泰妙菌素生产菌种原生质体制备条件优化

[目的]探讨泰妙菌素生产菌种原生质体的最优制备方法。[方法]通过对原生质体制备条件进行优化,建立泰妙生产菌种原生质体制备体系。[结果]优化后制备条件:以培养3 d的菌丝体为材料,将其置于含质量浓度0.10%溶壁酶、0.60 mol/L MgSO_4的酶液中,25℃酶解3.0~3.5 h,将酶解液用G2砂芯漏斗过滤,滤液即为原生质体悬液。采用该方法,泰妙生产菌种原生质体制备率达1.5×10~6个/m L。[结论]试验结果为提高泰妙菌素生产菌种的产量提供了理论依据。     

冬虫夏草无性型原生质体再生条件研究

[目的]优化冬虫夏草原生质体再生条件。[方法]考察纤维素酶浓度、蜗牛酶浓度、两者混合体积配比、酶解温度、酶解时间、菌龄、稳定剂及培养基等条件对冬虫夏草无性型原生质体再生率的影响。[结果]冬虫夏草无性型原生质体再生的最佳条件为：纤维素酶浓度0．5％,蜗牛酶浓度0．5％,纤维素酶与蜗牛酶体积比1：1,酶解温度35℃,酶解时间1．5h,菌龄6d,甘露醇0．5mol,③号再生培养基（蔗糖10g,葡萄糖4g,酵母粉4g,甘露醇0．5mol,pH值6．2,琼脂18g,水加至1000ml）,在该最佳条件下原生质体再生率为0．43％。[结论]优化的冬虫夏草无性型原生质体再生条件简便、合理、可行。     

卡瓦胡椒离体再生体系的建立

[目的]建立卡瓦胡椒(Piper methysticum)的离体再生体系。[方法]以卡瓦胡椒的带芽嫩茎和嫩叶作为外植体,通过在培养基中添加不同的激素组合,来筛选最佳再生培养基。[结果]卡瓦胡椒的丛芽诱导培养基为MS+4 mg/L 6-BA+0.5 mg/L GA3+0.65%琼脂+3%蔗糖+0.012 5%PVP,最佳芽伸长根生长培养基为1/2MS+5 nmol/L JA+0.65%琼脂+3%蔗糖。[结论]为卡瓦胡椒的工业化生产提供了理论指导。     

橡胶树热研8-79原生质体培养再生植株

[目的]优化橡胶树热研8-79原生质体分离和培养条件,建立橡胶树原生质体培养植株高效再生体系,为橡胶树体细胞杂交育种奠定基础.[方法]以橡胶树热研8-79花药愈伤组织建立的胚性细胞悬浮系为试验材料,设计不同酶组合、酶解时间和悬浮细胞继代时间进行原生质体分离,采用不同培养基、看护细胞浓度和接种密度进行原生质体培养,对原生质体分裂发育的小愈伤组织进行体细胞胚诱导及植株再生培养,统计原生质体的产量、分裂频率、体胚数及体胚萌发率.[结果]酶组合为纤维素酶1.50%+果胶酶0.15%+离析酶0.50%、酶解时间为12h时,继代培养第5d的胚性悬浮细胞达最高产量(3.6 ×107个/mL PCV);用酶解细胞和看护细胞继代培养基分别作为原生质体液体培养基和看护培养基,比使用KPR培养基更有利于原生质体的分裂,当看护细胞浓度为5%、接种密度为5×105个/mL时原生质体的分裂频率最高,达54%.原生质体持续分裂形成肉眼可见的小愈伤组织增殖后经体胚发生途径发育成完整的小植株.[结论]通过优化橡胶树热研8-79胚性悬浮细胞原生质体分离的酶组合、酶解时间、继代培养时间及看护培养过程中培养基组成、看护细胞浓度和接种密度等影响因素,可以建立橡胶树原生质体培养植株高效再生体系.     

