Lack of Modifying Effects of Intratracheal Instillation of Quartz or Dextran Sulfate Sodium (DSS) in Drinking Water on Lung Tumor Development Initiated with 4-(Methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone (NNK) in Female A/J Mice

The purpose of the present study was to investigate the effects of inflammation, induced by intratracheal instillation (i.t.) of quartz as an environmental factor in the lung or drinking of dextran sulfate sodium (DSS) as an environmental factor in the colon on lung tumors in female A/J mice initiated with NNK. For comparison, colonic preneoplastic lesions, aberrant crypt foci (ACF), were also assessed. A/J mice at 6 weeks of age were divided into 5 groups, and Groups 1, 2 and 3 were pretreated with NNK (2 mg / 0.1 ml saline / mouse, intraperitoneal injection) at week 0. For a week, 2% DSS in drinking water was administered to the mice in Groups 2 and 4 beginning in week 1. In week 2, the mice of Groups 3 and 5 were exposed to intratracheal instillation of quartz (0.1 mg/rat) suspended in 25 μl saline. The experiment was terminated after 16 weeks. The results for the lung tumors and colonic ACFs showed a lack of modifying effects of the inflammation in either site. Hematologically and histopathologically, the inflammation induced by 0.1 mg quartz in the lung and 2% DSS in the colon was lacking or only mild at the end of 16 weeks. These results suggest that there may be differences in sensitivity to inflammation that determine tumor promoting potential.     

家蚕HSP20·8基因体外表达及荧光原位杂交研究(英文)

前期研究发现,相对于其它组织器官,有一种低分子量热激蛋白在家蚕肾型卵中高量表达,并命名为低分子量热激蛋白HSP20.8。为了进一步阐明家蚕低分子量热激蛋白HSP20.8的基因结构、表达特性及其在家蚕染色体上的分布,根据HSP20.8基因cDNA序列设计特异引物,进行了克隆、表达及荧光原位杂交研究。结果表明,该基因含有1个561碱基对的开放阅读框(open reading frame,ORF),与cDNA序列比较分析发现该基因无内含子序列。重组蛋白的分子量在20 kD左右。热激蛋白基因HSP20.8在家蚕基因组中为单拷贝基因,其位点在染色体近中部区域。     

家蚕HSP70基因的电子克隆与序列分析

热休克蛋白70(HSP70)广泛分布于生物体中,在蛋白转运、耐热性、细胞保护等方面起着重要作用.本研究以黑腹果蝇的一个HSP70氨基酸序列与家蚕基因组预测的基因库进行tBlastn检索,共获得了多个可能的家蚕HSP70基因,我们对编号为BGIBMGA002381进行了电子克隆.BGIBMGA002381基因的编码区序列...     

绵羊肺炎支原体云南分离株鉴定及其TU/HSP70基因特征分析

为探究2020年冬季云南省昆明市某山羊场持续发生的羊呼吸道疾病病因,从该场采集病料,经样品DNA提取、临床症状及病理剖检观察、病原分离纯化和16S rRNA PCR扩增鉴定,确定病原为绵羊肺炎支原体,并将分离株命名为YN-2020。随后设计引物,扩增YN-2020株延伸因子(TU)和热休克蛋白基因(HSP70)全长序列,分别与GenBank中相关参考菌株构建遗传进化树开展生物信息学分析,并对TU及HSP70基因进行体外原核表达。生物信息学分析结果显示:YN-2020分离株TU基因与绵羊肺炎支原体菌株MoGH3-3亲缘关系较近,在不同支原体种间,其与牛殊异支原体亲缘关系较近,与禽滑液囊支原体亲缘关系较远;HSP70基因与绵羊肺炎支原体Movi 117株亲缘关系较近,在不同支原体种间,其与牛殊异支原体亲缘关系较近,与猪鼻支原体亲缘关系较远。TU及HSP70基因原核表达结果显示,两种蛋白均能在大肠杆菌表达系统中获得不同程度的分泌性表达,TU重组蛋白大小约48 kDa,HSP70重组蛋白大小约68 kDa,且能与康复期绵羊血清发生反应。本研究可为进一步认识绵羊肺炎支原体提供参考,并在此基础上完善相关诊断方法的研究。     

