两株芽孢杆菌的鉴定及淀粉酶基因的克隆

对分离得到的两个菌株(B.H和B.M)进行鉴定,并对它们在芽孢杆菌培养基和淀粉富集培养基上的形态进行观察,通过对其16S rDNA序列的分析,构建系统进化树,确定B.H为枯草芽孢杆菌,B.M为解淀粉芽孢杆菌.根据已报道的枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌淀粉酶基因保守区域设计引物,分别以两个菌株的基因组DNA为模板,采用PC...     

一个绿竹MADS-box基因的克隆与序列分析

MADS-box基因编码的转录因子在植物花器官发育过程中起着重要作用.采用RT-PCR技术,从绿竹(Bambusa oldhamii L.)中分离到一个MADS-box基因,命名为BOMADS1(GenBank登记号:EF517293).BOMADS1编码区cDNA全长723 bp;编码区共编码240个氨基酸,具有典型的植物MADS-box基因结构,其编码肽链包含了MADS区、K区、Ⅰ区和C末端.序列分析结果表明,BOMADS1编码的蛋白与其它植物的MADS-box蛋白有着较高的一致性,其中与石刁柏(Asparagus officinalis L.)的AOM3高达87%.系统进化树分析表明BOMADS1基因属于E类功能基因.     

宇佐美曲霉植酸酶phy A基因的克隆

植酸酶是催化植酸及其盐类物质水解成肌醇和磷酸的一类酶的总称,用其作为动物饲料添加剂既可以达到提高磷利用率的目的,又可以降低环境中的磷污染。真正具有开发价值的是利用微生物生产植酸酶。直接以宇佐美曲霉菌株2418基因组DNA为模板,对植酸酶基因phyA的成熟肽(分子长度为1 347 bp)进行了PCR扩增,再将PCR产物克隆入pBS-T载体,经DNA测序鉴定,与已发表的植酸酶基因同源性达到99%以上,这为进一步获得大量、高活性植酸酶以及研究和开发新型微生态制剂打下了基础。     

甘薯IbCAF1基因的克隆及耐盐性、抗旱性鉴定

CAF1 (CCR4-associated factor 1)基因在植物发育、抗病等方面发挥着重要的作用。本研究根据前期获得的差异表达EST序列,克隆得到甘薯IbCAF1基因。IbCAF1基因的开放阅读框(open reading frame, ORF)长度为846 bp,编码281个氨基酸,分子量为32.13 kD,等电点为4.83。氨基酸序列比对和系统进化树分析表明, IbCAF1与甘薯近缘野生种Ipomoeatriloba(2x)同源蛋白ItlCAF1有较高的同源性,序列一致性为96.8%。IbCAF1基因受到NaCl、PEG、ABA和H₂O₂的诱导表达。利用根癌农杆菌介导法将IbCAF1基因转入烟草,过表达IbCAF1基因显著提高了转基因烟草植株的耐盐性和抗旱性。在200 mmol L^-1 NaCl和10%PEG-6000的胁迫下, IbCAF1基因的过表达显著上调了转基因烟草植株中活性氧清除系统和脯氨酸合成相关基因的表达,增加了SOD活性、POD活性、脯氨酸含量,降低了H₂O_2<...     

大豆Gm TIP1;1基因的克隆与表达分析

利用RT-PCR方法从大豆根部组织获得Glyma03g34310.1开放阅读框(ORF)全长, 经测序验证、Blast比对与同源性分析发现该序列编码的蛋白质与其他植物的TIP1;1蛋白具有较高的相似性, 故命名为GmTIP1;1基因(GenBank登录号为AK285481), 该基因ORF长753 bp, 编码1个包含250个氨基酸的蛋白, 在ORF内部第381个核苷酸处含有1个94 bp的内含子, 符合↓GT--AG↓的剪接方式; 系统进化树分析发现Gm TIP1;1聚类到豆科植物分支, 其他不同科的植物也有规律地聚到了不同分支, 推测该蛋白氨基酸序列可以作为植物分类的依据; 半定量RT-PCR结果表明该基因在大豆的不同器官、不同器官的不同发育阶段均具较高且同等的表达水平, 暗示该基因在植物的整个发育进程中均具重要作用; 在盐胁迫的不同时间点其表达量有下降的趋势, 但仍然保持较高的表达水平; 以pYES2为酵母表达载体, 转化酿酒酵母INVSc1菌株, 获得重组酵母INVSc1 (pYES2-GmTIP1;1), 转化菌株在盐胁迫下的存活率明显高于对照INVSc1 (pYES2), 而在干旱胁迫下则没有显著差异, 表明该基因的表达能有效地提高酵母的耐盐性。     

