猪传染性胸膜肺炎放线杆菌毒素apxⅡA基因的真核表达及其核酸疫苗

利用PCR从自行分离鉴定的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneuromoniae,APP）血清7型菌株基因组DNA中扩增apxⅡA基因，构建了一个利用人类巨细胞病毒（Human cytomegalo virus，HCMV）启动子表达apxⅡA基因的真核表达质粒pCDapxⅡA，体外转染PK-15细胞，处理后的样品进行SDS-PAGE和Western blot分析，证实了免疫原性蛋白apxⅡA在细胞中表达。用表达质粒pCDapxⅡA作为核酸疫苗免疫BALB／c小鼠酶联免疫吸附试验，ELISA检测小鼠血清中特异性抗猪胸膜肺炎放线杆菌的抗体，结果第2次免疫后其抗体滴度都在1：128以上。初步证实，用apxⅡA作为核酸疫苗免疫动物可以激活机体产生免疫应答反应。     

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌缺失毒素1激活基因C(ApxIC)同时嵌合副猪嗜血杆菌外膜蛋白P2基因(ompP2)复合突变株的构建

猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)以及副猪嗜血杆菌(Haemophilusparasuis,Hps)是引起猪发病的2种病菌。本研究以APP血清5型分离株(SW1)为基础材料,通过构建重组转移载体pBOSKΔIC-1和pBOSKΔIC/ompP2,构成卡那霉素抗性基因(Kanr)和枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)的果聚蔗糖酶基因(sacB)的正负双向筛选表达盒,并筛选获得SW1株缺失毒素I的激活基因C(ApxIC),同时嵌合Hps外膜蛋白P2基因(ompP2)的复合突变株SW1ΔApxIC/ompP2。该突变株经鉴定,与SW1亲本株相比,其缺失了大小为475bp的apxIC基因,同时嵌合有大小为1107bp的Hps ompP2基因,其基本生长特性与亲本株(SW1)没有显著区别;同时在体外,连续传代10代之后缺失的apxIC基因不会发生回复突变,嵌入的ompP2基因仍能够稳定遗传。本研究成功构建了猪传染性胸膜肺炎放线杆菌缺失apxIC基因并嵌合有Hps ompP2基因复合突变株,为今后研究APP和Hps新型二联疫苗打下基础。     

猪胸膜肺炎放线杆菌毒素Ⅱ基因的克隆、表达及其免疫原性

以本实验室分离的猪胸膜肺炎放线杆菌血清2型(Actinobacilluspleuropneumoniaeserotype2,APP-2)菌株HB08的基因组为模板,扩增了2871bp的APP毒素Ⅱ的结构基因apxIIA,并克隆到pET-28a原核表达载体中构建重组表达质粒pET28aIIA,转化到大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21(DE3),经SDS-PAGE和Westernblot分析表明,表达的重组蛋白具有良好的反应活性。将表达的蛋白经或不经复性处理,与纯化的天然毒素Ⅱ分别免疫昆明小鼠,同时设PBS空白对照组,每组12只,间隔2周免疫2次,采血检测其抗体效价,二免后2周用致死剂量的APP血清7型(APP-7)菌株(1.08×108CFU(菌落形成单位,colonyformunit)/只)腹腔攻击。结果显示,复性蛋白组的保护率为83.3%,非复性蛋白组的保护率为58.3%,天然毒素蛋白对照组保护率为91.7%,空白对照组小鼠全部死亡,说明复性的重组毒素Ⅱ具有良好的免疫原性。     

猪胸膜肺炎放线杆菌毒素Ⅳ部分基因片段的体外表达与初步应用

参照GenBank中的猪胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropeumoniae，App）血清1和3型菌株序列设计了1对特异性引物，用PCR方法扩增毒素Ⅳ（ApxⅣ）基因3’端1096bp的目的片段，然后克隆到pMD 18-T载体中，转入大肠杆菌（Eschetichia coli）的宿主菌DH5a中，提取阳性克隆质粒进行双酶切和测序鉴定，将T-载体中切下目的片段定向克隆到pET32a（＋）中，转入E．coli BL2I（DE3），经IPTG诱导可表达分子量约60kD的蛋白，免疫转印鉴定呈阳性，ApxⅣ基因体外成功表达。以纯化的表达产物包被ELISA板，初步检测了一些血清样品，结果预示表达的蛋白可用于区分灭活疫苗免疫和野毒感染。     

PR—1a蛋白基因的克隆及序列分析

以珊西烟草（Nicotina tabacum cv. Xanthi-nc）的基因组DNA为模板，通过合成一对特异性引物，利用多聚酶链式反应（PCR）扩增获得PR－1a蛋白基因。将其克隆到E.coli质粒上进行序列分析。结果表明：该基因由504个碱基组成，编码168个氨基酸。与已发表序列相比较，核苷酸序列及推导出的氨基酸序列的同源性分别为99.9%和100％。     

花生条纹病毒外壳蛋白基因cDNA的合成、克隆及全序列测定

自田间采集的花生病叶中提取花生条纺病毒（ＰＳｔＶ）总ＲＮＡ,人工合成引物Ｐ１、Ｐ２,通过ＲＴ－ＰＣＲ扩增合成ＰＳｔＶ－ｃｐ的ｃＤＮＡ,并将其克隆到ｐＧＥＭ－Ｔ载体上。经限制酶谱分析后进行全序列测定,结果表明：该布１０８４个核苷酸组成,包含了ＰＳｔＶ－ｃｐ ｃＤＮＡ完整的８６１ｂｐ编码序列（编码２８７个氮基酸）以及３＇端２２３ｂｐ非编码序列,与文献报道的４个ＰＳｔＶ－ｃｐ基因具有较高的保守性。     

