华山新麦草3Ns染色体特异SCAR标记的开发

为快速准确地建立小麦-华山新麦草杂交后代的分子标记鉴定方法,采用150条10bp的随机引物R1-R150对华山新麦草、普通小麦7182、中国春及华山新麦草1Ns-7Ns全套二体附加系共10个材料进行了RAPD分析,从中获得了华山新麦草3Ns染色体上2个特异RAPD分子标记片段FR-113和FR-125。克隆这两个片段并测序,发现其全长分别为543bp和515bp;分析序列后对其分别设计SCAR引物S-113和S-125,重新对10个材料进行SCAR分析,结果只在华山新麦草和小麦-华山新麦草3Ns二体附加系上扩增出了特异条带,由此证明已将华山新麦草3Ns染色体上获得的两个RAPD标记成功转化为稳定可靠的SCAR标记。这两个SCAR标记可用于检测小麦背景下的华山新麦草3Ns染色体,同时为小麦-华山新麦草杂交后代提供了分子鉴定依据。     

小麦-华山新麦草7Ns异附加系的分子细胞遗传学研究

为了给有效利用华山新麦草基因提供新的种质材料,利用细胞遗传学、分子标记等技术,结合田间农艺性状考察,对从小麦-华山新麦草七倍体材料H8911-99与硬粒小麦D4286杂交F4代分离群体中选育的杂交后代12DH25进行了鉴定。华山新麦草基因组特异SCAR标记鉴定表明,12DH25含有华山新麦草遗传物质;有丝分裂和花粉母细胞减数分裂中期I染色体数为2n=44=22Ⅱ,基因组原位杂交(GISH)出现两条杂交信号,且能配对,表明两条外源染色体是华山新麦草的一对同源染色体。选取定位于小麦7个部分同源群上的28对STS标记对12DH25及其亲本基因组DNA进行扩增,定位于小麦第7同源群上的STS标记BE591127和BG274576能在12DH25中扩增出华山新麦草特征条带,将12DH25附加的华山新麦草染色体归属于小麦第7部分同源群。由此确定矮秆材料12DH25是一个稳定的小麦-华山新麦草7Ns二体异附加系。     

三个小麦-华山新麦草二体附加系分子细胞遗传学的初步鉴定

华山新麦草是我国华山地区特有小麦近缘物种,具有抗逆、早熟、优质等特点,对小麦的白粉病、条锈病、赤霉病也具有良好的抗性,是小麦重要的三级基因库。为进一步更好地发挥华山新麦草基因资源的作用,本研究利用细胞学方法、原位杂交技术、分子标记技术、农艺性状评估和抗病性鉴定对普通小麦-华山新麦草衍生后代材料进行鉴定,并获得了 20H11、17H21、18H28 三个小麦-华山新麦草衍生系。结果表明,20H11、17H21 和 18H28 的染色体数都是 44 条,均携带2 条属于华山新麦草的 Ns 染色体和 42 条普通小麦染色体。利用华山新麦草的特异分子标记进行检测,证明 20H11、17H21 和 18H28分别为 3Ns、4Ns和 2Ns二体附加系。通过农艺性状调查,3个试验异染色体系与亲本7182相比,株高和小穗粒数的差异不显著;分蘖数目与亲本7182有显著差异;20H11的穗长显著短于亲本7182;17H21的分蘖数显著少于亲本7182。经条锈病抗性鉴定,18H28 高抗条锈病小种 CYR32 和 CYR34。因此,这三个华山新麦草衍生系可作为中间材料用于小麦遗传育种研究。     

普通小麦-华山新麦草1Ns二体异附加系的分子细胞遗传学研究

为给后续研究和利用普通小麦-华山新麦草衍生后代H1-1-3-1-9-8提供依据,用形态学、细胞学及分子生物学方法对该材料进行分析研究。结果表明,H1-1-3-1-9-8在株高、穗长、穗型等性状上与华山新麦草无显著差异,千粒重平均44.2 g,较亲本显著增加;H1-1-3-1-9-8的染色体构型为2n=44=22Ⅱ;经原位杂交鉴定,H1-1-3-1-9-8存在两条华山新麦草外源信号,且能够配对;选取普通小麦7个部分同源群上的64对EST-STS引物对H1-1-3-1-9-8进行分析,第一部分同源群上的BE443796、BE446010、BE497584、BF202643、BG262410、BG607965和BM140362七对引物扩增出了华山新麦草的特异条带;经种子贮藏蛋白变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,H1-1-3-1-9-8具有华山新麦草特有的高分子量谷蛋白亚基。以上结果说明,H1-1-3-1-9-8是普通小麦-华山新麦草1Ns二体异附加系。     

