高酯型儿茶素含量的茶树资源筛选研究

以福建省茶树品种园780份资源为试验材料,依外部形态特征初步筛选出45份较有希望的品种或株系。用等度高效液相色谱法,分析检测这45个品种或株系的春梢、夏梢、秋梢酯型儿茶素含量,筛选高酯型儿茶素含量的茶树特异资源。结果表明:新梢酯型儿茶素含量在不同品种、株系间差异很大;春梢、夏梢、秋梢的酯型儿茶素含量变化范围分别为5.21%～24.03%、3.05%～20.31%、2.89%～19.66%,平均值分别为16.08%、14.73%、9.96%,变异系数分别为22.26%、24.10%、40.76%。同一品种或株系新梢的酯型儿茶素含量呈季节性变化,大多数(约71.11%)表现为:春梢>夏梢>秋梢。有5个品种、株系(033、505、509、524、1005),春、夏、秋三季,酯型儿茶素平均含量高于19%,为超常规水平的高酯型儿茶素茶树特异资源,可作为品质遗传改良或直接应用于提取酯型儿茶素的重要材料。有8个品种、株系[033、505、509、510(1)、510(2)、524、1001、1005]新梢酯型儿茶素含量在儿茶素总量中所占比例高达80%以上(一般品种为68%),可作为提取茶多酚、儿茶素的特种材料。     

茶树酯型儿茶素水解酶鉴定及其检测体系的建立

本试验利用体外酶学方法,结合薄层层析（TLC）、高效液相色谱（HPLC）和液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析,首次从茶树中检测到活性较高的酯型儿茶素水解酶（Galloylated Catechins Hydrolase,GCH）的存在。在酯型儿茶素水解酶催化下,酯型儿茶素发生水解反应,生成没食子酸（GA）和非酯型儿茶素。试验确立了酯型儿茶素水解酶的最适检测体系,在2.5mL反应体系中包含0.2mmol/L酯型儿茶素、2.4mmol/L抗坏血酸、粗酶提取液若干（含0.1mg酶蛋白）和0.1mol/L磷酸缓冲液（pH6.5）,在30℃下,反应30min。此外,试验利用硫酸铵分级沉淀、阴离子交换层析和凝胶过滤层析对该酶进行了初步纯化。     

澳大利亚茶树新梢多酚类物质的季节性变化

采用高效液相色谱法（HPLC）研究了生长在澳大利亚的茶树新梢多酚类物质的季节性变化。茶树新梢样品在2000年4月至2001年5月采集，分析了3种主要黄烷醇（EGCG、ECG、EGC）和4组酚类物质[儿茶素总量（Cs）、酯型儿茶素总量（CGs）、黄烷醇总量（Fla）和多酚类总量（PPs）]的含量及其季节变化。结果表明，新梢EGCG、ECG和CGs含量在温暖季节较高，     

湖北地方茶树种质资源中酯型儿茶素含量研究

以26份湖北地方茶树种质资源为供试材料,采用高效液相色谱分析检测其春、夏、秋茶中CG、ECG、GCG、EGCG等4种主要酯型儿茶素组分含量。结果表明,CG、ECG、EGCG和酯型儿茶素总量在不同季节中的平均含量顺序为夏茶春茶秋茶,GCG的顺序为春茶夏茶秋茶;在春、夏、秋茶中,绝大部分茶树种质资源酯型儿茶素组分含量间表现出的变化趋势为EGCGGCGECGCG。各茶树种质资源春、夏、秋茶中酯型儿茶素的变异系数在13.21%~36.99%之间,季节间的变辐较小,个体间的变幅较大。基于酯型儿茶素的年均含量聚类分析显示,第2类群中CG和ECG含量高,第4类群中GCG和酯型儿茶素总量含量高。鄂茶7号、五峰310、五峰602、宣恩65等4个资源的夏茶和五峰108的夏茶、秋茶、年平均EGCG含量均在9.0%以上,可视为高EGCG茶树种质资源,可在今后育种和生产中加以利用。     

