利用RNA介导的抗病性获得抗2种病毒的转基因烟草

 RNA介导的病毒抗性(RMVR)是近年发展起来的一种新的植物抗病毒基因工程策略,具有抗病性强、抗性持久、生物安全性高等特点。利用该策略培育多抗病毒植株具有广阔的应用前景和重要的实践意义。本研究将非翻译的马铃薯X病毒的衣壳蛋白(PVX-CP)基因和非翻译的马铃薯Y病毒的衣壳蛋白(PVY-CP)基因组成嵌合基因,构建植物表达载体pROKXY,利用农杆菌介导法转化烟草NC89,获得6株对PVX和PVY的混合侵染表现为免疫的转基因植株。分子分析表明,这种抗性为RNA介导的病毒抗性。这一研究结果为利用RMVR进行植物多抗病毒育种提供了重要数据和资料。     

利用RNA干扰介导抗病性获得兼抗四种病毒的转基因马铃薯

为获得兼抗马铃薯X病毒(Potato virus X,PVX)、马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)、马铃薯卷叶病毒(Potato leaf roll virus,PLRV)和马铃薯潜隐花叶病毒(Potato virus S,PVS)4种病毒的转基因马铃薯新材料,分别以这4种病毒全长CP基因为模板,通过设计PCR引物和亚克隆获得4种病毒CP基因相对保守区段的基因片段,并将其拼接成融合基因,以载体pHANNIBAL和pBI121为基础,构建RNA干扰(RNA interference,RNAi)载体,利用农杆菌介导的转基因体系进行马铃薯遗传转化,并对获得的转基因马铃薯进行病毒抗性检测。结果表明,所获得的融合基因片段RH1和RH2,酶切鉴定分别得到长度为1 200 bp的条带,与预期片段相符;构建了含pdk内含子和RH1、RH2融合基因的RNAi植物表达载体,经Bam H I/Sac I双酶切,获得长度约3 200 bp的片段,表明RNAi植物表达载体pBI121-pRH构建成功;转化易感病毒马铃薯品种陇薯11号,PCR检测和PCRSouthern杂交分析表明融合基因已整合到陇薯11号马铃薯基因组中;抗病性检测显示4株转基因马铃薯植株对4种病毒均免疫。表明利用RNAi可筛选出抗多种病毒的转基因马铃薯新种质。     

利用RNAi 介导的抗病性获得抗2 种花生病毒的转基因烟草

 分别以花生条纹病毒红安株系(PStV-Hongan)外壳蛋白基因(CP),花生矮化病毒轻型株系(PSV-Mi)和花生黄瓜花叶病毒(CMV-CA)复制酶基因2a为模板,通过PCR 方法分别得到PStV-CP 5′ 端,PSV-Mi 和CMV-CA 2a3′ 端150 bp 的片段,3 种片段混合物为模板经PCR 拼接得到450 bp 的片段,此拼接片段通过Gateway 系统重组至植物表达载体pK7GW1WG2,得到含反向重复拼接片段的植物表达载体pK450。冻融法导入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株GV3101 后,叶盘法转化本生烟(Nicotiana benthamiana),经PCR 检测,获得转基因植株。对T1 代转基因植株分别人工接种3 种病毒,66. 7% 的植株表现对PStV 免疫,9% 的植株表现对CMV-CA 的恢复抗性,全部植株对PSV 感病。siRNA 的Northern blot 结果表明,所有转基因烟草植株都含有病毒特异siRNA,siRNA 含量随接种后时间延长而衰减。     

马铃薯Y病毒复制酶基因不同位置cDNA区段介导对PVY的不同抗性

为探究靶序列位置对RNA介导的病毒抗性产生的影响,利用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术扩增马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)复制酶基因(nuclear inclusion b,NIb)不同位置的cDNA区段,反向插入双元载体pROKII中,构建了发夹RNA(hairpin RNA,hpR-NA)结构的植物表达载体。将构建的植物表达载体采用冻融法转入农杆菌LBA4404,叶盘法转化烟草NC89,获得转基因植株。攻毒试验表明:PVYNIb基因不同位置cDNA区段介导的对PVY的抗性存在显著差异;3′端1/2处和中间位置的序列可介导高水平的病毒抗性,抗性植株的比例在50%以上,而5′端、5′端1/2处和3′端的序列介导的抗性效率较低,抗性植株的比例仅为10%~30%。Northern杂交显示:抗病植株中RNA的积累量明显低于同类型的感病植株,抗性与RNA积累量呈负相关;抗病转基因植株中有siRNA存在,表明病毒抗性是由RNA介导的。     