响应面法优化黄色短杆菌c-11产L-丝氨酸发酵培养基

[目的]利用响应面法对黄色短杆菌c-11发酵培养基进行优化,以提高L-丝氨酸产率.[方法]先采用Plackett - Burman实验法对发酵培养基8个因素(蔗糖、酵母膏、硫酸铵、KH2 PO4、MgSO4、生物素、VB1和碳酸钙)的效应进行评价,筛选出主要因素.之后采用最陡爬坡试验逼近主要因素(蔗糖、酵母膏和硫酸铵)的最大响应区域.在此基础上,采用Box - Behnken结合响应面法(RSM)确定主要因素的最佳水平,并通过二次方程回归分析.[结果]蔗糖浓度为83 g/L、酵母膏浓度为31 g/L和硫酸铵浓度为29 g/L时,此时模型稳定点预测值L-丝氨酸产量为22.27 g/L,验证值为22.65 g/L,预测值与验证值之间吻合较好.[结论]优化后的发酵培养基使c-11菌株的L-丝氨酸产量提高了28.11;.     

基于Box-Benhnken响应面法对银柴胡继代快繁培养基的优化

[目的]解决银柴胡种苗繁殖周期长、受外界环境影响大等问题。[方法]以银柴胡不定芽为试验材料，采用单因素试验及Box-Benhnken响应面法，对比继代快繁培养基中6-BA、NAA、蔗糖浓度对银柴胡不定芽生长的影响，探究最佳培养基培养配方。[结果]通过回归模型方程的分析并结合实际验证，MS+6-BA 2.04 mg/L+NAA 0.27 mg/L+蔗糖18.54 g/L为银柴胡继代快繁最佳培养基。[结论]以优化后的培养基进行继代快繁，银柴胡不定芽生长评分可达86.70,继代快繁效果较好，可为银柴胡种苗高质量、短周期快繁提供依据。     

甘蓝型油菜DH系培养技术优化

[目的]研究消毒处理方式、培养基成分和胚状体培养方法对油菜游离小孢子培养的影响。[方法]以B5培养基为基础培养基,添加不同浓度的蔗糖、琼脂及不同激素组合进行试验,对油菜DH系的组培技术进行优化。[结果]含2%Cl-的NaClO消毒15 min与0.1%HgCl2消毒10 min培养效果较好,都能达到良好的消毒和产胚效果;在游离小孢子提取的过程中,B5液体培养基中蔗糖浓度为2%时能达到较好的产胚效果;小孢子培养首先在32℃暗培养5~7 d,然后25℃暗培养12~15 d,最后25℃振荡暗培养3~7 d胚状体就可完全成熟;1/2 MS培养基(附加1.2%琼脂+0.02%NAA+2.0 mg/L6-BA+3.4 mg/LAgNO3+2%蔗糖)有利于胚的分化和苗的形成,其褐化程度小,玻璃化程度低。[结论]该研究结果有助于甘蓝型油菜DH系的规模化生产及高效转化体系的建立。     

石榴新品种“九州红”组织培养及快繁技术研究

[目的]研究石榴新品种"九州红"的组织培养及快繁技术。[方法]以"九州红"石榴当年生新梢茎段为外植体,以MS培养基为基本培养基,研究不同浓度激素配比对"九州红"芽分化、增殖及生根的影响。[结果]"九州红"最佳芽分化培养基为MS+0.8 mg/L6-BA+0.3 mg/L IAA+3.0%蔗糖+1.3%琼脂条,约40 d后可诱导出丛生芽,成芽率达61.2%;在MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IAA+3.0%蔗糖+1.3%琼脂条培养基上丛生芽的增殖速度最快,增殖系数达3.62,且芽生长健壮;"九州红"的最佳生根培养基为1/2MS+0.6 mg/L IBA+0.1 mg/L NAA+3.0%蔗糖+1.3%琼脂条,此时生根率可达91.2%,平均每株生根达3.8条,且植株生长健壮,适于移栽。[结论]该研究为"九州红"石榴种苗的大规模生产提供了技术支持。     

