与ＳＴ１—ＬＴＢ融合基因连接,转化至受体菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中。经ＥｃｏＲⅠ、ＨｉｎｄⅢ、ＢａｍＨⅠ酶切反应鉴定重组子质粒,得到了理想重组质粒ｐＸＥＴＳＬＴ１。重组菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＸＥＴＳＬＴ１）经ＩＰＴＧ诱导后,其表达产物经ＳＤＳ—ＰＡＧＥ和ＥＬＩＳＡ检测,结果表明重组菌株可以高效表达ＳＴ１—ＬＴＢ融合蛋白,该融合蛋白占菌体总蛋白的３３２１％,而且无天然ＳＴ１生物毒性。     

绿脓杆菌外毒素A recA基因的融合及融合蛋白的表达

将绿脓杆菌ｒｅｃＡ基因克隆到ｐＵＣ１８中，构建了中间载体ｐＵＣＲ１８；然后以正确的向位及阅读框架将ｒｅｃＡ基因亚克隆到毒性基因缺失的绿脓杆菌外毒素Ａ（ＰＥＡ）基因中，构建了ＰＥＡ－ｒｅｃＡ融合基因质粒ｐＥＲＡ；融合基因经ＢａｍＨＩ及ＥｃｏＲＩ酶切，以正确阅读框架插入带有Ｔ７表达启动子的质粒ｐＥＴ－１７ｂ，构建了可表达ＰＥＡ－ｒｅｃＡ融合基因的质粒ｐＥＲＡ－１７ｂ。经酶切分析及ＰＣＲ扩增检测证明，绿脓杆菌ｒｅｃＡ已插入ＰＥＡ毒性基因中。ｐＥＲＡ－１７ｂ转化到ＤＥ３溶原态大肠杆菌ＨＭＳ１７４中，经ＩＰＴＧ诱导，表达了ＰＥＡ－ＲｅｃＡ蛋白。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和凝胶薄层扫描ＰＥＡ－ＲｅｃＡ蛋白，表明ＰＥＡ－ＲｅｃＡ的分子量约为９００００，与理论推算相符，表达率占菌体总蛋白量３．４２９％，用ＰＥＡ抗血清和抗ＲｅｃＡ单克隆抗体作免疫印迹分析，ＰＥＡ－ＲｅｃＡ与它们都有免疫学反应     

重组人白细胞介素6表达载体的构建及共在大肠杆菌中的高效表达

本研究合成了两个成熟人ＩＬ－６ｃＤＮＡ引物，采用ＰＣＲ法扩增出了成熟人ＩＬ－６基因片段，并在其５＇端加入了一个ＥｃｏＲＩ部位和ＡＴＧ，３＇端加入了一个ＢａｍＨＩ部位和ＴＡＡ。利用ｐＢＶ２２０质粒构建成功了ｐＢＶ２２０ＩＬ－６表达载体。将重组质粒导入Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５ａ中，经３０℃扩增的４２℃诱导，表达出了分子量为２１０００的预期蛋白。经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析与溥层证明具有明显的ＩＬ－６活性。实验还对     

应用杆状病毒系统高效表达猪繁殖与呼吸综合征病毒GPS基因

将猪繁殖与呼吸综合征症病毒ＣＨ－ａｌ株囊膜糖蛋白（ＧＰ５）一向克隆到杆状病毒转移载体ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓＢ中,与太毒线性ＤＮＡ（Ｂａｃ－Ｎ－Ｂｌｕｅ＾ＴＭＤＮＡ）共转染昆虫细胞ｓｆ９,经过三轮蚀斑纯化后,获得重组杆状病毒ｒＢａｃ＝ＧＰ５。用该重组病毒感染ｓｆ９细胞后,应用间接免疫荧光试验、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ检测表明,ＧＰ５基因在杆癍病毒系统中获得了高效表达,表达产物因糖基     