猪肠黏膜保护因子HO-1的短小芽孢杆菌表达系统建立与分析

【目的】 对猪黏膜保护因子——血红素加氧酶-1（heme oxygenase-1,HO-1）基因进行克隆及原核表达,为研究高表达HO-1在肠黏膜损伤中的保护作用提供技术支持。【方法】 根据GenBank中公布的HO-1序列（登录号：NM_001004027.1）,利用Primer Premier 6.0设计1对特异性引物,利用RT-PCR方法扩增HO-1基因片段,将其与pMD19-T克隆载体连接,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,筛选阳性克隆进行PCR鉴定;将载体pNCMO2与重组载体pMD19-T-HO-1进行Sal Ⅰ和Kpn Ⅰ双酶切,使用T4 DNA连接酶连接,利用电击转化技术将重组表达载体pNCMO2-HO-1转入感受态短小芽孢杆菌,使用IPTG进行诱导表达,应用SDS-PAGE和Western blotting分析HO-1在短小芽孢杆菌中的融合表达情况。【结果】 猪HO-1基因全长897 bp,编码298个氨基酸。双酶切后在约5 200和897 bp处分别观察到pNCMO2载体片段和HO-1基因片段,证明成功构建基因表达载体pNCMO2-HO-1;电转后的双酶切结果表明,在相同的位置观察到pNCMO2和HO-1片段,证明重组表达载体pNCMO2-HO-1成功导入短小芽孢杆菌。SDS-PAGE和Western blotting鉴定结果发现,在36.5 ku处出现了明显的蛋白印迹,表明成功表达了HO-1的重组蛋白,且为胞外分泌。【结论】 本研究成功构建了HO-1的重组原核表达载体,pNCMO2-HO-1重组载体可以在短小芽孢杆菌中诱导表达。     

THBS3基因在长白猪和通城猪不同组织和不同时期骨骼肌中的表达分析

本研究主要探究血小板反应蛋白3 (thrombospondin-3,THBS3)基因在不同组织及不同时期骨骼肌生长发育过程中的表达规律。利用实时荧光定量PCR方法对THBS3基因在长白猪和通城猪中的组织表达谱,以及在胚胎期(33、45、65、70和90 d)和出生后阶段(0、9、30、60、120和160 d)骨骼肌中的差异表达进行了比较分析。结果表明,THBS3基因广泛表达于长白猪和通城猪各个组织器官,除胃和肠中的表达存在差异外,其在两个猪种中的组织表达谱基本一致,在肺脏中表达量最高。THBS3基因在长白猪和通城猪胚胎期骨骼肌中的表达水平均显著高于出生后阶段(P<0.05),但胚胎期骨骼肌中的表达模式在两个猪种间存在一定差异,THBS3基因表达峰值出现在长白猪胚胎期45 d,而其在通城猪中表达峰值出现在胚胎期65 d。结果提示,THBS3基因参与了猪骨骼肌生长发育过程及不同类型猪种骨骼肌生长发育异步性的调控。     

Expression Analysis of THBS3 Gene in Different Tissues and Skeletal Muscles at Different Periods from Landrace and Tongcheng Pigs

To study the expression pattern of THBS3 gene in different tissues and during skeletal muscle development, the THBS3 gene expression in different tissues and skeletal muscles during prenatal periods (33, 45, 65, 70 and 90 d) and postnatal periods (0, 9, 30, 60, 120 and 160 d) from Landrace and Tongcheng pigs were detected by Real-time quantification PCR.The results showed that THBS3 gene widely expressed in all tissues examined, exhibiting similar spatial expression patterns with expression peaks in lung in both pig breeds except in stomach and intestine.Moreover, although THBS3 gene showed a significant higher expression level in gestation than after birth in Landrace and Tongcheng pigs (P<0.05), it exhibited different expression patterns between Landrace and Tongcheng pigs, the expression peak was detected at gestation day 45 in Landrace pig, while was detected at gestation day 65 in Tongcheng pig.The results suggested that THBS3 gene involved in skeletal muscle growth and development in pigs, as well as the regulation of asynchronization of skeletal muscle development in different pig breeds.     