外源诱导物WAT对茶树新梢儿茶素含量的影响

本试验研究外源诱导物WAT在福云六号茶树上的施用效果.将WAT稀释100倍、1 5 0倍、2 00倍、25 0倍、300倍分别喷施于福云六号茶树上,清水作对照,诱导1d、3d、5d后,采摘鲜叶,分析测定其儿茶素含量.试验结果表明:WAT诱导3d,稀释200倍、250倍的WAT,可使茶树新梢儿茶素含量与对照相比,分别相对提高48.65%、45.11%,达极显著水平;而稀释150倍、300倍的WA,分别相对提高2 3.00%、28.82%,达显著水平.     

混菌发酵绿茶产脂肪酶及其对酯型儿茶素的水解作用分析

微生物的发酵作用导致黑茶加工过程中儿茶素的生物转化和总茶多酚含量的下降,这一转化过程的代谢途径和调控机制尚不清楚。通过添加冠突曲霉(Aspergillus cristatum)菌株PE-1和黑曲霉(A. niger)菌株PE-4混合发酵绿茶,采用鉴别培养基平板检测、酶活性测定和酶蛋白分离纯化,研究脂肪酶活性及其对酯型儿茶素的水解作用。两个菌株单菌发酵和混合菌种发酵绿茶条件下均可以检测到脂肪酶活性,混菌发酵酶活力高于两个菌株单菌发酵的酶活力。混菌发酵条件下获得一个分子量约为37 kDa的脂肪酶,对EGCG和ECG有不同的生物转化作用。UPLC检测结果表明,该脂肪酶对EGCG有较好的底物选择性,EGCG的水解率为94.46%,EGC的产率为63.33%;ECG的水解率为15.45%,EC的产率为4.15%。脂肪酶对EGCG和ECG的生物转化将为儿茶素代谢途径的研究和单体儿茶素的生产起到促进作用。     

咖啡碱和蛋白质对酯型儿茶素氧化形成TFDG的影响

对咖啡碱（CAF）和牛血清白蛋白（BSA）在双酯型茶黄素形成中的影响进行了研究分析。结果表明,咖啡碱和牛血清白蛋白对TFDG的形成均有明显的抑制作用,而且相同条件下,牛血清白蛋白和咖啡碱表现出相似的抑制作用。当牛血清蛋白与咖啡碱同在一个化学氧化反应体系中时,表现出随浓度不同而呈现复杂的竞争或协同作用。     

添加木瓜蛋白酶对速溶茶中酯型儿茶素和EGCG含量的影响

在速溶茶加工过程的浸提工序阶段,添加木瓜蛋白酶可极显著提高速溶绿茶（梅占）中酯型儿茶素和EGCG的含量,但是添加量不同,对速溶乌龙茶（八仙）中酯型儿茶素和EGCG的含量影响不同。     

茶树愈伤组织培养及其儿茶素累积

对不同培养条件下茶愈伤组织生长及其儿茶素累积情况进行了研究,结果表明,激素 IBA 或KT 在单独使用时,效果各异,但两者间存在明显的互相作用效应,其中以 KT 10mg/L 和 IBA0.1mg/L 组合,对儿茶素累积最为有利,MS 培养基适合愈伤组织生长,而 White 培养基上的细胞儿茶素累积最高;提高蔗糖浓度有利于次生代谢产物的形成,但浓度过高不利于愈伤组织生长;在一个生长周期中,儿茶素累积的增加与愈伤组织鲜重增长密切相关,儿茶素含量在直线期末、静止期初最高。通过对培养材料来源的选择和培养基组成的调节,使茶愈伤组织儿茶素含量从不足1mg/gFW 提高至16—20mg/gFw。     