狂犬病病毒糖蛋白基因在原核细胞中的表达

将狂犬病病毒糖蛋白（ＲＶｇｐ）基因ＢｇｌⅡ片段（１６７５ｂｐ）分别正向插入到原核高效表达载体ｐＥＴ－１７ｂ和ｐＥＴ－１７ｂ２（用ＳａｃⅠ－ＮｄｅⅠ缺失掉ｐＥＴ－１７ｂ６０ｂｐ含起始密码子ＡＴＧ小片段）的ＢａｍＨⅠ切点，构建重组质粒ｐＥＴ－１７ｂＲＶｇｐ和ｐＥＴ－１７ｂ２ＲＶｇｐ。将其分别转化表达受体菌Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）和Ｅ，ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）ｐｌｙｓＳ．ＩＰＴＧ诱导表达，菌体经超声波裂解处理后ＳＤＳ－ｐＡＧＥ，染色，在分子量约６００００处可见重组质粒表达的较宽的蛋白带，以抗ＲＶｇｐＭｃＡｂ进行Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ检测，表明该表达蛋白为ＲＶｇｐ。通过扫描显示，表达的ＲＶｇｐ占菌体总蛋白的１０％～１４％，其中ｐＥＴ－１７ｂ２ＲＶｇｐ在Ｅ。ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）中的表达量最高。     

新城疫病毒F48E9株及东北地区流行株F基因遗传变异分析

采用异硫氰酸胍／酚／氯仿抽提一步法,提取新城疫病毒（ＮＤＶ）Ｆ４８Ｅ９株及２个东北地区分离株ＤＢ３、ＤＢ５基因组ＲＮＡ,并以其为模板经反转录合成Ｆ基因ｃＤＮＡ第１链,再利用ＰＣＲ技术分段增出Ｆ基因的ｃＤＮＡ。Ｆ４８Ｅ９、ＤＢ３和ＤＢ５株Ｆ基因的ｃＤＮＡ经酶切修饰后,插入ｐＵＣ１９的多克隆位点中,转化感受态Ｅ。ｃｄｉ ＤＨ５ａ,经相对分子质量比较、酶切分析及ＰＣＲ等鉴定方法筛选出Ｆ４８Ｅ９、ＤＢ３和     

禽流感病毒核蛋白基因探针制备及其初步应用

将禽流感病毒Ｈ９Ｎ２ 亚型毒株核蛋白（ＮＰ）基因３′端较为保守的、约３５０ｂｐ 的编码序列通过限制性内切酶ＨａｅⅢ切割、分离后,用随机引物法制备Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ１１ｄＵＴＰ标记探针。测定该探针的浓度为１００μｇ／ｍ ｌ。特异性试验发现该探针只能与实验室构建的、含有ＮＰ基因的重组载体ｐＧＥＭＴＥＮＰ和ｐＢａｃＰＡＫＮＰ以及Ａ 型流感病毒Ｈ９Ｎ２亚型、Ｈ３Ｎ２ 亚型以及Ｈ９Ｎ３ 亚型毒株基因组ＲＮＡ 结合出现特异性的颜色反应,而与实验室常用的载体ｐＧＥＭＴ ｅａｓｙ、ｐＢａｃＰＡＫＨｉｓ ３、ｐＴＡＲＧＥＴ 和ｐＧＥＭＥＸ２ 以及新城疫病毒、传染性支气管炎病毒和传染性喉气管炎病毒基因组不发生反应。应用该探针检测含ＮＰ基因的重组载体和重组病毒证明该探针是有效的,可用于含禽流感病毒样品或材料的检测。     

生物技术在畜牧业和饲料工业中的应用

1生物技术的主要研究领域生物技术是利用生物体或者生物的组织细胞及组分的特征和功能,设计构建具有预期性状的新物种或新品系,并与工程原理相结合进行加工生产,为社会提供新的产品和服务的一个综合性技术体系。生物技术包括基因工程、细胞工程、酶工程和微生物工程4个分支领域     