TIMP3基因在长白猪和通城猪不同组织及不同时期骨骼肌中的表达分析

采用定量PCR(Quantification PCR, QPCR)方法,比较分析了基质金属蛋白酶3(TIMP3)基因在长白猪和通城猪间的组织表达谱,同时比较分析了其在这2个猪种胚胎期(33, 45, 55, 65, 70和90 d)和出生后(0, 9, 30, 60, 120和160 d)骨骼肌生长发育过程中的差异性表达。组织表达谱结果表明,TIMP3基因在不同猪种的各组织器官中广泛表达,除在腿肌和胰腺中有所差异外,TIMP3基因在两个猪种间的组织表达谱基本是一致的,在肺脏和子宫中表达最高,在背肌、脾脏和胃中表达较高,在肠、心脏、肾脏和肝脏中表达最低。与出生后阶段相比,TIMP3基因在2个猪种胚胎期均显著高表达(P＜0.05),但其表达变化趋势在2个猪种间存在差异;与在长白猪胚胎期相比,该基因在通城猪胚胎期中的高表达水平维持在一个更大的范围内。本试验结果提示,TIMP3基因可能参与不同类型猪种骨骼肌生长发育异步性的调控,影响到不同类型猪种的产肉性状。     

水牛KDM1A/LSD1基因的克隆分析及真核表达载体的构建

本研究旨在对水牛组蛋白去甲基化酶KDM1A基因进行克隆,分析并构建真核表达载体,为研究其在水牛体细胞克隆胚胎中的作用提供基础。首先提取水牛卵巢总RNA,利用RT-PCR技术克隆得到水牛KDM1A基因并对其进行生物信息学分析。结果表明:水牛KDM1A基因编码区全长2 625 bp,预测编码874个氨基酸;水牛KDM1A与其他物种同源性较高且与生物分类学保持一致;其所编码蛋白分子式为C2375H3855N805O776S24,理论分子质量为56 872.11;其二级结构由19个α螺旋,47个β折叠,25个T转角和无规则卷曲组成;其高级结构在水牛、黄牛、人之间具有较高的相似性;本实验构建了水牛pcDNA3.1(+)-KDM1A真核表达载体,转染pcDNA3.1(+)-KDM1A可以显著提高水牛耳部成纤维细胞(BFFs)中KDM1A的表达水平;还发现卵母细胞中KDM1A的表达水平显著高于BFFs。     

空肠弯曲菌peb1A基因的克隆表达及免疫原性分析

根据空肠弯曲菌基因序列设计引物,以菌株ATCC 29428为模板扩增出peb1A基因片段,定向克隆至pMD18-T载体中,并对克隆片段测序,比较所测序列与不同来源弯曲菌的同源性;用软件改造并合成peb1A基因78 bp～780 bp区间片段,PCR扩增后,构建出表达载体pET-28a(+)-peb 1Ag,转化至E.c...     

金川牦牛BCL2A1基因克隆及生物信息学分析

为探讨金川牦牛抗凋亡因子--B淋巴细胞瘤2相关蛋白A1（B cell lymphoma 2 related A1,BCL2A1）基因特点,本试验采用PCR方法以金川牦牛血液DNA为模板扩增BCL2A1基因,用DNAStar、ExPASy、ABCpred等生物信息学软件分析基因序列和蛋白质结构。结果显示,克隆获得的片段长622 bp,GenBank登录号：MG459158,开放阅读框为516 bp,共编码171个氨基酸,其中缬氨酸（V）、赖氨酸（K）的含量较多,分别为9.4%和8.8%。BCL2A1分子质量为19.46 ku,理论等电点为4.99,不稳定系数为17.44,具有跨膜螺旋结构域（Scores>500）。二级结构主要为α-螺旋,占60.82%,有一个BCL2结构域,三级结构模型与人BCL2A1同源性最高（72.79%）,BCL2A1存在潜在的B细胞抗原表位。与野牦牛氨基酸序列进行比对显示,金川耗牛BCL2A1存在5个氨基酸差异位点。NJ法系统进化分析显示,金川牦牛与野牦牛同源性为98.5%,亲缘关系最近。本试验成功克隆了金川牦牛BCL2A1基因,其在哺乳动物中具有较高的保守性,为深入研究牦牛BCL2A1基因功能提供理论依据。     

