水稻细菌性条斑病种子带菌检测技术研究：I． 免疫放射分析法

 免疫放射分析法（IRMA）集放射性同位素的灵敏性与抗原-抗体反应的特异性为一体。该方法应用于水稻细菌性条斑病种子带菌检测，经三年试验表明这一方法具有灵敏度高(最小检测浓度为10^3细菌／ml)。特异性强，稳定性好。快速(4～5小时内可得出结果)。通过402份样品的检测，经与常规的浓缩接种法比较，表明该方法应用于带菌稻种的检测前景广阔。     

芸薹根肿菌及油菜根肿病分子检测与早期诊断

近年来芸薹根肿菌引起的根肿病已成为我国油菜的主要病害,严重影响油菜及其它十字花科作物的产量及品质。为建立一套在土壤、植物组织和种子中精准检测根肿菌的高效分子方法,利用根肿菌ITS(internal transcribed spacer)序列,设计一对特异性引物(Pb ITS1),通过PCR反应优化体系进行根肿菌的分子检测及病害评估。结果表明,该引物及方法能够特异性检测根肿菌DNA,不受土传病原真菌、细菌、线虫及寄主植物内生菌的DNA干扰。灵敏性检测表明,模板DNA最低浓度达1pg·μL^-1,土壤带菌量最低为1×10^3个孢子/g土,种子带菌量最低1×10^5个孢子/g种子。此外,该体系能够用于检测油菜及其它十字花科寄主植物(如组织、种子)和土壤类型。同时,可用于田间油菜不同生长阶段油菜根部及周围土壤的根肿菌检测。本研究建立的检测体系操作简便、适用范围广、灵敏度高、特异性强,可检测样品种类丰富,可为油菜及其它十字花科根肿病的早期诊断、流行监测与预警、综合防控等提供科学依据。     

应用单克隆抗体检测稻种带水稻细菌性条斑病菌研究(简报)

水稻细菌性条斑病(Xanthomonas campestris PV. Oryzicola)是国内检疫病害。当前普遍推测此病通过带菌稻种传播蔓延。迄今尚无检测稻种带菌的有效方法。1986年以来,我们应用单克隆抗体特异性强、灵敏度高的特点,研究检测稻种携带细菌性条斑病原的方法。主要方法是:从新鲜病叶上分离、纯化水稻细菌性条斑病菌,然后用它免疫BAIA/C小白鼠,取其脾细胞和骨髓瘤细胞融合。然后对杂交瘤细胞进行筛选,制备单克     

马铃薯环腐病菌快速检测方法(NCM-ELISA)的建立

建立检测马铃薯环腐病菌NCM-ELISA方法并组装成试剂盒,应用于检测、检疫和流行病学调查具有实践意义。本研究以马铃薯环腐病菌为抗原,制备兔抗血清,利用碱性磷酸酯酶标记的羊抗兔血清(GAR-AP)为酶标二抗,建立了马铃薯环腐病菌NCM-ELISA快速检测方法。结果表明:抗血清的最佳工作浓度为1:400,最低检出菌液浓度为1.0×106个.mL-1,特异性也比较强。因此,该方法具有敏感性高、特异性强、速度快、实用方便等特点,可以应用于马铃薯环腐病菌的快速检测和诊断。     

水稻细菌性谷枯病菌的实时荧光PCR检测技术研究

 水稻细菌性谷枯病菌Burkholderia glumae于2007年被列为我国进境植物检疫性有害生物,国内急需建立针对该菌切实可行的检测技术, 以有效控制它在我国的传播。采用实时荧光PCR（real time fluorescence PCR）和经典PCR技术进行水稻细菌性谷枯病菌检测。研究结果表明,供试所有谷枯病菌都能产生139 bp左右的特异性片段,非谷枯菌株均无特异性片段产生。两种检测方法的灵敏度比较发现,常规PCR技术在病菌浓度为104CFU/mL时即可检测到,实时荧光PCR技术在病菌浓度为102CFU/mL时即可检测到,后者比前者的灵敏度高100倍。将模拟带菌种子与灭菌种子按1∶100混合,实时荧光PCR技术可以检测到该菌的存在。     