马铃薯Y病毒HC-Pro、CI、NIb和CP基因介导的病毒抗性比较研究

 根据已克隆的马铃薯Y病毒坏死株系(PVY^N)的基因组序列设计引物,利用PCR扩增HC-Pro、CI、NIb和CP4个基因的3'端400bp cDNA区段,分别反向插入含有査尔酮合成酶基因(Chalcone synthase,CHS)内含子的双元载体pRCHS中,构建了含内含子的发夹结构RNA (intron splicing hpRNA,ihpRNA)表达载体pRCHS-HC-Pro、pRCHS-CI、pRCHS-NIb和pRCHS-CP。利用农杆菌介导法转化烟草品种NC89,获得了多种转基因植株。病毒抗性检测的结果显示:转pRCHS-HC-Pro、pRCHS-CI、pRCHS-NIb和pRCHS-CP的烟草中,抗性植株的比例分别为55.34%、73.69%、61.54%和84.21%。大分子RNA和siRNA的Northern blot分析表明,目的片段转录产物的积累量与转基因植株的抗病性呈负相关,转基因植株中可检测到siRNA,说明所获得的抗病性是RNA沉默介导的。     

马铃薯Y病毒CP基因5′端和3′端反向重复结构介导的抗病性研究

本研究克隆了来源于马铃薯Y病毒坏死株系(PVYN)外壳蛋白(CP)基因(PVYNCP)5′端和3′端的反向重复cDNA序列,并构建了植物表达载体pROKII-5′IR和pROKII-3′IR,利用农杆菌介导的叶盘法转化烟草NC89,分别获得166和126株转基因烟草。抗病性试验表明,转化PVYNCP基因3′端茎50 bp(环50 bp)hp RNA(hairpin RNA)的烟草抗病率达69%,而转化PVYNCP基因5′端相同片段长度的hpRNA的烟草却全部发病。Southern blot结果表明,转基因植株的抗病性与转基因的拷贝数之间无明显的相关性;Northern blot结果表明,目的片段转录产物的积累量与植株的抗病性呈负相关,证明所获得的抗病性是RNA介导的抗病性。研究结果证明PVYNCP基因的3′端比5′端更能有效地诱发基因沉默,并且hpRNA茎部的长度可减少到50 bp。该结果为探索利用CP基因的最短长度和有效部位的基因片段来培育多抗病毒转基因植物提供了依据。     

马铃薯Y病毒CP基因5'端和3'端反向重复结构介导的抗病性研究

 本研究克隆了来源于马铃薯Y病毒坏死株系(PVY^N)外壳蛋白(CP)基因(PVY^N CP)5'端和3'端的反向重复cDNA序列,并构建了植物表达载体pROKⅡ-5'IR和pROKⅡ-3'IR,利用农杆菌介导的叶盘法转化烟草NC89,分别获得166和126株转基因烟草。抗病性试验表明,转化PVY^N CP基因3'端茎50 bp(环50 bp) hpRNA(hairpin RNA)的烟草抗病率达69%,而转化PVY^N CP基因5'端相同片段长度的hpRNA的烟草却全部发病。Southern blot结果表明,转基因植株的抗病性与转基因的拷贝数之间无明显的相关性;Northern blot结果表明,目的片段转录产物的积累量与植株的抗病性呈负相关,证明所获得的抗病性是RNA介导的抗病性。研究结果证明PVY^N CP基因的3'端比5'端更能有效地诱发基因沉默,并且hpRNA茎部的长度可减少到50 bp。该结果为探索利用CP基因的最短长度和有效部位的基因片段来培育多抗病毒转基因植物提供了依据。     

转基因烟草中PVYN CP基因沉默及其介导的抗病性受温度的调控

 本研究以转不可翻译的马铃薯Y病毒坏死株系外壳蛋白基因(PVY^N CP)烟草的T₃代植株为材料,在获得高度抗病植株并证明转基因植株的抗病性是由RNA沉默介导的基础上,采用Northern杂交及ELISA检测病毒的方法,分析了温度对转基因烟草中RNA沉默以及转基因植株抗病水平的影响。结果表明,低温可以改变转基因植株中已发生的RNA沉默和转基因植株的抗病状态。在15℃低温下生长的转基因植株,转基因产生的RNA沉默被抑制,转基因植株失去了对PVY^N高度抗病的特性,表现感病症状;而在25℃或以上高温(30℃、35℃)下生长的转基因植株,转基因产生的RNA沉默没有发生被抑制的现象,转基因植株对PVY^N病毒的侵染仍保持高度抗病性。     