细菌素在饲料中的应用

细菌素 (Ｂａｃｔｅｒｉｏｃｉｎ)由于其种类多、无毒、大部分基因位于质粒上、分子量小、含修饰氨基酸、结构复杂等特点 ,被认为是分子遗传、基因工程、蛋白质工程、食品添加剂、化妆品、皮肤保健、抑制病原菌和调节肠道菌群的好材料。随着饲料中益生菌的推广使用和人们对饲料卫生的重视 ,细菌素在饲料中将会得到广泛的应用。1　细菌素的研究进展细菌素是 2 0世纪 2 0年代中期Ｇｒａｔｉａ( 1 946)对大肠杆菌Ｖ菌株抑制Φ菌株现象进行研究时发现的 ,以后Ｇｒａｔｉａ和Ｆｒｅｄｅｒｉｃｑ对Ｖ菌株产生的抑制物质进行分离 ,发现这种物质类似…     

生长激素释放因子（GRF）的基因改造及化学合成

为了提高生长激素释放因子（ＧＲＦ）的体内活性,根据猪ＧＲＦ的天然序列,设计了改造后ＧＲＦ（１～３２）的基因序列（含信号肽）,两端加设ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄⅢ的粘性末端,分４段由ＤＮＡ合成仪合成,每段长度分别为９５、９７、８６、１０６ＮＴ,２条链间有１５个碱基的粘端。用尿素变性ＰＡＧＥ纯化合成片段,用Ｔ４多核苷酸激酶对合成ＤＮＡ磷酸化,混合４个片段复性,然后用Ｔ４连接酶连接。提取ｐＢｌｕｓｃｒｉｐｔ质粒,用ＥｃｏＲＩ和ＨｉｎｄⅢ在Ｍｕｌｔｉｃｏｒｅｂｕｆｅｒ中酶切完全后,琼脂糖电泳,由ＧｅｎｅＥｌｕｔｅＡｇｒｏｓｅＳｐｉｎＣｏｌｕｍｓ回收酶切大片段。将该酶切片段与上述合成的ＧＲＦ基因由Ｔ４连接酶连接,并转化至氯化钙致敏的ＤＨ５α。选取重组菌落,提取质粒,用ＰＣＲ及双酶切鉴定阳性克隆。用Ｍｉｎｉｐｒｅｐ提取重组质粒,ＡＢＩ３７３自动测序仪测序。测序结果表明已克隆到合成的ＧＲＦ基因。     

猪生殖和呼吸综合征中国分离株ORF7基因的克隆及鉴定

本研究利用对应于ＡＴＣＣＶＲ－２３３２及ＬＶＯＲＦ７基因保守序列的１对均为２８个碱基的引物１００１１ＰＣＳ、１０１０ＰＣＲ对ＰＲＲＳＶ中国分离株Ｂ１３进行ＲＴ－ＰＣＲ，结果扩增出了１条包括完整ＯＲＦ７基因的５１０ｂｐ的ＤＮＡ片段。纯化此扩增产物，并对其进行ＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩ双酶切，与用ＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩ双酶切及碱性磷酸酶处理的ＰＵＣ１８载体连接。转化大肠杆菌。结果得到了１个Ｂ１３ＯＲＦ７基因与ＰＵＣ１８载体的重组质粒ＰＵＣ１８Ｂ１３ＯＲＦ７１０。通过ＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩ及ＰＣＲ证明此重组质粒即为Ｂ１３ＯＲＦ７基因与ＰＵＣ１８载体的重组质粒。从而为ＯＲＦ７基因及所表达的核衣壳蛋白进一步研究奠定了基础。     

胚胎干细胞研究进展及其应用

胚胎干细胞 (ＥｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌＥＳ细胞 )是从早期胚胎内细胞团 (ＩｎｎｅｒｃｅｌｌｍａｓｓＩＣＭ )或原始生殖细胞 (Ｐｒｉｍｏｒｄｉａｌ ｇｅｒｍｃｅｌｌｓＰＧＣＳ)分离和克隆的具有全能性的细胞[1] 。它具有无限增殖和多向分化的潜能。ＥＳ细胞研究与动物克隆、转基因动物技术相结合可使动物育种发生革命性的变革[2 ] ;更为重要的是ＥＳ细胞研究与组织工程等相结合 ,可以修复人体坏损组织或进行器官移植 ,从而使糖尿病、帕金森、心血管等当今严重威胁人类健康的疾病得到有效治疗[3] 。笔者就ＥＳ细胞的建系、鉴定…     