环介导等温扩增技术在甘蔗转基因及病害检测中的应用

环介导等温扩增技术(LAMP)是利用Bst(Bacillus stearothermophilus)DNA聚合酶在体外对特定核酸片段进行等温扩增的一种检测技术,具有灵敏度和扩增效率高、特异性强、操作简单和成本低等优点,广泛应用于转基因和病原菌的检测。本文简要对该技术的原理与发展及其在甘蔗转基因及病害检测中的应用进行综述和展望。     

湖南省油菜品种的种传链格孢菌检测

2012年在湖南醴陵市油菜黑霉病果上经镜检和病种分离检出链格孢(Alternaria spp.),其后检测了36个品种的种子带菌情况,华湘油12号带菌率最高（51%）。经rDNA-ITS序列分析,分离菌分属芸薹生链格孢(A. brassicicola)和芸薹链格孢(A. brassicae)两个种。华湘油12号带菌率最高（66%）,且全为芸薹生链格孢,而芸薹链格孢以常油杂61为最高（15%）,未检测到萝卜链格孢(A. raphani)。禾盛油868种子上未检测到链格孢菌。     

检测小麦线条花叶病毒的TaqMan MGB探针技术

为给小麦线条花叶病毒(Wheat streak mosaic virus,WSMV)的灵敏、稳定、快速检测提供依据,根据该病毒不同分离株外壳蛋白(Coat protein,CP)基因的保守序列,设计了特异性引物与TaqMan MGB荧光探针,建立了WSMV的实时荧光RT-PCR检测方法.结果表明,本研究设计的TaqMan MGB荧光探针对WSMV的检测具有很好的特异性,解决了因病毒不同分离物之间基因组变异较大、难以找到长片段保守序列来设计探针的困难.该方法无需任何PCR后处理.基因污染风险小.它与双抗体夹心酶联免疫检测方法相比,灵敏度提高1 000倍,具有快速、灵敏和高特异性的优点,适合于WSMV的快速检测.     

双重RT-PCR方法检测花生条纹病毒和黄瓜花叶病毒

为了建立花生条纹病毒(PStV)和黄瓜花叶病毒(CMV)的双重RT-PCR检测方法,根据Gen-Bank中登陆的PStV和CMV的核苷酸保守序列分别设计特异性引物,以感病叶片总RNA反转录物为模板,建立了双重RT-PCR反应体系,并对双重RT-PCR的特异性和灵敏性进行了验证。结果表明:此方法能够特异地从感染PStV和CMV的样品中扩增出PStV(300bp)和CMV(1054bp)2个条带,与实验设计相符;扩增产物测序结果表明,PStV扩增产物与GenBank中其它株系或分离物的核苷酸序列同源性为93%～99%,CMV扩增产物与GenBank中其它株系或分离物的核苷酸序列同源性为90%～99%,证明了检测结果的准确性;该方法特异性良好,灵敏性与单一扩增相同,能够特异、灵敏、准确地检测花生CMV和PStV。     

柑橘黄龙病可视化LAMP检测技术的建立及应用

建立柑橘黄龙病(HLB)可视化环介导等温扩增(LAMP)检测方法,为HLB的快速检测提供有力的技术支持。根据LAMP技术原理,针对柑橘黄龙病菌16S rDNA靶序列的6个位点设计4条特异性引物,通过对反应体系和反应条件的优化,并在反应前的体系中加入1∶10的钙黄绿素(calcein)和氯化锰(MnCl2)混合液作为荧光显色剂,建立可视化LAMP检测技术,同时对该技术的特异性、灵敏度和样品检测进行了测试。该检测方法具有很高的特异性,反应体系中除了HLB具有特异性的扩增,产生黄绿色荧光扩增产物,其他供试菌株均无特异扩增。对柑橘黄龙病菌总DNA的检测限为1.51×10-3 ng/μL,而对含有目的基因的CG-pMD18-T质粒DNA的检测限为2.12×10-6 ng/μL,与定量PCR灵敏度相当,而比常规PCR灵敏度高1 000倍。利用可视化LAMP技术和定量PCR对来自漳州、南平、福州等地的样品进行检测,结果 2种技术的检出率均为76.7%,符合率达到100%。     

