嗜线虫致病杆菌北京变种质粒形态的研究

嗜线虫致病杆菌是小卷蛾斯氏线虫体内的共生细菌,在实验室条件下延长培养将会出现型态变异,即从野生型的Ⅰ型细胞变为Ⅱ型细胞。本文以嗜线虫致病杆菌北京变种Ⅰ、Ⅱ型菌株为材料,对其质粒形态进行了研究。运用碱裂解法提取质粒,电泳结果发现Ⅰ型菌带型单一,只有一条,分子量大于23kb,命名为pBJ-1。而Ⅱ型菌株除了含有大于23kb的条带外,还有另一条带出现在6kb的位置上,分别命名为pBJ-2和pBJ-3。限制性内切酶处理后,两菌株质粒得到的消化产物有所不同,即嗜线虫致病杆菌北京变种Ⅰ型、Ⅱ型菌株之间的质粒存在差异。本试验还尝试将质粒pBJ-1和pBJ-2分别转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中,并证明这两种质粒上可能含有氨苄青霉素抗性基因和链霉素抗性基因。     

嗜线虫致病杆菌北京变种基因组文库的构建及抗生素活性克隆的筛选

嗜线虫致病杆菌北京变种(Xenorhabdus nematophilavar.pekingensis)是本实验室从北京郊区土壤中分离的小卷蛾斯氏线虫(Steinenema carpocapsae)的共生菌。该菌的代谢产物具有杀虫、抑菌、抗癌等生物活性,其诸多抗生素活性物质有着诱人的开发利用前景[1~4]。因此,对该菌株生物学、遗传学及分子生物学进行研究,可以为更好地开发利用该菌株提供理论依据,并为获得新的功能基因奠定基础。本研究利用试剂盒pWEB::TNCTMCosmid Cloning Kit构建了嗜线虫致病杆菌北京变种的基因组文库。然后利用抑菌活性检测,对抗生素合成基因粘粒克隆的筛选进…     

葡萄根癌病生防菌株E26中可接合转移的遗传因子的检测及功能初步分析

葡萄土壤杆菌E26是一株效果良好的葡萄根癌病生物防治菌株。本研究结合利用Tn5转座子插入突变与生物化学检测手段对E26菌株中的可接合转移的遗传因子进行了检测和功能初步分析。结果显示:野生菌株E26中携带有能够接合转移到其近缘细菌菌株Agrobacterium tumefaciens NTL4的遗传因子,该遗传因子可能是一个功能未知的质粒,该质粒含有可以分解5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷(X-gal)的基因。     

昆虫病原线虫共生细菌发酵液对棉铃虫和菜青虫的口服毒性

研究了昆虫病原线虫共生细菌4个种和1组未定名种28个菌株发酵液对棉铃虫、菜青虫幼虫的致死、抑制生长和拒食作用。嗜线虫致病杆菌对棉铃虫幼虫具有较高的口服毒性，含20％(V／W)嗜线虫致病杆菌CBl2、CB6、CB5、CB28菌株发酵液的人工饲料饲喂棉铃虫初孵幼虫6天后，幼虫校正死亡率分别为97．7％、88．7％、88．4％和88．4％，饲喂棉铃虫3龄幼虫5天后，相对生长抑制率分别为96.4％、95．1％、95．6％和93．8％，上述菌株发酵原液涂抹白菜叶片饲喂5龄棉铃虫幼虫24h后相对拒食率分别为87．6％、83．6％、91．4％和89．8％；光杆状菌CBl、cBl52菌株、嗜线虫致病杆菌CB19菌株和波氏致病杆菌CB32菌株发酵原液涂抹白菜叶片饲喂菜青虫24h后，相对拒食率分别为82．7％、77．2％、75．8％和75．0％。     