无毒基因在稻瘟病菌株007中的克隆鉴定及表达分析

为了能明确稻瘟病国际标准菌株race 007中包含的无毒基因及其可能的主效无毒基因,本研究设计5个常见的无毒基因特异性引物进行克隆鉴定,并分别检测液体培养条件下和侵染水稻过程中race 007菌株中5个无毒基因的表达情况。本研究发现,稻瘟病菌株race 007中含有PWL2、AvrPiz-t、Avr-pik、Avr-pita、ACE1 5个无毒基因,克隆鉴定的结果表明这5个无毒基因的变异不大。相比较于液体培养条件下,在侵染水稻的过程中,PWL2表达上调,ACE1、AvrPiz-t、Avr-Pik表达基本不变,而Avr-Pita基因表达出现了下调。因此PWL2基因表达变化较为显著,本研究进一步对PWL2启动子区域进行分析,结果表明该PWL2基因启动子区域存在着一些顺式作用元件来影响PWL2基因的表达。本研究表明,稻瘟病菌race 007含有5种常见的无毒基因且序列变异不大,而且PWL2基因的表达是受到调控并可能发挥主要的致病作用。     

马铃薯StSOD1基因酵母双杂交诱饵载体的构建及鉴定

为了筛选与马铃薯超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)基因StSOD1作用的上游蛋白,构建其酵母双杂交诱饵重组载体。本研究利用PCR方法扩增得到马铃薯StSOD1的基因片段,通过与pMD-T18连接构建克隆载体,经验证构建成功后,与诱饵载体pGBKT7连接构建诱饵重组载体,经双酶切以及测序检测验证重组载体构建成功后,通过PEG/Li Ac法将诱饵载体pGBKT7-StSOD1与空载体pGBKT7分别转化到酵母AH109感受态细胞中,检测其是否有自激活作用和对酵母菌株的毒性作用。结果表明:经PCR扩增后得到了StSOD1基因,成功构建了诱饵重组载体pGBKT7-St SOD1,并且此诱饵载体无自激活活性和对酵母菌株的毒性作用。此研究结果可进一步为筛选与StSOD1互作的蛋白质及功能研究提供科学依据。     

大豆GmbZIP27基因的克隆及表达分析

bZIP蛋白是一类调控植物生长发育和抗性的转录因子。为探究大豆bZIP的生物学功能,利用PCR方法从大豆中克隆到1个bZIP基因GmbZIP27,对该基因进行生物信息学、表达模式和结合特异性分析。结果表明,GmbZIP27基因的开放阅读框长为825 bp,编码274个氨基酸,蛋白质分子质量为30.426 kD,等电点为8.54,含组氨酸和丝氨酸活性位点,为不稳定疏水蛋白,二级结构以α-螺旋和β-折叠为主。亚细胞定位分析发现GmbZIP27定位于细胞核。酵母单杂交实验表明GmbZIP27不能结合GmFBX176启动子中的ABRE元件。组织特异性表达模式表明,GmbZIP27在大豆组织中的相对表达量由高到低依次为子叶、根、叶和茎,推测GmbZIP27基因参与调控大豆的生长发育过程。本研究为深入解析bZIP转录因子在大豆发育及非生物胁迫应答中的功能提供一定理论依据。     

花生中DREB类转录因子PNDREB1的克隆及鉴定

脱水响应元件结合因子(DREB)是一类对多个抗逆相关基因表达起调控作用的植物特有的转录因子,在植物抗逆能力综合改良方面具有重要作用。本研究通过筛选花生未成熟种子的cDNA文库,分离到一个DREB类基因——PNDREB1(FM955398)。该基因序列长度为687 bp,推测编码蛋白含有229个氨基酸残基,相对分子量为24.7 kD,理论等电点为5.97,与其他物种中该类转录因子序列同源性较高。利用酵母单杂交系统,对花生PNDREB1与DRE元件的特异识别和结合能力及其C-末端转录激活活性进行检测,显示,转入含有该基因及阳性对照基因的载体均可使酵母菌株正常生长,且具有显色反应,而转入空载体的酵母菌株不能生长,证明基因PNDREB1中的AP2结构域具有和DRE元件特异性结合的能力;同时,只有转入含有该基因C-末端片段及阳性对照基因的载体可使酵母菌株正常生长,并具有显色反应,而转入空载体的酵母菌株不能生长,说明其C-末端片段具有转录激活活性,该基因为DREB类转录因子。基因表达模式分析显示,PNDREB1为组成型表达,且被低温强烈、迅速诱导表达,并对干旱胁迫也有一定程度的响应,但对高盐和ABA处理没有响应。     