遮荫对茶树新梢叶绿素及其生物合成前体的影响

研究了遮阳网遮荫处理对鸠坑、龙井43、水古新梢叶绿素生物合成前体物质和新梢叶绿素积累的影响。结果显示：遮荫降低光照强度,茶树新梢叶绿素含量显著增加;同时叶绿素生物合成的前体物质δ-氨基酮戊酸（aminolevulinic acid, ALA）、卟啉胆色素原（porphobilinogen, PBG）、尿卟啉原Ⅲ（Urogen Ⅲ）等含量降低,而原卟啉Ⅸ（protoporphyrin Ⅸ, ProtoⅨ）、镁原卟啉Ⅸ（magnesium protoporphyrin Ⅸ, Mg-ProtoⅨ）、原叶绿素酸酯（protochlorophyllide, Pchlide）含量升高。     

43份茶树品种资源遗传多样性的SSR研究

采用SSR分子标记技术对43个茶树品种(系)进行了遗传多态性分析。用37对可扩增引物对43个茶树品种(系)扩增,经8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,其中有34对引物产生多态性,不同引物扩增带数分布在1～11条之间,扩增片段大小介于150～350bp。应用DPS软件,进行遗传距离和相似性系数计算,43份材料遗传距离的变化范围在0.059～0.820之间,说明供试茶树资源间的遗传变异十分宽广。根据UPGMA法构建聚类树状图,在平均遗传距离水平上,可将43份材料划分为7个类群。     

茶树花青素还原酶的酶学特性研究

茶树花青素还原酶(CsANR)作为原花青素生物合成途径中的关键酶,催化花青素为相应的2,3-顺式-黄烷-3-醇。为了研究该酶的酶学特性,本文采用原核表达及钴离子亲和柱纯化技术,表达并纯化出目的蛋白;重点对CsANR1酶学特性进行研究分析。结果表明,CsANR1的最适反应温度为40℃,最适pH值为6.5;对底物矢车菊色素的亲和力高于飞燕草色素。Cu2+、Co2+、Fe2+、Mn2+、Zn2+和Hg2+等金属离子对酶有抑制作用,存放15d后酶活下降50%。     

茶树花青素还原酶基因在大肠杆菌中的表达及优化

茶树花青素还原酶是催化非酯型儿茶素EC和EGC合成的关键酶。采用RT-PCR技术,获得了茶树花青素还原酶基因的开放阅读框,它编码含337个氨基酸的蛋白质,推测分子量为37kD,等电点为6.54;成功地将该基因重组到表达载体pET32a(+)上,并在大肠杆菌rosetta中进行原核表达;优化了原核表达中诱导时间、诱导温度、IPTG浓度、氨苄青霉素浓度,纯化出目的蛋白。HPLC检测表明,目的蛋白具有ANR酶活性。     

外源亚精胺对铅胁迫下茶树生长的影响

选取龙井43为材料,采用盆栽试验,研究了外施1.0 mmol·L^-1的亚精胺（Spd）对不同浓度重金属铅（Pb²⁺）胁迫下茶树株高、地径和叶片相关抗氧化酶活性、渗透调节物质含量、丙二醛（MDA）含量、细胞膜透性以及叶绿素含量等生理指标的影响。结果表明,低浓度铅胁迫能够促进茶树生长,而高浓度铅胁迫影响了茶树正常生长;喷施外源亚精胺有效缓解了随着胁迫Pb²⁺浓度升高对茶树造成的伤害,提高了叶片抗氧化酶活性、可溶性蛋白含量和叶绿素含量,降低了叶片脯氨酸（Pro）含量、MDA含量和相对电导率（RC）,从而促进茶树生长。表明外源亚精胺对铅胁迫下茶树生长具有积极的促进作用。     