不同昆虫病原线虫—共生细菌组合的生化特性研究

本文分别以无菌的小卷蛾斯氏线虫的A24品系线虫与其自身携带的共生细菌菌株和与格氏线虫RS92品系的共生细菌菌株,以及以无菌的嗜菌异小杆线虫的H06品系线虫与其自身携带的共生细菌菌株和与大异小杆线虫HNA品系的共生细菌菌株建立单菌组合;测定了各组合感染期线虫的致病力、干重和体内主要生化物质的含量。结果发现,共生细菌除了对感染期线虫的致病力产生显著影响外,对线虫干重、蛋白质、氨基酸、糖原和脂肪酸等生化物质的含量也有很大的影响。     

不同昆虫病原线虫一共生细菌组合的生化特性研究

本文分别以无菌的小卷蛾斯氏线虫的A24品系线虫与其自身携带的共生细菌菌株和与格氏线虫RS92品系的共生细菌菌株，以及以无菌的嗜菌异小杆线虫的H06品系线虫与其自身携带的共生细菌菌株和与大异小杆线虫HNA品系的共生细菌菌株建立单菌组合；测定了各组合感染期线虫的致病力、干重和体内主要生化物质的含量。结果发现，共生细菌除了对感染期线虫的致病力产生显著影响外，对线虫干重、蛋白质、氨基酸、糖原和脂肪酸等生化物质的含量也有很大的影响。     

嗜线虫致病杆菌对小菜蛾的致死和亚致死效应室内评价

嗜线虫致病杆菌是与昆虫病原线虫共生的细菌,对小菜蛾等多种害虫具有广谱的杀虫活性。为了深入了解该菌的杀虫活性,在室内测定了嗜线虫致病杆菌HB310 ( 简称 Xn HB310)菌株对小菜蛾幼虫的致死和亚致死效应以及持效期。结果表明, Xn HB310菌液对小菜蛾2龄和3龄幼虫72 h的LC50值分别是3.32×104 和8.56×104 CFU/mL,其活性组分主要存在于菌株细胞和经50 kDa超滤膜超滤后的上清液中。此外, Xn HB310菌液对小菜蛾幼虫还表现出明显的拒食活性,其2龄和3龄幼虫的拒食中浓度(AFC50)分别为4.03×105和8.48×105 CFU/mL。将2.24×106 CFU/mL菌液喷施到甘蓝苗上,其在室内的持效期为3~4 d。用亚致死剂量(LC30和LC50)的菌液饲喂小菜蛾2龄幼虫,存活幼虫的生长发育指标、蛹重、雌虫寿命以及成虫产卵量均明显下降,推测这可能导致小菜蛾下一代种群数量减少。研究结果表明,嗜线虫致病杆菌HB310菌株具有开发成为杀虫剂的潜力。     

水稻基腐病细菌和玉米茎腐病细菌的比较研究

 对水稻基腐病细菌(18个菌株)、玉米茎腐病细菌和菊欧氏杆菌的6个致病变种的标准菌株及胡萝卜软腐欧氏杆菌的两个致病变种(Erwinia carotovora pv.carotovora和E.c.pv.atroseptica)进行了58项生化试验的比较。结果水稻菌株在生化性状上与玉米菌株十分相似,最接近菊欧氏杆菌玉米致病变种(E.chrysanthemi pv.zeae),但水稻基腐病细菌在兰色素产生,丙二酸、酒石酸钠利用,产氨和过氧化氢酶活性等项上与玉米致病变种不同。在致病性比较中,水稻菌株比玉米菌株致病力强,寄主范围广。可能是一个独特的致病变种。全细胞蛋白聚丙烯酰胺圆盘电泳的研究表明水稻菌株的蛋白电泳带数与玉米菌株相同,均为16条,但电泳带的迁移率互不相同。血清学研究表明水稻基腐病细菌和玉米致病变种没有共同抗原。     