大曲中高产糖化酶菌株的筛选及产酶条件优化

为了获得高产糖化酶的菌株并用于强化大曲的生产,以张弓老酒大曲为试材,通过透明圈法进行初筛以及测酶活法进行复筛,从中筛选了一株高产糖化酶的菌株WD11,其初始酶活为101 U/mL,然后通过16S rDNA序列同源性分析可以初步将该菌株归于芽孢杆菌属。在此基础上,又对其进行生理生化特性研究分析,结果表明甲基红试验、V.P试验、硝酸盐及鸟氨酸反应显阳性,赖氨酸呈阴性,故可以确定菌株WD11为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。后采用正交试验法进行了产酶条件优化,结果表明:在固体发酵培养基上,当以高粱面为最适碳源(质量分数2%),以蛋白胨为最适氮源(质量分数4%),接种量为6%时,其糖化酶活可达160 U/mL,是初始酶活的1.6倍,预期可以提高白酒的出酒率。     

绿竹咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶基因的克隆与分析

咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶（CCoAOMT）是木质素生物合成过程中的一个关键酶类。采用RT-PCR及RACE方法从绿竹中分离了CCoAOMT家族的一个基因,命名为BoCCoAOMT1（GenBank注册号为EF028662）。BoCCoAOMT1的cDNA全长873bp,含有一个780bp的读码框,编码一个259aa的蛋白,分子量约为29kD。序列分析结果表明,BoCCoAOMT1的编码肽链含有CCoAOMT类基因所有的保守序列元件,与禾本科植物水稻的CCoAOMT类基因有着很高的一致性,达到90.0%。系统进化树分析表明,BoC-CoAOMT1与水稻的CCoAOMT亲缘关系较近。     

小麦GASA基因家族生物信息学分析

赤霉素调节的GASA（Gibberellic Acid-Stimulated in Arabidopsis）基因家族是植物特有的转录因子家族,在调控植物生长发育过程中起重要作用。关于小麦GASA基因家族全基因组分析的研究尚未见报道。为进一步探讨小麦GASA基因的功能,通过对小麦最新基因组数据进行分析,获得了35个TaGASA基因,命名为TaGASAs,根据染色体编号排列为TaGASA1~TaGASA35。结合公布的小麦品种Chinese Spring的基因组数据,采用生物信息学方法对其基因结构、染色体分布、蛋白结构、系统进化及表达谱进行了分析。结果表明,35个小麦TaGASA基因分布于除3A、4A、3B、3D染色体外的其余17条染色体上,基因编码长度为78~264个氨基酸的蛋白质,基因外显子数量从2个到7个不等;串联重复片段分析结果表明,片段复制和串联重复是小麦TaGASA家族基因扩张的主要模式;小麦TaGASA蛋白进化树和7种作物GASA基因的系统进化树表明,GASA基因分为4个类别,同一类之间的结构较为相似;小麦35个TaGASA基因家族成员含有10个motif,推测小麦TaGASA基因家族应都含有motif1、motif2和motif3。在13个组织器官中都检测到了35个TaGASA基因的转录本,不同组织器官中TaGASA基因的表达存在明显差异。     

花生膜联蛋白基因AhAnn1的克隆与表达分析

为挖掘花生抗逆境胁迫相关基因,克隆抗逆相关膜联蛋白Annexin基因,以花生品种花育25号为试验材料,从已知抑制消减杂交文库中获得花生膜联蛋白Annexin类似基因片段,通过RACE技术获得Annexin基因5'-RACE片段。对5'-RACE序列和抑制消减杂交文库中已知基因片段进行拼接,设计特异引物通过逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增得到该基因,命名为AhAnn1。结果表明,AhAnn1全长为1 277 bp,开放阅读框为951 bp。根据编码区预测AhAnn1编码一条316个氨基酸组成的多肽,预测分子量为36.10 k Da,等电点为7.07。预测该基因编码的蛋白含有膜联蛋白Annexin保守结构域,定位于细胞质中。蛋白序列多重比对和系统发育分析表明,花生与大豆、苜蓿、鹰嘴豆等豆科植物中的膜联蛋白相似性最高,亲缘关系最近。荧光实时定量PCR结果显示,AhAnn1在根系和叶片中的表达量随干旱胁迫程度的增加而增加。由此推测AhAnn1是一种干旱胁迫应答基因,在花生逆境调控中发挥作用。结果为进一步研究花生AhAnn1基因的功能和花生抗逆境胁迫相关分子机理提供了理论基础。     