附加华山新麦草不同Ns染色体对小麦耐盐性的影响及其生理机制分析

为了解附加华山新麦草(Psathyrostachys huashanica Keng)不同Ns染色体对小麦耐盐性的影响及其相关生理机制,以小麦-华山新麦草全套二体附加系及其亲本7182为研究对象,对其进行150 mmol·L^-1、250 mmol·L^-1 NaCl溶液胁迫处理,测定其芽期和苗期的7个生长指标及6个理化指标,并进行分析比较。结果表明,盐胁迫下,供试材料芽期的芽长（SL）和根长（RL）、苗期的叶片鲜重（FW）下降最为明显;4Ns、5Ns、7Ns附加系在芽期、苗期的耐盐性显著高于受体小麦7182,其中7Ns附加系耐盐能力最强,150 mmol·L^-1和250mmol·L^-1NaCl胁迫下,耐盐等级分别为Ⅰ级（高耐）和Ⅱ级（耐盐）。盐胁迫下,5Ns、7Ns附加系叶片内SOD、POD活性最高,且叶片丙二醛（MDA）含量最低,相对电导率最小;4Ns附加系脯氨酸含量较高,丙二醛含量较少。可以认为,华山新麦草4Ns、5Ns、7Ns染色体附加到小麦后,分别依赖渗透调节、抗氧化机制增强受体小麦的耐盐能力,这些附加系材料可作为新种质应用于小麦耐盐性研究和育种。     

小麦-华山新麦草异附加系的细胞遗传学和分子标记辅助鉴定

华山新麦草(2n=2x=14,NsNs)含多种优良基因,是一类具有广阔应用前景的育种资源。为给小麦育种培育新材料,本研究对来自普通小麦品系7182和华山新麦草的高代衍生系H1133、H4122和H1423进行细胞遗传学和分子标记辅助鉴定。细胞学观察表明,3个衍生系的染色体数和构型均为2n=44=22Ⅱ;基因组原位杂交(GISH)和荧光原位杂交(FISH)同步分析结果表明,3个衍生系均含42条普通小麦染色体和2条华山新麦草Ns染色体;EST和PLUG标记分析证明H1133、H4122和H1423中附加的分别为华山新麦草3Ns、5Ns和7Ns染色体,说明H1133、H4122和H1423分别为小麦-华山新麦草的3Ns附加系、5Ns附加系和7Ns附加系;形态学鉴定结果表明,三个附加系与亲本7182在株高、分蘖和穗长等农艺性状上表现出不同差异;成株期抗条锈病鉴定结果表明,H4122和H1423高抗CYR32和CYR33混合菌种,从材料系谱推断其抗性来源于华山新麦草。总之,附加系H1133、H4122和H1423在农艺性状和抗病性上均有良好表现,可作为小麦育种中的桥梁材料。     

普通小麦 华山新麦草衍生后代H18和0841的SSR标记鉴定

为了明确普通小麦华山新麦草衍生后代材料中所携带的外源遗传物质,利用SSR标记对普通小麦-华山新麦草衍生后代H18和0841进行了鉴定.SSR标记结果表明,331个SSR标记中有271个在亲本华山新麦草和普通小麦7182间具有多态性;85个在华山新麦草中具有清晰且明亮的特异条带,其中9个标记在H18衍生的8个单株中(2n=51～54)具有华山新麦草特征条带.0841的染色体数目为42条,利用筛选的9个标记对其鉴定,发现定位于小麦3D染色体上的标记Xbarc71在0841中具有华山新麦草的特异条带,同时缺失小麦亲本7182的特异条带,推测0841可能是华山新麦草的3Ns染色体代换了小麦的3D染色体.条锈病抗性鉴定显示,0841中抗至高抗条锈菌条中31号和条中32号混合小种.     

利用SRAP建立快速鉴定高温平菇菌株的SCAR标记

为建立一套快速鉴定高温平菇的方法,采用SRAP标记技术对来自全国的16个高温平菇主要栽培菌株进行DNA指纹分析,初步构建其标准化DNA指纹图谱;在SRAP-PCR指纹图谱的基础上,将命名为高温灰平、高平侧5、高平678的3个栽培菌株的特异性DNA带转化为可以直接用于菌株快速鉴定的SCAR标记。研究结果表明,我国高温平菇栽培菌株遗传背景差异不大,存在同物异名的现象,而采用SRAP指纹及其SCAR标记鉴定高温平菇栽培菌株具有重要意义。     

普通小麦-华山新麦草衍生后代的细胞学特点及GISH分析

为了研究华山新麦草染色体在小麦-华山新麦草各衍生世代中的遗传规律并建立一套小麦-华山新麦草异源附加系,对小麦-华山新麦草BC1F2到BC1F5共315个植株进行细胞学检测和GISH分析,结果表明,染色体数目分布范围为40～54,2n≥43的植株有223株,占总观察株数的70.79%;早代植株携带华山新麦草染色体的概率较高,植株染色体数目多大于44,随着自交代数的增加,外源染色体丢失的概率也在增大.因而在选育小麦-华山新麦草异附加系时,在BC1F4和BC1F5世代选择效果较好;通过对染色体数目2n=44的42个植株进行GISH分析,筛选出39个二体附加植株.     