核基质结合区对马铃薯Y病毒全长非翻译CP基因介导抗病性的影响

 为探索核基质结合区(matrix attachment regions,MARs)对RNA介导的病毒抗性的影响,我们将从烟草中克隆到的核基质结合区TM2构建在包含马铃薯Y病毒全长非翻译CP基因的植物表达载体pRPVYCPN的表达盒的两侧,构建了植物表达载体pRTM2CPNTM2。采用农杆菌介导基因转化法,将表达载体pRPVYCPN和pRTM2CPNTM2转入烟草品种NC89中,分别获得了144株和344株转基因烟草。抗病性检测发现,核基质结合区的存在能明显提高RNA介导抗性的产生效率。在含MARs转基因植株中,抗病植株的比率为15.1%,而不含核基质结合区的转基因植株的抗病比率则为8.3%。这一研究结果对抗病毒植物的分子育种和转基因表达调控有指导意义。     

hpRNA的茎环比例对RNA介导的病毒抗性产生的影响

 以马铃薯Y病毒坏死株系(PVY^N)的外壳蛋白(coat protein,CP)基因3'端50bp片段为hpRNA的茎,以pUC19不同长度的序列为hpRNA的环,构建了茎环比例分别为4:1、2:1、1:1、1:2、1:4和1:8的植物表达载体。利用农杆菌介导法转化烟草品种NC89,获得了多种转基因植株。室内抗病性检测发现:不同茎环比例的hpRNA介导的病毒抗性效率不同;茎环比例为4:1、2:1和1:1时效率较高,抗性植株的比例达60%左右;随着环长度的逐渐增加,抗性植株的比例逐渐降低;当茎环比例为1:8时,抗性植株的比例仅为9.52%。Southern blot分析结果表明:外源基因已整合于烟草的基因组中,且转基因植株的抗病性与转基因的拷贝数之间无明显的相关性。Northern blot分析结果表明:目的片段转录产物的积累量与植株的抗病性呈负相关,证明所获得的抗病性是RNA介导的。     

转抗虫基因烟草植株对棉铃虫幼虫抗性能力的研究

作者等对转CpTI基因烟草植株进行了抗棉铃虫能力的评估。用死亡率、蜕皮指数、平均体重、生物总量和植株受害程度等5个指标,综合判断转基因植株的抗性水平。结果表明,检测的10株转基因植株中对棉铃虫表现为高抗、中抗的各占4株,低抗的占2株。高抗植株测试虫校正死亡率达90％以上,中抗植株测试虫校正死亡率达75％以上,差异显著,在高抗植株上生长的测试虫蜕皮指数低于标准的30％,总虫重仅为对照的1％,中抗植株上生长的测试虫蜕皮指数是标准的30％～40％,总虫重为对照的3％～7％。综合分析结果表明,高、中抗植株对棉铃虫的抗性明显。     

烟草花叶病的损失测定

对烟草花叶病损失的田间试验和统计分析结果表明:单株烟叶的产量、产值的损失率与病害级别显线性函数关系;田间的产量、产值的损失率与病株率、病情指数的关系为逻辑斯蒂模型。花叶病的发生,使受害株叶片中的蛋白质含量升高,糖含量下降,品质明显降低。     

转CP基因线辣椒对CMV和CMV-RNA的抗病性比较

 本试验以转化CMV-CP和TMV-CP基因线辣椒纯合系作试材,比较了接种CMV粒体和CMV-RNA后的发病特点和叶片中的病毒含量。结果表明:转化线辣椒不仅能抵抗CMV粒体的侵染,而且还能抵抗CMV-RNA的侵染。不论接种CMV粒体或CMV-RNA,CP(+)线辣椒的系统症状都延迟出现,显症株率和病害严重度级别大幅度降低,病毒增殖和运转受到抑制,接种叶片与新生叶片中的病毒含量明显减低。这一结果证实CMV-RNA不能克服线辣椒由CP基因介导的抗病性。     