青花菜花粉外壁蛋白基因的克隆与表达特征分析

花粉外壁蛋白参与多种植物生理进程,在花粉发育过程中起着重要的作用。本试验以青花菜保持系‘WN12-95B’为材料,利用RT-PCR技术克隆得到青花菜花粉外壁蛋白（PCP）基因。结果显示,该基因全长578 bp其中开放阅读框长度为561 bp共编码186个氨基酸。该蛋白为疏水性蛋白,在第1~24位有一个信号肽序列,预测相对分子量为18.82 kD等电点为10.91。青花菜PCP蛋白的二级结构主要由a-螺旋和不规则卷曲构成,不含β-转角。系统进化分析表明青花菜花粉外壁蛋白与同属植物的进化关系相近,其中与甘蓝进化关系最近。采用qRT-PCR技术分析青花菜PCP基因的表达特性,结果显示该基因仅在花蕾中表达,具有明显的组织特异性。青花菜Ogu不育系及其保持系不同发育阶段花蕾中PCP基因差异明显,表明其在花粉发育中具有重要的作用。本研究结果为进一步研究PCP基因在青花菜花粉发育过程中的作用奠定基础。     

壳聚糖酶基因的克隆与序列分析

本研究采用一对引物从巨大芽孢杆菌BS-0409中成功地克隆了壳聚糖酶基因（Csn） 全基因序列,大小为516bp,将其在NCBI网站上用BLAST程序进行在线检索分析,结果与多种芽孢杆菌同源性均为96%。同时,利用DNAMAN软件比较巨大芽孢杆菌BS-0409与其它13种不同细菌Csn编码基因的氨基酸序列,结果显示不同细菌Csn氨基酸序列之间有比较高的同源性,且与多种芽孢杆菌具有较高的同源性。     

传染性支气管炎病毒S1纤突糖蛋白基因的克隆及部分序列分析

大纤突Ｓ糖蛋白是传染性支气管炎病毒重要的免疫相关性蛋白之一，参考已发表的ＩＢＶ－Ｂｅａｕｄｅｔｔｅ株Ｓ１基因ＤＮＡ序列，合成一对特异性引物，以ＩＢＶ－ＲＮＡ为模板，应用ＲＴ－ＰＣＲ方法，获得传染性支气管炎病毒上海分离株Ｓ２Ｔ２－Ｓ１纤突糖蛋白基因，长度１．６５ｋｂ，利用引物设计中的ＢａｍＨ和ＨｉｎｄⅢ位点将其克隆到载体ｐＳＩ（＋）中。对该基因进行限制性酶发分析，结果与已报道的相一致。     

高粱BADH1基因的克隆与序列分析

甜菜碱是一种季胺型水溶性生物碱，在许多动植物体内是一种甲基供体，参与维持细胞正常的生理功能，可消除NaCl某些酶的抑制作用，是多种高等植物体内一种重要的渗透调节物质。在植物中甜菜碱由胆碱经两步酶促反应合成，甜菜碱醛脱氢（betaine aldehyde dehydrogenase，BADH)是促进甜菜碱合成的最后一步关键酶，自1990年Weretilnyk等从菠菜中克隆了BADH cDNA以来，     

牦牛PrP c基因克隆与序列分析

朊病毒(prion)可引起人和动物的一系列神经退化性疾病，包括羊瘙痒病(serapie)、牛海绵状脑病(BSE)、人克雅氏病(CJD)等，这些疾病的共同特征是导致人和动物产生意识和运动功能的严重衰退直至死亡。正常朊蛋白(PrP^c)基因结构如何引起蛋白三维构象的变化及其构象病产生的机理尚不清楚，但朊蛋白病的潜伏期、个体敏感性、种间屏障等都与PrP^c基因结构的多态性相关。有学者报道了人、鼠、羊PrP^c基因多态性对朊病毒病的连锁关系。     

GDA2基因的克隆、原核表达与融合蛋白的纯化

摘要：GDA2（G2 pea dark accumulated gene）是与G2豌豆（Pisum sativum L.）短日照条件下不衰老现象紧密相关的基因之一。实验用cDNA差示分析法（representational difference analysis, RDA）得到一个短日照下特异表达的G2豌豆cDNA，并命名为 GDA2。核酸序列分析表明，该cDNA全长1 120 bp，最大的开放阅读框为642 bp，编码一个由213个氨基酸构成的分子量约为24 kD的蛋白质，与GDA1的同源性为36%。在GDA2的cDNA两端分别引入Bgl Ⅱ与XhoⅠ的酶切位点，用PCR方法将其克隆到原核表达载体pGEX-4T-1中，经过酶切筛选和测序鉴定，得到所需的表达载体pGEX-GDA2。将pGEX-GDA2导入E.coli BL21菌株，经IPTG诱导，得到分子量约51 kD的 GST-GDA2融合蛋白，并利用Glutathione Sepharose 4B亲和柱对该融合蛋白加以纯化。GDA2-GST融合蛋白的表达和纯化工作，为深入研究GDA2蛋白的结构与功能以及该基因同衰老的关系打下良好的基础。