小麦 华山新麦草衍生后代抗旱性分析

为了解小麦-华山新麦草衍生后代的抗旱性,采用籽粒萌发期聚乙二醇(PEG-6000)模拟干旱胁迫和幼苗期盆栽控水方法,研究了干旱胁迫对普通小麦7182与华山新麦草的8个衍生后代(B1、B16、B18、B19、B23、B28、B32、A31)籽粒萌发及幼苗保护酶活性等生理指标的影响.结果表明,PEG胁迫对8个衍生材料种子发芽势、发芽率、胚芽和胚根生长均有一定的影响.与无胁迫处理相比,在低PEG浓度下,种子萌发和胚芽及胚根生长变化不明显,高PEG浓度下受到明显抑制,其中B1和B19在种子萌发期抗旱性较强.幼苗盆栽控水后,各材料的SOD、CAT和POD活性均随干旱胁迫程度的增加而增加,其中材料B32的三个指标值最大.各材料的脯氨酸和可溶性蛋白含量对干旱胁迫的反应不一致.通过综合隶属函数法对两个试(实)验的所有指标进行综合评价,不同材料的抗旱性强弱顺序分别为华山新麦草＞B32＞B19＞小偃6号(CK)＞A31＞B23＞B16、B1＞7182＞B18＞B28,说明小麦-华山新麦草衍生后代的抗旱性多数介于两亲本之间,其中B32、B19在籽粒萌发期和幼苗期综合抗旱性较强.     

华山新麦草穗发芽抗性相关基因AIP2的克隆及其序列分析

为了挖掘和利用华山新麦草(Psathyrostachys huashanica,2n=14,NsNs)的优良基因,拓宽小麦穗发芽抗性基因资源,以华山新麦草为材料,采用同源克隆的方法克隆AIP2基因,利用生物信息学软件分析其基因结构及功能。结果表明,从华山新麦草中成功克隆AIP2基因,该基因的开放阅读框为840bp,编码279个氨基酸残基,结构域预测结果显示AIP2蛋白含有完整的Ring保守域,属于锌指环家族成员。AIP2的gDNA含5个外显子,4个内含子,华山新麦草AIP2氨基酸序列与感穗发芽小麦品种中优9507的AIP2氨基酸序列的相似性为84%,与中优9507相比缺失了44个氨基酸,与抗穗发芽的乌拉尔图小麦的AIP2氨基酸序列的相似性为80%,华山新麦草和乌拉尔图小麦都有氨基酸缺失,推测这些缺失的氨基酸可能与华山新麦草穗发芽抗性强有很大关系。本研究为小麦穗发芽抗性改良提供了新的候选基因。     

小麦秆锈菌生理小种21C3CTH SCAR标记的建立

为了建立中国小麦秆锈菌流行小种的分子检测标记,利用RAPD(Random amplified polymorphic DNA)技术对我国小麦秆锈菌6个主要生理小种21C3CTH、21C3CPH、21C3CFH、34MKG、34C2MKK和34C2MKR进行了分析,筛选特异性片段并将其转化为SCAR(Sequence-characterized amplified region)标记。在156条10碱基随机引物中,引物S92(5′-CAGCTCACGA-3′)在小麦秆锈菌生理小种21C3CTH中扩增出一条782bp的特异片段,回收、克隆和测序该特异片段,根据特异片段的核苷酸序列设计了1对SCAR特异引物,经验证,该引物特异性良好。结果表明,小麦秆锈菌生理小种21C3CTH的RAPD标记被成功地转化为SCAR标记,这为该生理小种的分子鉴定和监测奠定了基础。     

1个与卡瓦胡椒特异的SCAR标记的获得

采用6份卡瓦胡椒材料、21份栽培胡椒和野生胡椒材料、1份不同属的草胡椒材料共计28份试验材料,在对它们进行了RAPD研究的基础上,进行了SCAR分子标记研究。设计1对卡瓦胡椒特异SCAR引物P8.1和P8.2,用这对特异引物对本次试验的28份材料进行PCR扩增,结果只有6份卡瓦胡椒材料扩增出了预期大小355bp的特异带,其它材料均无任何扩增。这说明引物P8.1和P8.2为卡瓦胡椒特异SCAR引物,这对卡瓦胡椒种质资源的鉴定有一定帮助。