冰砂糖寿组培快繁研究

[目的]探讨冰砂糖寿组培快繁的最佳条件。[方法]以冰砂糖寿幼嫩花序为外植体,研究冰砂糖寿组培快繁技术。[结果]于MS+5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IBA+30 g/L蔗糖+7g/L琼脂的诱导培养基上成功诱导出愈伤组织,在分化培养基MS+0.3 mg/L6-BA+30 g/L蔗糖+7 g/L琼脂上继代培养可分化成不定芽,将不定芽转接到增殖培养基MS+0.3 mg/L 6-BA+0.1 mg/LNAA+30 g/L蔗糖+7 g/L琼脂上增殖速度较快,增殖系数达3.79。将其移栽至营养基质(混合泥炭∶粗砂=1∶1)中,移栽成活率可达95%。[结论]建立了冰砂糖寿花序再生及快繁体系,为其规模化生产提供理论依据。     

盖杨叶片高频植株再生体系建立

[目的]利用生物技术手段提高盖杨抗寒性并扩大其栽培区域。[方法]以盖杨叶片为外植体,研究不同激素组合对盖杨叶片分化及生根的影响,建立盖杨叶片高频植株再生体系。[结果]盖杨不定芽分化最适培养基配方为MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.20 mg/L+蔗糖25 g/L+琼脂6.0 g/L,p H 6.5,不定芽再生频率为96.67%,平均分化芽数20.3个;最适生根培养基配方为1/2MS+IBA0.3 mg/L+蔗糖20 g/L+琼脂6.0 g/L,p H 6.0,生根率可达100%,平均生根数15.8条。[结论]该研究建立了盖杨高效组织培养再生系统,为该杨树品种的快速无性繁殖和基因的遗传转化提供了依据。     

金耳原生质体制备与再生研究(英文)

[目的]对金耳原生质体制备与再生体系进行研究。[方法]采用正交试验法筛选金耳原生质体制备和再生体系中酶体系、菌龄、温度、时间、渗稳剂的最佳用法。[结果]金耳原生质体的释放方式有三种类型:酶解初期的顶端释放、侧位释放和后期的原位释放。其最佳制备条件为:液体静置培养3d的菌丝体,在1%纤维素酶+1%蜗牛酶+1%溶壁酶的混合酶液中,以0.6mol/L蔗糖为渗稳剂,36℃酶解4h,得到原生质体制备率达1.76×107个/ml;最佳再生条件为:液体静置培养5d的菌丝体,在1.5%溶壁酶的酶液中,以0.6mol/L蔗糖为渗稳剂,33℃酶解3h,得到原生质体再生率达0.22%。[结论]为金耳的原生质体融合、紫外线诱变育种、基因工程研究等提供了有益支持。     

金耳原生质体制备与再生研究

[目的]对金耳原生质体制备与再生体系进行研究。[方法]采用正交试验法筛选金耳原生质体制备和再生体系中酶体系、菌龄、温度、时间、渗稳剂的最佳用法。[结果]金耳原生质体的释放方式有3种类型:酶解初期的顶端释放、侧位释放和后期的原位释放。其最佳制备条件为:液体静置培养3 d的菌丝体,在1%纤维素酶+1%蜗牛酶+1%溶壁酶的混合酶液中,以0.6 mol/L蔗糖为渗稳剂,36℃酶解4 h,得到原生质体制备率达1.76×107个/ml;最佳再生条件为:液体静置培养5 d的菌丝体,在1.5%溶壁酶的酶液中,以0.6mol/L蔗糖为渗稳剂,33℃酶解3 h,得到原生质体再生率达0.22%。[结论]为金耳的原生质体融合、紫外线诱变育种、基因工程研究等提供了有益支持。     