金华猪PPARGC1A基因克隆、生物信息学分析及组织表达研究

试验旨在研究过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅助激活因子1α（PPARGC1A）在金华猪和大白猪中的遗传特征和表达情况,探究PPARGC1A基因在mRNA水平和蛋白质水平的表达模式。以金华猪和大白猪为试验动物,分别提取背脂组织的总RNA,根据GenBank中公布的猪PPARGC1A基因序列（登录号：NM_213963.2）设计编码区和实时定量PCR引物,以猪GAPDH基因和β-actin蛋白作为内参,应用多种生物信息学方法对PPARGC1A基因编码蛋白进行功能分析,并通过实时荧光定量PCR及Western blotting检测其在金华猪背脂中的表达水平。结果表明,金华猪PPARGC1A基因CDS区全长2 361 bp,编码786个氨基酸,该蛋白分子大小90 336.01 u,其中丝氨酸（ser）所占比例最高（13.7%）,色氨酸（Trp）所占比例最低（0.8%）。同源性比对结果显示,金华猪PPARGC1A基因与山羊、牛和绵羊的同源性较高,分别为95.0%、94.9%和94.9%,在物种进化中具有较强的保守性;金华猪PPARGC1A蛋白不稳定指数为74.88,属于不稳定亲水蛋白,无跨膜结构,其二级结构由α-螺旋、延伸链、β-转角及无规则卷曲4种结构组成,所占比例分别为26.59%、5.73%、5.73%和61.96%,PPARGC1A蛋白同源建模经折叠、弯曲等一系列复杂的过程获得三级结构模型;实时荧光定量PCR试验和Western blotting试验结果一致,显示PPARGC1A基因在背脂较厚的金华猪中表达量显著低于瘦肉型的大白猪（P<0.05）。本研究为探明PPARGC1A基因对猪脂肪沉积的分子生物学功能提供了理论基础。     

Hsp70 and HSF-1 expression is altered in the tissues of pigs transported for various periods of times

The aim of this study was to assess changes of Hsp70 and HSF-1 protein and mRNA expression in stress-sensitive organs of pigs during transportation for various periods of time. Twenty pigs were randomly divided into four groups (0 h, 1 h, 2 h, and 4 h of transportation). A significant increased activity of AST and CK was observed after 1 h and 2 h of transportation. Histopathological changes in the heart, liver, and stomach indicated that these organs sustained different degrees of injury. Hsp70 protein expression in the heart and liver of transported pigs did not change significantly while it increased significantly (p < 0.05) in the stomach. Hsp70 mRNA levels decreased significantly (p < 0.05) in the heart after 4 h of transportation. However, mRNA expression increased significantly in the liver after 1 (p < 0.05) and 4 h (p < 0.01) of transportation, and increased significantly in the stomach of the transported pigs after 1, 4 (p < 0.01), and 2 h (p < 0.05). HSF-1 levels were reduced at 1 and 4 h (p < 0.05) only in the hearts of transported pigs. These results indicate that Hsp70 mediates distinct stress-related functions in different tissues during transportation.     

草地早熟禾NRT1/PTR FAMILY 8.3基因的克隆及表达分析

植物硝酸盐转运蛋白(Nitrate transporter,NRT)可有效转运NO3-,提升氮素利用效率.为了解析草地早熟禾(Poa pratensis)适应不同浓度及不同形态氮素、干旱胁迫机理,本研究以草地早熟禾为试材,对NRT1/PTR FAMILY 8.3基因进行克隆、生物信息学分析,并分析了不同浓度及不同形态氮...     

绵羊WNT5A基因克隆及其组织表达分析

WNT5A(Wnt family member 5A)参与了多种细胞的增殖、凋亡和分化等生物学过程,在乳腺形态发生、毛囊发育等方面发挥了重要作用.该试验利用RT-PCR获得绵羊WNT5A基因的CDS区,分析WNT5A蛋白的结构特征并利用RT-qPCR检测WNT5A基因在9个组织中的表达情况.绵羊WNT5A基因的CDS区...     