抗虫玉米MON89034转化体特异性PCR检测技术研究

根据抗虫玉米MON89034外源插入片段5’端与植物基因组连接区序列设计特异性引物,并进行PCR扩增,预期产物大小为455 bp。以zSSIIb基因作为内标准基因,建立了转基因玉米MON89034转化体特异性定性PCR检测方法。对该方法进行重现性、特异性和灵敏度测试,结果表明:该方法能够特异性检测出MON89034转化体,以100 ngDNA为模板,该方法的检测灵敏度达到0.1%,约为40个起始模板拷贝。复合PCR检测结果还表明,在同一PCR反应管中可实现对zSSIIb基因和MON89034的同时检测。     

转基因大豆插入位点分析及特异性PCR检测方法的建立

采用TAIL-PCR方法研究转基因大豆外源基因LEC1插入位点序列特征,并根据此特征建立了LEC1转化事件特异性检测方法。依据正义表达载体上T-DNA区段侧翼序列设计特异性引物和简并引物,获得4个同源序列。对获得的序列进行Blastn分析发现,p69、p148、p225均为载体T-DNA区段一部分,未见大豆基因组序列;P217插入片段的序列分析表明,该序列长863 bp,其中T-DNA左边界序列长143 bp,720 bp为大豆基因组片段,与大豆光系统II类囊体膜蛋白(Thylakoid membrane proteins)的206-926区段同源性为99%,这表明,外源DNA插入了大豆基因组中类囊体膜蛋白编码区的206位。根据分离的序列建立事件特异性定性检测方法,扩增片段大小为277 bp。该事件特异性检测方法具有高度的特异性和良好的灵敏性,为转基因大豆品种LEC1的身份识别提供了有效的方法。     

应用RT-PCR检测水仙潜隐病毒

根据已报道的水仙潜隐病毒(Narcissus latent virus,NLV)外壳蛋白(Coat protein,CP)基因序列,设计一对特异性引物,以提取的水仙样品总RNA为模板进行RT-PCR,并进行特异性和灵敏度测定。结果表明,此法能够从携带NLV的水仙样品中成功扩增出大小约829 bp的特异性目的片段,具有良好的特异性和较高的灵敏度,可有效地应用于水仙样品中NLV的检测。     

定性PCR方法检测转基因玉米MON810转化事件的研究

转基因玉米MON810(Yield Gard R)是孟山都公司通过DNA重组技术和微注射轰击研发的一种具有对欧洲玉米螟(ECB;Ostrinia nublialis)有特殊抗性的转基因玉米品系,目前在世界各地已经得到广泛种植,为加强对该品系玉米的安全管理,本研究旨在建立MON810品系玉米的转化事件特异性定性PCR检测方法。根据MON810的插入序列信息,在3′端的侧翼序列处设计定性PCR检测的引物,检测MON810在其他几种常见转基因作物混合样品的特异性。结果表明,该方法具有很好的特异性。同时检测该引物系统的扩增灵敏度,结果表明,检测引物的灵敏度可达0.1%。建立的MON810特异定性PCR检测方法经全国7家实验室的验证,进一步证实该方法能够特异地检测出样品中的MON810转化事件,检测方法的灵敏度可达0.1%,且检测结果具有良好的可重复性和可重现性。MON810转化事件定性PCR检测方法的建立可满足于抗虫转基因玉米MON810及其衍生品种生物安全管理的需要。     

第二代抗草甘膦大豆PCR检测方法研究

为建立转基因大豆Roundup RReady2Yield"(RR2Y)转化体特异性定性PCR检测方法,以lectin基因作为内参照基因,根据RR2Y外源插入片段5'端与植物基因组连接区序列设计特异性引物,从RR2Y中特异性地扩增出223bp的预期产物.对该方法进行重现性、特异性、灵敏度、稳定性和可重复性测试,结果显示:陔方法能够特异性检测出RR2Y转化体;将100%RR2Y基因组DNA用A3244基因组DNA进行梯度稀释,以100 ng DNA为模板,该方法的检测灵敏度达到0.05%,约为40个起始模板拷贝;以RR2Y DNA含量为10%、1%、0.1%的样品为模板,进行稳定性和可重复性,假阴性率为0.结果表明:此方法适用于RR2Y的转化体特异性定性PCR检测.     