马立克氏病病毒Rispens株和RL株B抗原基因的分离、克隆及初步酶切分析

将马立克氏病病毒（ＭＤＶ）血清Ⅰ型Ｒｉｓｐｅｎｓ株和ＲＬ株分别接种于原代鸡胚成纤维细胞，待出现８０％以上细胞病变后收获，经蛋白酶Ｋ消化，酚、氯仿抽提，乙醇沉淀细胞和病毒的总ＤＮＡ（ｔｏｔａｌＤＮＡ）。以此为模板，根据已发表的Ｂ抗原基因核苷酸序列设计１对引物，通过聚合酶链式反应（ＰＣＲ）扩增出１条约２．８５ｋｂ的特异性条带，斑点杂交证实其为Ｂ抗原基因。双酶切消化后，克隆到质粒ｐＵＣ１９中。酶切分析表明，在这２株病毒的Ｂ抗原基因上，ＨｉｎｄⅢ、ＥｃｏＲＶ、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ的酶切位点分布与超强毒ＲＢＩＢ株、标准强毒ＧＡ株的完全相同。     

我国犬埃立克体病病原分离与鉴定：Ⅱ.我国病原株与其他埃立克体间 …

应用Ｃｌｕｓｔａｌｗ计算机分析软件,对我国南方基地的埃立克体病原株（Ｇｚｈ９８１）和Ｇｚｈ９８２）与基因库中其他相关埃立克体１６ＳｒＲＮＡ基因进行了匹配分析。结果表明,我国的２种分离株分别与Ｅ．ｐｌａｔｙｓ和Ｅ．ｃａｎｉｓ的遗传距离最小（０．００１）。在系统发育中,Ｇｚｈ９８１和Ｅ．ｐｌａｔｙｓ、ＨＧＥ、Ｅ．ｅｑｕｉ、Ｅ．ｐｈａｇｏｃｙｔｏｐｈｉｌａ同属一群;Ｇｚｈ９８２和Ｅ．ｃａｎｉｓ、Ｅ．ｅｗ     

蚕分子育种的研究

蚕分子育种的研究黄君霆（中国农业科学院蚕业研究所）国际蚕分子育种计划（ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＳｉｋｗｏｒｍＰｒｏｊｅｃｔ）是ＲｈｏｄｅＩｓｌａｎｄ大学的Ｍ·Ｒ．Ｇｏｌｄｓｍｉｔｈ在１９９１年提出来的，也叫基因标记育种（ＧｅｎｅＴａｇｇｉｎｇＢｒｅ...     

抗破伤风毒素单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立及其中和效应

应用破伤风类毒素多途径免疫接种ＢＡＬＢ／ｃ小鼠。取小鼠脾细胞与ＳＰ２／０小鼠骨髓瘤在聚乙二醇（ＰＥＧ，４０００）作用下进行细胞融合，克隆化，经ＥＬＩＳＡ及毒素中和试验检测，获得了１１株具有一定毒素中和活性的单克隆抗体细胞株。经单一单抗和群单抗中和试验证实，其中４株具有较强的产生抗毒素活性，而且这４种单克隆抗体（１Ｄ９Ｂ１０、５Ｇ８Ｂ９Ｅｌ、５Ｇ８Ａ１０、５Ｇ８Ｂ９Ｃ１１）协同作用可完全中和标准量毒素的攻击。     

分泌抗IBDV独特型抗体细胞株的建立

应用提取纯化的抗ＩＢＤＶ ＩｇＧ免疫Ｂａｌｂ／ｃ小鼠，其脾细胞与ＳＰ２／Ｏ细胞在ＰＥＧ作用下融合，应用ＥＬＩＳＡ法检测筛选，经有限稀释法克隆２次，获得了２株（２Ｂ６株、５Ｆ４株）分泌抗ＩＢＤＶ独特型抗体的杂交瘤细胞株，并能诱生Ｂａｌｂ／ｃ小鼠产生高效价的含抗ＩＢＤＶ独型抗体腹水。