动物组织中GLUD1基因表达与GDH蛋白结构分析

[目的]研究动物不同组织中GLUD1基因的表达情况,比较不同物种中GDH蛋白的结构差异,明晰GLUD1基因的表达模式与GDH蛋白的功能。[方法]分别采集大鼠、绵羊、梅花鹿的肝脏、肾脏、皮肤、脂肪和肌肉5种新鲜组织样品。以β-actin为内参基因,采用荧光定量PCR法（qRT-PCR）分析3种动物不同组织中GLUD1基因的表达情况;利用无重复双因素分析方法表征GLUD1基因在不同组织中的表达量差异。比较人、小鼠、大鼠、山羊、绵羊、牛和猪7个物种GDH蛋白氨基酸序列,模拟这7个物种的GDH蛋白三维空间结构。[结果]GLUD1基因在大鼠、绵羊和梅花鹿的5个组织中均有表达,在肝脏中的表达量均高于其他组织;该基因在大鼠和梅花鹿肝脏组织中的表达量极显著（P<0.01）高于绵羊肝脏组织中的表达量,在大鼠肾脏组织中的表达量极显著（P<0.01）高于梅花鹿肾脏组织中的表达量。人GDH蛋白的氨基酸序列与猪、牛、山羊和绵羊的序列相似度较高,而大鼠与小鼠GDH蛋白的氨基酸序列相似度达到99.10%。大鼠、人、猪的GDH蛋白氨基酸序列中分别存在2个（第8位丙氨酸→缬氨酸、第40位丙氨酸→缬氨酸）、1个（第23位丙氨酸→丝氨酸）、2个（第33位丙氨酸→苏氨酸、第39位丙氨酸→苏氨酸）物种特异性突变位点。小鼠、大鼠、人的GDH蛋白预测为三聚体结构,山羊、绵羊、牛和猪的GDH蛋白预测为同源六聚体结构。[结论]GLUD1基因在大鼠、绵羊、梅花鹿不同组织中的表达量存在差异,在肝脏中都有较高水平的表达。不同物种GDH蛋白的氨基酸序列相似度较高,但依旧存在一定的序列差异性,并且存在数个对应物种特异性的氨基酸突变位点。     

热应激下鸡肝脏SFRP1和PDK4基因表达水平研究

为研究热应激条件下,鸡SFRP1和PDK4两个与代谢相关的基因在鸡肝脏组织中的差异表达,选取12只60日龄体重相近的黄羽肉母鸡,分为正常对照组(CL)、热应激反应组(HS)和热应激反应后的降温组(HF)3个处理组,并对这两个基因在三组肝脏组织中的表达水平进行荧光定量表达分析。结果表明,在热应激状态下,SFRP1和PDK4基因在肝脏中的表达均上调,且PDK4在对照组和热应激组间差异显著(P<0.05)。本研究结果还表明,当热应激反应后温度重新降至(25±1)℃时,SFRP1和PDK4在肝脏中的相对表达量均有不同程度的恢复,进一步说明这两个基因在热应激中发挥的作用。本研究为从分子机制分析热应激提供了相应的参考。     

牦牛MEF2A基因克隆与差异性表达分析

MEF2A是一种由MEF2A基因编码的蛋白质,在心脏和平滑肌细胞的形态发生和肌细胞的生成过程中发挥关键作用。该研究运用RT-PCR技术并结合生物信息学分析方法,对西藏类乌齐牦牛MEF2A基因CDS区序列进行克隆及差异表达分析。结果表明:牦牛MEF2A基因CDS区全长1469 bp,共编码489个氨基酸。分子式为C 2263 H 3601 N 647 O 742 S 20,蛋白质分子量52385.58,总原子数为7273,理论等电点(pI)为6.27,消光系数为27515,不稳定指数60.68。脂溶系数和亲水性平均值分别是64.60、-0.604,该蛋白属于亲水性不稳定蛋白。蛋白质二级结构和三级结构预测结果显示,MEF2A蛋白主要由无规则卷曲、α螺旋和延长链在空间上折叠形成。牦牛MEF2A基因CDS区编码的氨基酸序列与普通牛、家猫、家犬、绵羊、小鼠、金钱豹、宽吻海豚、抹香鲸、美洲野牛、白犀、马、东北虎、猴的同源性分别为99.6%、96.1%、96.4%、99.6%、89.3%、96.8%、96.6%、96.8%、93.6%、97.2%、96.1%、96.3%、96.7%,该基因在不同物种高度保守。利用实时荧光定量PCR检测可知,MEF2A mRNA在牦牛臀肌、心脏、肝脏、肺脏中均有表达,且在臀肌中的表达优势较为显著(P<0.05)。研究结果为进一步探讨MEF2A基因对牦牛肌肉代谢调控的分子机制研究提供了理论依据。     