红掌细菌性疫病病原菌生物学特性研究

红掌细菌性疫病由地毯草黄单胞菌花叶万年青致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.dieffenbachiae)引起。测定了病原菌在PDA、NA、SX、KB、TTC培养基上的生长状况,并初步研究该病的发生规律。试验表明,病菌典型菌株的胞外纤维素酶、淀粉酶、蛋白酶都具水解活性,但活性大小有所差异;在8种抗生素的筛选中,菌株在链霉素、利福平、氨苄青霉素及新露霉素上能生长,而在格丹霉素、卡那霉素、四环素和壮观霉素上不能生长。     

三种斯氏线虫与其共生细菌之间的专化性

在自然条件下,芜菁夜蛾斯氏线虫、长尾斯氏线虫和拟双角斯氏线虫体内携带的共生细菌分别为伯氏致病杆菌、Xenorhabdus ehlersii和X.budapestensis。在一种线虫的生长培养基上分别接种3种致病杆菌,测试对线虫的恢复发育、性比、后代产量及形态大小的影响。结果表明,芜菁夜蛾斯氏线虫与致病杆菌的专化性低于长尾斯氏线虫和拟双角斯氏线虫,在3种致病杆菌上均可发育,但在伯氏致病杆菌上的发育率显著高于X.ehlersii和X.budapestensis。长尾斯氏线虫和拟双角斯氏线虫侵染期幼虫仅在其各自共生细菌X.ehlersii和X.budapestensis上发育。芜菁夜蛾斯氏线虫侵染期幼虫在伯氏致病杆菌上发育后的雌雄比为1.77,而在X.ehlersii和X.budapestensis上仅为0.77和0.74;在伯氏致病杆菌上的产量高于X.ehlersii和X.budapestensis;在伯氏致病杆菌和X.ehlersii上产生的侵染期幼虫长度显著大于X.budapesten-sis。对3种致病杆菌上培养产生的芜菁夜蛾斯氏线虫侵染期幼虫体内携带的细菌进行分离和16S rDNA序列分析,表明芜菁夜蛾斯氏线虫侵染期幼虫除可携带其共生细菌伯氏致病杆菌外,还可携带X.budapestensis,但不能携带X.ehlersii。     

高毒力杀虫细菌嗜线虫致病杆菌CB6菌株的培养基优化

用正交试验法研究了嗜线虫致病杆菌北京变种菌株CB6的营养利用以及培养基成分的改变对产生杀虫活性物质的影响。通过筛选该菌对碳源、氮源以及无机盐的需求,确定了该菌的最佳发酵培养基为(g/L):豆粉40g,蔗糖15g,蛋白胨15g,酵母膏10g,玉米浆5g,NaH2PO41g,NaCl5g,谷氨酸5g。培养液上清液对玉米螟初孵幼虫的体重抑制率为90 81%,比基础培养基的杀虫活性提高了46.5%。     

拒食蛋白XnAFP2三个结构域片段的表达及其生物活性分析

嗜线虫致病杆菌北京变种Xenorhabdus nematophila var. pekingensis CB6菌株产生的蛋白XnAFP2对多种昆虫有拒食活性。生物信息学分析表明,XnAFP2包含DomainⅠ、DomainⅡ和DomainⅢ3个功能结构域。为确定其主效活性区域,分别对3个结构域进行了克隆、表达和生物活性测定。结果表明,3个蛋白片段对棉铃虫Helicoverpa armigera3龄幼虫的生长抑制率分别为17.4%、39.8%和20.2%,对玉米螟Ostrinia furnacalis3龄幼虫的生长抑制率分别为20.2%3、8.6%和21.7%,对小菜蛾Plutella xylostella3龄幼虫的非选择性拒食率分别为25.7%、44.1%和26.8%。研究结果表明,DomainⅡ是拒食蛋白XnAFP2的主效活性区域。     