实时定量荧光PCR法检测马铃薯黑胫病菌

马铃薯黑胫病是国内外马铃薯产区发生比较普遍的一种细菌性病害,严重地影响了马铃薯的产量和质量。本研究根据Potato Black Leg序列,设计出马铃薯黑胫病菌特异性的引物,对10种供试菌株进行了实时荧光PCR检测。结果表明,该方法的特异性好,可以将马铃薯黑胫病菌和其它马铃薯常见病害相区分;灵敏度较高,可检测出最低的黑胫病菌浓度为3.6~3.9 cfu.mL-1;而且检测时间仅用4 h,大大缩短了检测周期。该方法可有效地应用于马铃薯黑胫病菌的检测和监控。     

环状等温扩增技术快速检测转基因玉米MON863的研究

采用环状等温扩增技术(Loop-Mediated Isothermal Amplification,LAMP),针对转基因玉米品系MON863中玉米基因组与外源基因结合处设计4条特异性引物,建立MON863的快速检测技术体系,并对时间、温度等反应条件及体系灵敏度、特异性等进行探索。结果表明:该检测体系最适反应温度为63℃,反应时间60 min,灵敏度是常规定性PCR的10倍。该检测方法具有高度的特异性和稳定性,操作方便、简单、省时。     

TaqMan-MGB荧光定量IC/TC-RT-PCR检测菜豆荚斑驳病毒

菜豆荚斑驳病毒(Bean pod mottle virus,BPMV)是我国重要的检疫性有害生物,BPMV传入的风险随大豆进境数量增多而加大。本文针对菜豆荚斑驳病毒,以大豆种子提取液为材料,分别建立了TaqMan-MGB荧光定量IC-RTPCR和TaqMan-MGB荧光定量TC-RT-PCR快速检测方法。根据GenBank公布的BPMV外壳蛋白基因序列,选择其保守区域,设计1对特异性引物和1条TaqMan-MGB探针,测定了TaqMan-MGB荧光定量IC-RT-PCR和TaqMan-MGB荧光定量TC-RT-PCR方法的特异性和灵敏度,并将TaqMan-MGB荧光定量IC-RT-PCR、TaqMan-MGB荧光定量TC-RTPCR、IC-RT-PCR和TC-RT-PCR 4种检测方法的灵敏度进行比较。结果表明:所建立的两种检测方法特异性良好;TCRT-PCR的灵敏度为10-1倍病毒提取液原液;IC-RT-PCR和TaqMan-MGB荧光定量TC-RT-PCR灵敏度相当,为10-3倍病毒提取液原液;TaqMan-MGB荧光定量IC-RT-PCR灵敏度最高,为10-5倍病毒提取液原液,是IC-RT-PCR和TaqMan-MGB荧光定量TC-RT-PCR检测方法的102倍,是TC-RT-PCR检测方法的104倍;两种检测方法均能较好应用于实际大豆样品的检测。本文所建立的TaqMan-MGB荧光定量IC/TC-RT-PCR检测方法利用抗原特异性或试管非特异性捕捉病毒粒子,无需提取RNA,为进境大豆种子上BPMV的检测提供了稳定、快速、简便的技术依据,其较高的灵敏度和特异性具有较好的应用价值。     

应用RT-PCR技术检测马铃薯A病毒

参考GenBank中马铃薯A病毒(potato virus A,PVA)的保守序列,利用Primer6.0引物设计软件设计并合成了一对特异性引物PVAF、PVAR,以此引物利用RT-PCR方法对PVA保守序列基因进行了特异性扩增。结果表明:引物PVAF、PVAR能从已知的感染PVA病毒的植株中扩增出834bp的cDNA特异性片段;该RT-PCR的检测灵敏度为1pg的病毒核酸,特异性强,重复性好,可用于PVA病毒的快速检测。