山羊RPL27A基因克隆及组织表达特性分析

为研究山羊核糖体蛋白L27A （ribosome protein L27A,RPL27A）基因结构及其相关的生物学功能,试验采集简州大耳羊的14种组织样品（心脏、肝脏、脾脏、背最长肌、皮下脂肪等）,利用RT-PCR扩增并克隆获得山羊RPL27A基因序列,通过在线工具进行生物信息学分析;采用实时荧光定量PCR技术检测RPL27A基因在各个组织及不同分化阶段的皮下前体脂肪细胞中的表达水平。结果显示,山羊RPL27A基因CDS区长447 bp,可编码148个氨基酸。生物信息学分析表明,RPL27A基因在不同的物种间具有较高的保守性,RPL27A蛋白是不稳定的亲水碱性蛋白,其与脂代谢及脂肪沉积相关的RPS18、RPL26、RPL34、RPL32、RPL37A等核糖体蛋白存在相互作用,RPL27A蛋白没有跨膜结构域,且无信号肽,亚细胞定位表明其主要存在于细胞质中。实时荧光定量PCR结果显示,RPL27A基因在山羊心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肺脏、背最长肌、皮下脂肪等14种组织中均有广泛表达,且在瘤胃中表达水平最高,在臂三头肌和股二头肌中也存在较高的表达水平,均显著高于其他组织（P<0.05）;RPL27A基因在成脂诱导60 h的山羊皮下脂肪细胞中的表达水平显著高于分化前（P<0.05）。本研究成功克隆了山羊RPL27A基因CDS序列,并揭示了RPL27A基因在山羊14种组织中的表达特性,研究结果可为阐明RPL27A基因对山羊脂肪细胞分化的调控机制提供材料。     

徐淮山羊H-FABP基因克隆、表达产物亚细胞定位的研究及转基因小鼠的制备

旨在克隆徐淮山羊心脏型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)基因的cDNA,探讨其生物信息学功能。通过EGFP融合蛋白对该基因亚细胞水平的表达定位,探究该基因在异种生物体内表达情况,探索制备异种转基因动物的可能性。采用反转录PCR(RT-PCR)方法克隆徐淮山羊H-FABP基因cDNA,进行生物信息学分析,构建其融合表达载体pEGFP-H-FABP。脂质体(LTX)介导基因转染山羊成纤维细胞(GEF),48h后进行荧光检测,RT-PCR检测mRNA在细胞内的表达。利用睾丸注射将目的基因转入小鼠体内,在DNA和蛋白水平上检测目的基因的表达情况。结果,徐淮山羊H-FABP基因完整编码区(CDS)大小为402bp,编码133个氨基酸,GenBank登录号为AY466498.1。徐淮山羊H-FABP序列与人、鸡、褐家鼠、奶牛、野猪、驴及斑马鱼相应编码区同源性为89%、76%、85%、84%、93%、91%、70%,氨基酸序列同源性为90%、79%、88%、97%、95%、94%、72%。成功构建融合表达载体pEGFP-H-FABP,目的基因在mRNA水平上成功表达。目的蛋白定位于细胞质中,与在线预测结果相同(无信号肽,定位于细胞质中)。通过尾静脉注射和睾丸注射,该基因可以在小鼠体内实现暂态表达和持续性表达。本研究成功克隆了徐淮山羊H-FABP基因cDNA,而且H-FABP基因在进化过程中是保守的。该蛋白无信号肽,在单细胞水平上可表达于细胞质中,在小鼠体内也可以成功表达。