利用SSR标记分析金观音(半)同胞茶树品种遗传差异

准确鉴定无性系茶树品种的遗传差异是对其进行保护与利用的重要前提。实验对金观音同胞及半同胞茶树品种的遗传差异进行了分析,结果表明,参试的31个SSR标记分型结果具有高度的稳定性。共扩增出117个等位位点,单个标记为2.0~8.0个,平均3.77个。基因型数为2.0~11.0个,平均5.16个。基因多样性指数范围为0.15~0.80,平均0.54。基因杂合度范围为0.17~0.94,平均0.61。引物多态信息含量范围为0.14~0.77,平均0.48。引物鉴别力范围为0.07~0.73,平均0.29。参试品种两两之间的遗传距离变化范围为0.10~0.52,平均0.35。遗传多样性大小顺序为:同胞茶树品种半同胞茶树品种非同胞茶树品种。利用系统发育树可将参试茶树品种分为5类,与茶树品种的叶色、制茶特征分类结果基本一致。任意两个品种同时在6个核心引物处(基因座)的基因型存在相同的可能性很低,为3.85×10-5,这组核心引物具有较高的鉴别力,可将参试茶树品种完全鉴定。     

基于SCoT标记的福建茶树品种（系）遗传多样性分析

利用SCoT标记对福建茶树资源进行分析,构建适用于福建茶树资源SCoT-PCR扩增体系。从38条SCoT引物中筛选出的16条多态性引物,构建了55份茶树品种（系）的SCoT标记指纹图谱。对55份材料共扩增出219条条带,多态性条带为216条,平均每条引物扩增出13.8条,多态性比率PPB为93.15%,55份供试材料的遗传相似系数（Genetic similarity, GS）介于0.49~0.85,平均为0.67。SCoT标记分析55份供试材料共两个群体的观测等位基因数Na为1.93,有效等位基因数Ne为1.54,Nei基因多样性为0.32,香农指数Shannon为0.48,遗传分化Gst为0.067,基因流Nm为7.01。在遗传相似系数为0.64处,将55份茶树资源分成2大类。     

基于荧光标记SSR的CID法快速鉴定福建茶树品种

茶树品种真实性鉴定是茶树种质资源研究的重要组成部分,是茶树品种知识产权保护的前提。在茶树基因组上按照均匀分布的原则选择45个SSR标记合成荧光标记引物,利用这些标记引物对54个福建无性系茶树品种进行PCR扩增,标记基因型分型后进一步筛选出9个SSR标记核心引物。这批核心引物的多态性信息含量(Polymorphism information content,PIC)均大于0.5,等位位点数在3~5之间,基因型数在5~10之间,属于高度多态性引物且方便进行基因型数据统计,适宜用来进行无性系茶树品种的真实性鉴定。利用其中的6个标记核心引物建立了54个福建无性系茶树品种的品种鉴别图(Cultivar identification diagram,CID),该CID能直观地提供对其中任意品种进行鉴定所需要的标记引物以及相应的标记基因型,且能够方便地进行扩容以用来对更多的无性系茶树品种进行真实性鉴定。利用该方法对无性系茶树品种进行真实性鉴定,操作方便、快速准确、稳定性高、实用性强。本实验所获得的茶树品种鉴定图(CID)对茶树品种知识产权保护,以及促进茶树品种选育工作健康可持续发展具有重要的意义。     

不同品种茶树氮素效率差异研究

比较了6个茶树品种的氮素效率差异。结果表明,在4种施氮条件下,生物量增加值、新梢生长量、氮素吸收效率、氮素生理利用效率、氮素经济效率和总的氮素效率存在着显著的品种间差异。氮素效率的两个子性状—吸收效率和生理利用效率对其贡献大小不同,吸收效率是决定不同品种茶树氮素效率差异的主要因素。     

茶树白化变异研究进展

白化现象在植物界普遍存在,茶叶作为一种叶用植物,白化变异植株中关键化学成分如叶绿素、类胡萝卜素、儿茶素类、氨基酸类、黄酮类等物质含量发生了显著变化,这些变化对茶树生长发育、抗逆性、茶叶制作工艺、口感等有重要影响。叶色变异作为一种突变性状对于茶树新品种选育有着重要的应用价值,对研究茶树光合作用机制、叶色调控机理、叶片发育调控等也有重要理论价值。本文综述了国内近几年关于茶树白化突变体化学成分叶绿素、类胡萝卜素、氨基酸、儿茶素的研究及茶树白化突变分子机制的研究进展,旨在为茶树白化突变体分子机制的深入研究提供参考。