昆虫病原线虫共生菌BP品系杀虫毒素基因xptA2的杀虫活性分析

为进一步研究嗜线虫致病杆菌Xenorhabdus nematophila杀虫毒素基因簇中各基因的功能,从BP品系的粘粒文库中筛选出一个粘粒克隆XnBP83包含全部的xpt基因,对该粘粒克隆进一步亚克隆得到一个亚克隆菌株Sub9.0,只有一个xpt基因xptA2.以Sub9.0为研究对象,对xptA2的功能作了进一步研究.结果表明,xptA2基因的表达产物与其它xpt基因的表达产物物理混合后无明显增效作用,而将xptA2转入缺失xptA2的粘粒克隆XnBP6和XnBP203后,也同样无明显增效作用.对xptA2的序列分析发现,BP品系的xptA2预测氨基酸序列与已发表序列相比明显存在2个变异区.进一步BLAST分析发现,这2个变异区同昆虫病原线虫共生菌中与口服毒性有关的杀虫毒素蛋白具有同源性.     

三株昆虫病原线虫共生菌胞外产物的抑菌活性

采用生长速率法、孢子萌发法、活体组织法和盆栽试验对3株昆虫病原线虫共生菌胞外产物甲醇提取物的抑菌活性进行了系统研究.结果表明,3个菌株甲醇提取物对番茄灰霉病菌、辣椒疫霉病菌、油菜菌核病菌的菌丝生长,对番茄灰霉病菌、玉米大斑病菌、稻瘟病菌、白菜黑斑病菌、杨树溃疡病菌、小麦根腐病菌的孢子萌发均有很强抑制作用.其中嗜线虫致病杆菌YL001菌株对辣椒疫霉病菌菌丝生长的抑制作用最强,EC50为35.11mg/L;伯氏致病杆菌YL002菌株对番茄灰霉病菌菌丝生长的抑制作用最强,EC50为 42.16mg/L;嗜线虫致病杆菌TB菌株对油菜菌核病菌菌丝生长的抑制作用最强,EC50为18.95mg/L.3个菌株甲醇提取物对玉米大斑病菌孢子萌发都有很强的抑制作用,EC50分别为28.03、36.77和26.40mg/L.3个菌株甲醇提取物在1000mg/L浓度下,对离体番茄果实灰霉病的治疗和保护效果均在70%以上;对盆栽番茄灰霉病和辣椒疫霉病的治疗和保护效果均在65%以上.     

甲基营养型芽胞杆菌AL7对棉花黄萎病的盆栽防治效果及定殖能力

为了探明甲基营养型芽胞杆菌AL7对棉花黄萎病的防治效果及其定殖能力,本文利用盆栽接种试验研究了菌株AL7对棉花黄萎病的防治效果;将带四环素抗性的pGFP78质粒转入到菌株AL7中,分析了菌株AL7在棉花根围土壤中、根部组织内的定殖情况。结果表明,菌株AL7对棉花黄萎病的盆栽防治效果为77.1%。pGFP78质粒转入后对菌株AL7的生长没有明显影响,仍具有游动性和产生物膜。定殖检测结果表明,菌株AL7能够在棉花根围土壤中及根系组织内长期定殖,接种5 d时定殖数量最高,达6×10~6cfu/g土,接种80 d后根围土壤中的定殖数量仍维持在2×10~6 cfu/g,根系组织内的定殖量为6×10~4 cfu/g。利用激光共聚焦显微镜观察验证,接种7 d后菌株AL7已经进入到棉花根部的中柱鞘细胞,能够在棉花根内大量定殖。     

Genetics of spinosad resistance in a multi-resistant field-selected population of Plutella xylostella