红色素产生菌RZ21菌株的原生质体紫外诱变育种研究

[目的]对红色素生产菌RZ21菌株的原生质体进行紫外诱变育种,以提高其红色素的产量。[方法]以粘质沙雷氏菌为供试菌种,研究其原生质的制备、再生的条件和该菌的原生质紫外诱变对红色素产量的影响。[结果]RZ21菌株以溶菌酶8 mg/ml,37℃作用30 min后,再加0.01 mol/L（终浓度）的EDTA作用20 min,原生质体形成率达81.9%,再生率达31.5%。该菌原生质体经紫外诱变原生质体处理及抗性平板、摇瓶两步筛选后,得到1株高产株RZ21-3,灵菌红素产量达到了0.813 g/L,比原始菌株提高了24.9%。[结论]溶菌酶8 mg/ml,37℃作用30 min后,再加0.01 mol/L（终浓度）的EDTA作用20 min为该菌原生体制备的最佳工作条件。     

拮抗木霉gz-2菌株原生质体制备及转化条件优化

[目的]优化拮抗木霉gz-2菌株原生质体制备及转化条件,快速、高效获得绿色荧光标记菌株,为哈茨木霉及同类真菌的GFP标记提供参考,并为下一步研究其在不同环境中的定殖动态、分布规律及生防特性等打下基础.[方法]采用PEG-CaCl2介导的原生质体转化体系,从木霉菌株的菌龄、酶解时间、转化体系中质粒的含量及再生培养基中潮霉素B(HmB)的浓度等方面对哈茨木霉gz-2菌株原生质体制备及转化条件进行优化,获得表达稳定的转化子,并与出发菌株的生长特性进行比较,评价转化效果.[结果]gz-2菌株培养36 h菌丝所形成的原生质体稳定性最好,菌丝体酶解3.5 h获得的原生质体数量最多,达11.67×106个/mL;每240μL转化体系中质粒DNA含量为40μL,得到的转化子数量最多,为8.67个/皿;再生培养基中HmB含量为600μg/mL时可获得稳定的强转化子.[结论]筛选获得1株表达稳定的转化子GFP-gz-2菌株,该菌株在菌落形态、菌丝生长速率及产孢量上与出发菌株gz-2无显著差异,且具有较好的遗传稳定性.     

玉蕈原生质体制备条件研究

[目的]探索了玉蕈原生质体的制备与再生的适宜条件。[方法]采用斜面、平板培养基和液体培养基,研究了玉蕈菌丝体酶解时间(1~5 h)、酶解温度(25℃)和菌龄(4~7 d)以及渗稳剂种类(甘露醇、蔗糖、KCl、MgSO4)对玉蕈原生质体制备与再生的影响,优化了玉蕈原生质体制备与再生的条件。[结果]玉蕈原生质体制备与再生的适宜条件是:渗稳剂为0.6 mol/L MgSO4.7H2O,玉蕈菌丝体酶解时间2h,酶解温度25℃,菌龄5 d。在此条件下,玉蕈原生质体的产量最高,达16.7×106个/ml。[结论]该研究为利用原生质体技术进行玉蕈育种奠定了基础。     

响应面法优化高山被孢霉产花生四烯酸的合成培养基研究

[目的]对高山被孢霉利用合成培养基液体发酵产花生四烯酸(ARA)的发酵液组分进行优化。[方法]对培养基中的碳源进行了优化,对单一碳源、复合碳源进行筛选,并优化了它们的起始浓度。利用单因素试验对多种无机氮源进行了筛选。对具有显著效应的葡萄糖、甘油、酵母粉和氨基酸混合物4个因素进行最陡爬坡试验后,利用响应面中心组合设计对显著因素进行了优化。[结果]最佳碳源组合为葡萄糖80 g/L+甘油20 g/L。以酵母粉为氮源,以氨基酸混合物为生长因子添加到培养基中,可促进高山被孢霉发酵液中ARA的积累。最佳合成培养基组分为:葡萄糖80 g/L,甘油12 g/L,酵母粉20 g/L,氨基酸混合物0.3 g/L。对优化后的合成培养基进行了验证,摇瓶发酵培养7 d后检测其产量,测得平均产量为7.084 1 g/L,与预测值接近。[结论]该研究结果可为进一步提高ARA在工业化生产中的得率提供研究基础。     