TMV侵染不同抗性番茄品种之后引起的过氧化物酶活性及同工酶的变化

 本文论述了不同抗性番茄品种在接种了TMV之后体内过氧化物酶及其同工酶的变化趋势。不同品种番茄幼苗接种TMV之后30天内病毒含量、过氧化物酶活性及其同工酶的测定结果表明:所有接种的番茄幼苗与健株对照相比均表现酶活性的增强及酶带数目的增多;但不同抗性品种,酶活性交化曲线及同工酶谱带的变化趋势有所不同:感性品种北京早红(+/+)及耐病品种强力米寿接种TMV之后,病毒含量迅速上升,在第15天达到最高峰,同时植株开始显症,其酶活性曲线呈现出1个增值高峰,即酶活性只在显症之后迅速上升于第24天达到最高峰,病株在症状发展过程中产生2条健株所没有的具高迁移率的同工酶谱带A与B。抗性品种Tm-2(Tm-2/+)抑制TMV在体内的增殖,在接种之后30天内植株不表现典型外部症状,其酶活性曲线具有2个增酶高峰,即在接种后第12天达到最高峰,并在第21天有1个新的高峰;在酶活性高峰期,接种植株也产生同工酶谱A与B,与感性品种不同的是谱带A与B形成较早,同时,抗性品种还产生感病品种所没有的1条同工酶谱带F。上述过氧化物酶活性及同工酶的变化趋势可以成为鉴定品种抗性一个有价值的生化指标。     

Characteristics of a resistance-breaking isolate of potato virus Y causing potato tuber necrotic ringspot disease

An Austrian isolate of potato virus Y^NTN, the causal agent of potato tuber necrotic ringspot disease (PTNRD), was serologically compared with seven Dutch PVY^N isolates. Using polyclonal and monoclonal antibodies, it was found indistinguishable from PVY^N. Determination of the nucleotide sequence of the coat protein cistron and comparison of the deduced amino acid sequence with coat protein sequences of other potyviruses revealed a high level of homology with PVY^N coat protein sequences. This confirmed the close taxonomic relationship of PVY^NTN with the PVY^N subgroup of potato virus Y. PVY^NTN is able to overcome all resistance genes known so far in commercial potato cultivars. Remarkably, transgenic PVY-protected tobacco plants are also resistant to PVY^NTN infection upon mechanical and aphid-mediated inoculation. These experiments indicate that genetically engineered resistance offers great potential in protection of potato to new aggressive strains of PVY^N.     

The effects of co‐infection by different Potato virus Y (PVY) isolates on virus concentration in solanaceous hosts and efficiency of transmission

The influence of co‐infection on concentration and accumulation of genetically different isolates of Potato virus Y (PVY) in potato and tobacco plants and the efficiency of transmission by Myzus persicae of PVY isolates from doubly versus singly infected plants were evaluated. The vector ability to simultaneously transmit two virus isolates was examined. Eight PVY isolates represented three strain groups: PVY^O (pathotype and serotype O), PVY^NW (pathotype N and serotype O), and PVY^NTN (pathotype and serotype N). Different diagnostic methods, including DAS‐ELISA, multiplex RT‐PCR, aphid transmission tests and bioassays, were applied to detect the presence of PVY isolates in source and assay plants. Significant reductions in concentrations of certain PVY isolates during co‐infection with other isolates were found both in potato and tobacco plants. The observed effects were both isolate‐ and host‐dependent in form. The highest rates of virus transmission by single aphids were recorded with PVY^NTN isolates, and the lowest ones with PVY^O isolates. Individual aphids of M. persicae were able to simultaneously transmit two PVY isolates. The frequency of transmission was generally low, but it reached as high as 20% for one of the isolate combinations. The findings presented in the work provide proof for antagonistic within‐plant interactions between isolates of PVY, with some implications of these interactions for virus transmission by aphid vectors. Consequently, this research contributes to a better understanding of the epidemiology of the disease caused by PVY.     

AT毒素胁迫的再生烟草及后代对赤星病的抗性

从4个烤烟品种幼苗心叶叶碟产生的愈伤组织(CA)在含AT毒素的培养基上经两轮筛选,获得的抗毒素CA用于产生了抗病的一次再生植株。用来自抗病性提高50％以上的一次再生株的二代CA产生了抗病的二次再生植株,品种NC89的二次再生抗病植株被称为NC89—TT。获得种子后,NC89—TT二代苗显示出抗毒素损伤、抗病菌侵入、抗病斑扩展的能力,与NC89比,毒素引起的根和叶部病变至少晚8小时、轻64％,病菌孢子侵染率低60％以上,病斑面积减小92％。     

综合防治烟草黄瓜花叶病研究

作者报道了综合措施防治烟草黄瓜花叶病(CMV)的研究结果。结果表明,以营养钵育苗移栽后覆盖地膜措施的防病增产效果好,移栽后46天,防治效果为73.87％,增产54.78％。其原因是,它综合了营养钵育苗移栽缩短感病时间和地膜驱蚜的双重机制。