陆地棉油菜素内酯信号基因GhBES1家族的鉴定及表达分析

BES1基因是植物激素油菜素内酯信号转导过程中的重要转录因子,为了解陆地棉油菜素内酯信号基因Gh BESI家族,通过对陆地棉异源四倍体标准系TM-1基因组数据库的全面分析和鉴定,获得21个GhBES1基因,这些基因分布在不同的亚基因组,有9对基因在A亚组和D亚组上存在对应关系,AD亚组对应基因序列一致性高于95%。根据进化分析,21个GhBES1基因分为4个亚家族,除了亚家族Ⅲ,其他3个亚家族在拟南芥中均有对应基因;除了亚家族Ⅳ基因和亚家族Ⅱ中GhBES1-1基因外,其他GhBES1基因均有2个外显子。亚细胞定位结果表明,21个GhBES1蛋白主要定位到细胞核、细胞质等部位,其中7对基因的蛋白亚细胞定位完全一致。GhBES1基因在根、茎、叶、顶端分生组织中均有表达,但不同亚家族基因在不同组织中的表达水平存在差异。研究结果为棉花GhBES1基因家族功能的深入研究奠定了基础。     

Aspergillus niger 乳糖酶基因的克隆及序列分析

利用PCR及RT-PCR技术从黑曲霉(Aspergillus niger)菌株DL116中克隆到了乳糖酶基因组DNA，cDNA序列(GENBANK ACCESSION No.EF103141)。序列分析表明，乳糖酶基因组DNA序列长3368bp，其中含有8个内含子，cDNA编码区长2967bp，共编码988个氨基酸，氨基酸序列中共含有12个潜在的糖基化位点。并将此基因与不同来源的乳糖酶基因进行了同源性比较     

木糖还原酶基因克隆及重组表达载体的构建

木糖还原酶是木糖醇生物合成的关键酶,催化木糖合成木糖醇。以实验室筛选并经分子生物学鉴定为季也蒙毕赤酵母的木糖还原酶基因为基础,以酵母表达载体pPICZαA成功构建了含有木糖还原酶的重组表达载体pPICZαA-xyl,为进一步研究真核表达木糖还原酶和木糖醇的生产奠定基础。     

植酸酶基因PhyB1的克隆及序列分析

为了进一步研究多种植酸酶之间的相互作用,利用PCR技术,从黑曲霉WP1中克隆出植酸酶PhyB基因,该基因长1 560 bp,含有3段内含子,共编码460个氨基酸,与已报道的ALKO243的植酸酶Aph基因(GeneBank Acces-sion:L02420)相比较,编码的氨基酸序列同源性为99.13%,因此将其命名为PhyB1。该基因含有植酸酶保守序列“RHGXRXP”和“HD”。黑曲霉WP1植酸酶PhyB1基因序列已在国际基因库中注册,注册号为:DQ836360。     

重组葡萄糖氧化酶毕赤酵母高产菌株的高通量快速筛选方法

根据葡萄糖氧化酶的反应原理和毕赤酵母诱导表达的机制,本研究建立了葡萄糖氧化酶毕赤酵母表达菌株筛选方法。首先在MM平板中诱导重组子表达葡萄糖氧化酶,然后添加显色液,阳性酵母菌株周围可见显色圈。经过与传统液体培养筛选方法的比较验证,结果表明,该方法灵敏度高,稳定性和重复性好,筛选结果与传统方法一致。当葡萄糖氧化酶活力介于0–0.1 U/ml的范围内,显色圈的绝对面积与酶活力相关系数可达0.63。该平板筛选方法可以从大量毕赤酵母重组子中快速筛选出表达葡萄糖氧化酶的阳性菌株,并可方便地判断出各菌株之间表达水平的差异。同时,该方法也可为筛选其他重组酶毕赤酵母菌株提供参考。