原生质体紫外诱变选育普鲁兰酶高产菌株

[目的]对酸性普鲁兰酶产生菌的原生质体制备条件及诱变育种进行研究。[方法]对盐球菌（Halococcus sp.）Z1的原生质体制备和再生条件进行了研究,并对其原生质体进行紫外诱变选育普鲁兰酶高产菌株。[结果]菌体经培养14 h后,在36℃、2.8 mg/ml溶菌酶作用下酶解1.5 h,其原生质体形成率和再生率分别为87.4%和19.4%。采用紫外线对原生质体进行诱变,筛选得到9株普鲁兰酶活性比出发菌株高的突变株,其中D9-08的酶活达6.37 U/ml,比诱变前提高了0.96倍,经10次传代遗传性稳定。[结论]利用原生质体紫外线诱变手段进行酸性普鲁兰酶产生菌的育种是一条可行并具有较好效果的途径。     

灵芝原生质体的高效制备及诱变

[目的]探讨灵芝原生质体的高效制备及诱变方法。[方法]用2.5%溶壁酶、0.5%蜗牛酶和0.5%纤维素酶组成的复合酶液裂解适龄灵芝菌丝体,制备原生质体,统计其再生频率,并用制备出的原生质体进行诱变试验。[结果]采用该制备方法获得了高质量的原生质体,其再生率能稳定达到80%以上,且经复合诱变后发生基因突变的频率也较高。[结论]该研究为后续的灵芝诱变选育奠定了基础。     

响应面法优化重组毕赤酵母菌表达β-甘露聚糖酶的诱导条件

[目的]对重组毕赤酵母菌表达β-甘露聚糖酶的诱导条件进行优化。[方法]以重组毕赤酵母GS115为研究对象,通过单因素试验确定最佳产酶条件,并采用响应面试验确定3个因素的最佳水平。[结果]最佳产酶条件为:培养温度28℃,培养pH 6.5,摇床转速210 r/min,培养基装液量100 ml。响应面试验确定3个因素即装液量、甲醇添加量和pH最佳值分别为103.18 ml、1.77%和6.69;在此条件下,β-甘露聚糖酶的活力最大值为4 917.5 U/ml。[结论]验证试验证明模型预测值准确、可靠,为重组毕赤酵母菌的合理开发利用提供了依据。     

拮抗甜瓜枯萎病链霉菌D2菌株发酵条件的优化

[目的]优化甜瓜枯萎病拮抗链霉菌D2菌株的发酵条件,为该菌发酵方法的建立及工业化生产提供科学依据.[方法]以D2菌株有效活菌数为考察指标,玉米粉含量、豆饼粉含量、pH、摇床转速、接种量和温度为影响因素,利用响应面法对D2菌株的发酵条件进行优化.[结果]豆饼粉含量、玉米粉含量和温度对D2菌株有效活菌数有显著影响(P<0.05).D2菌株有效活菌数回归模型为:Y=8.28757+0.12344X1+0.21477X2+0.06184X3-0.05929X12-0.09817X22-0.14942X32(式中,Y为有效活菌数对数,X1、X2和X3分别为玉米粉含量、豆饼粉含量和温度的编码值),理论有效活菌数为2.99×108 CFU/mL.D2菌株最优发酵条件为:玉米粉含量39.08 g/L、豆饼粉含量39.19 g/L、培养温度37.4℃,在此条件下D2菌株有效活菌数为3.01×108 CFU/mL,与理论值接近,但极显著高于未经优化采用培养基Ⅱ得到的有效活菌数(1.0×106 CFU/mL)(P<0.01).[结论]采用响应面法优化得到的D2菌株发酵条件可有效提高该菌株有效活菌数,且回归模型推算出的理论活菌数与优化条件发酵的有效活菌数接近,可用于指导D2菌株的实际规模化生产.