Resistance to the bacteria-derived insecticides spinosad (Conserve), abamectin (Vertimec), Bacillus thuringiensis var kurstaki (Btk) (Dipel), B thuringiensis var aizawai (Bta) (Xentari), B thuringiensis crystal endotoxins Cry1Ac and Cry1Ca, and to the synthetic insecticide fipronil was estimated in a freshly-collected field population (CH1 strain) of Plutella xylostella (L) from the Cameron Highlands, Malaysia. Laboratory bioassays at G1 indicated significant levels of resistance to spinosad, abamectin, Cry1Ac, Btk, Cry1Ca, fipronil and Bta when compared with a laboratory insecticide-susceptible population. Logit regression analysis of F1 reciprocal crosses indicated that resistance to spinosad in the CH1 population was inherited as a co-dominant trait. At the highest dose of spinosad tested, resistance was close to completely recessive, while at the lowest dose it was incompletely dominant. A direct test of monogenic inheritance based on a back-cross of F1 progeny with CH1 suggested that resistance to spinosad was controlled by a single locus.     

甲霜灵对烟草黑胫病菌细胞膜透性的影响

为阐明烟草黑胫病菌抗甲霜灵的生理机制,研究了不同浓度甲霜灵处理540 min内敏感、低抗和高抗菌株相对渗率的变化情况,结果表明:甲霜灵能损害烟草黑胫病菌的细胞膜,使膜透性不断增大;其对敏感菌株ZC002和低抗菌株10M-006细胞膜透性的影响速度和程度比较接近,都随处理浓度(0.1~100.0 μg/mL)的提高而不断增加;对高抗菌株10M-004细胞膜透性的影响速度最慢,程度最低,且随处理浓度(50.0~100.0 μg/mL)的提高而增加。高抗菌株适应甲霜灵的能力明显强于敏感菌株和低抗菌株,该适应能力随甲霜灵浓度的提高而减弱。     

Enhanced colonization and pathogenicity of Erwinia amylovora strains transformed with the near‐ubiquitous pEA29 plasmid on pear and apple

Three plasmid‐free strains of Erwinia amylovora, the causal agent of fire blight disease of pome trees, one from Iran, one from Egypt and one from Spain, were transformed with the near‐ubiquitous nonconjugative pEA29 plasmid from a wild‐type strain and characterized. The plasmid‐deficient strains were levan‐ and slime‐positive, motile, chemotaxis‐positive, induced HR on Nicotiana tabacum var. xanthi but produced several‐fold less amylovoran and were weakly pathogenic on pear slices and apple seedlings compared to plasmid‐bearing wild‐type strains. When inoculated onto wounded young apple (cv. Royal Gala) leaves, the plasmid‐free strains labelled with green fluorescent protein gene (gfp) were mainly restricted to the inoculation site at the leaf tips, in contrast to the plasmid‐carrying wild‐type strains that moved into the midrib xylem vessel and colonized the adjacent parenchyma cells. Upon introduction of the transposon‐labelled pEA29 plasmid, amylovoran production, degree of oozing and tissue necrosis on pear slices were significantly elevated in all three strains, whilst the levels of levan and levansucrase declined. Only the strains from Iran and Egypt gained the ability to invade and colonize the young apple leaves following the introduction of pEA29. It is concluded that acquisition of the nonconjugative near‐ubiquitous plasmid may not necessarily confer increasing pathogenicity in all bacterial strains.     

烟草黑胫病菌抗甲霜灵突变体的诱导及其适合度研究

室内离体条件下采用药剂诱导法,获得了11个烟草黑胫病菌抗甲霜灵突变体;检测了所有抗药突变体的抗药稳定性及抗性水平;比较了3个低抗和1个高抗突变体的适合度。结果表明:在2~20 μg/mL范围内,抗药突变体的发生频率随甲霜灵诱导浓度的增加而提高;所有抗药突变体的抗药性都能稳定遗传;11个抗药突变体中,10个为低抗突变体(抗性水平3.55~13.9倍,平均8.60倍),1个为高抗突变体(抗性水平510倍);低抗菌株20M-001、10M-003、10M-006和高抗菌株10M-004的适合度指数分别为0.56、0.38、0.38和0.87;抗药突变体的适合度指数与抗性水平不相关。