黄瓜、西瓜、南瓜EIN3基因片段的克隆与序列分析

EIN3（Ethylene insensitive 3）是位于细胞核的核蛋白为乙烯信号转导的下游调控基因,根据GenBank所报道的植物EIN3基因mRNA的保守序列设计两个引物,以黄瓜、西瓜、南瓜总DNA为模板PCR扩增到3个725bp的基因片段，将片段序列在NCBI数据库中Blastn同源搜寻，显示151条有同源性的序列全部是EIN3基因，因此推断克隆的3个片段均为EIN3基因家族成员。NCBI网站的ORF Finder找到正确的开放式阅读框，翻译成为氨基酸序列，对CsEIN3、ClEIN3及CmEIN3氨基酸序列在NCBI网站进行Blastp比对, 在大分子结构数据库MMDB (Molecular Modelling Database) 搜索,3个推测蛋白保守结构域三级结构与拟南芥EIN3的DNA结合域(MMDB: 30598 PDB: 1WIJ )完全相同，系统进化分析表明，黄瓜、西瓜、南瓜与双子叶植物甜瓜、绿豆、蒺藜状苜蓿、烟草、番茄、拟南芥及单子叶水稻、桃红蝴蝶兰等的EIN3家族成员都有较高的相似性。     

黄瓜、甜瓜和西瓜MLO基因家族的比较基因组学分析

MLO基因是植物特有的一类基因家族,在调控植物抵抗生物和非生物胁迫方面起着重要作用。为了揭示葫芦科作物MLO基因的遗传变异及系统发育关系,本文以黄瓜、甜瓜和西瓜基因组数据为基础,利用生物信息学方法对其MLO基因家族进行鉴定与分析。结果发现,黄瓜、甜瓜和西瓜基因组中共含有42个MLO基因家族成员,每一个物种均含有14个成员,且保守性强;系统发育关系揭示了这些成员在黄瓜、甜瓜和西瓜基因组中并不呈现一一对应关系,表明MLO型基因在这3种植物分化之后分别发生了扩展和丢失;进一步将其与模式植物拟南芥、番茄、豌豆MLO型白粉病基因进行聚类分析:一方面,借助于拟南芥MLO基因的分类标准,揭示了在黄瓜、甜瓜和西瓜基因组中也存在双子叶植物MLO型白粉病基因的特异区组,他们各自至少包含3个候选的白粉病基因,序列比对进一步发现这些基因均具有MLO型白粉病基因的典型结构特征,如7个跨膜结构域、钙调蛋白结合区以及两个缩氨酸区域(I和II);另一方面,大部分区组中包含的MLO基因均来源于拟南芥和黄瓜、甜瓜和西瓜MLO基因家族的成员,表明了MLO基因家族在拟南芥和葫芦科作物分化之前就已经存在。EST表达分析表明MLO基因广泛地参与到黄瓜、甜瓜和西瓜器官的营养生长和生殖生长。研究结果为揭示黄瓜、甜瓜和西瓜MLO基因的进化关系、功能及克隆表达分析奠定了基础。     

黄瓜生长素受体同源基因的克隆、序列特征及表达模式分析

为了解生长素受体及其信号通路在黄瓜(Cucumis sativus L.)中的调控机制和生物学功能,寻找提高产量的新途径并指导农业生产,我们以拟南芥(Aabidopsis)生长素受体家族AtTIR1/AFBs基因序列为参照进行比对,从黄瓜全基因组数据库中筛选出2条具有很高同源性的基因序列,分别命名为Cs TIR和CsAFB.克隆和测定了这2个基因的cDNA序列,构建了过表达载体,拟在黄瓜中开展反向遗传学研究.基因序列提交至GenBank并得到收录,其中CsTIR的登录号KC414935.1,CsAFB登录号KC414934.1.采用生物信息学方法对CsTIR和CsAFB蛋白的基本理化性质、功能结构域进行初步预测,对其在物种间的保守性进行进化分析,推测它们可能是黄瓜的生长素受体.采用semi-q RT-PCR分析了这两个基因的时空表达模式,发现10d黄瓜幼苗中CsAFB基因的表达量在根和叶中比在茎中高,CsTIR基因在茎中几乎检测不到表达;70d成年黄瓜各组织都有CsTIR和CsAFB表达,无明显组织特异性.本研究为寻找黄瓜生长素受体提供了实验依据,为进一步研究生长素信号通路在黄瓜中的功能及调控机理提供了基础资料.     

壳聚糖酶基因的克隆与序列分析

本研究采用一对引物从巨大芽孢杆菌BS-0409中成功地克隆了壳聚糖酶基因（Csn） 全基因序列,大小为516bp,将其在NCBI网站上用BLAST程序进行在线检索分析,结果与多种芽孢杆菌同源性均为96%。同时,利用DNAMAN软件比较巨大芽孢杆菌BS-0409与其它13种不同细菌Csn编码基因的氨基酸序列,结果显示不同细菌Csn氨基酸序列之间有比较高的同源性,且与多种芽孢杆菌具有较高的同源性。     

印度南瓜Na+/H+逆向转运蛋白基因CmaSOS1的克隆与表达分析

Na⁺/H⁺逆向转运蛋白(SOS1)是植物耐盐的关键因子之一,在植物响应非生物胁迫过程中发挥着重要作用。为解析印度南瓜SOS1基因的序列特征和功能,利用生物信息学和分子生物学方法对其进行研究。结果表明,克隆获得印度南瓜SOS1基因cDNA全长序列,命名为CmaSOS1,GenBank登录号:NW_019272028。序列分析表明,CmaSOS1基因的cDNA全长3 940 bp,包含一个3 429 bp的开放阅读框架,编码1 142个氨基酸。CmaSOS1基因含有23个外显子和22个内含子,全长46 314 bp。CmaSOS1蛋白的分子量为126.7 kDa,理论等电点为5.92,包含12个跨膜结构区域,具有一个Na_H_Exchanger superfamily结构域和一个CAP_ED superfamily结构域;CmaSOS1蛋白属于疏水性稳定蛋白,二级结构元件多为无规卷曲和α-螺旋。CmaSOS1蛋白与葫芦科的中国南瓜、西葫芦、甜瓜、黄瓜和苦瓜Na⁺/H⁺逆向转运蛋白的同源性较高,序列一致性分别为98%、98%、90%、89%和89%。实时荧光定量PCR分析表明,CmaSOS1基因在印度南瓜的根和叶中表达量较高,在茎、花、果实中的表达量较低;该基因受NaCl和聚乙二醇(PEG)诱导后均呈上调表达,推测CmaSOS1基因可能在印度南瓜抵御盐分胁迫和干旱胁迫过程中发挥重要作用。本研究为进一步揭示CmSOS1在非生物胁迫下的功能奠定了基础。     

印度南瓜延伸因子基因CmEF1a的克隆与分析

真核生物延伸因子(EF1a)是一种重要的内参基因,广泛应用于RT-qPCR中。为获得印度南瓜EF1a基因,开发合适的荧光定量PCR引物,本研究通过转录组测序和RT-PCR方法获得了1条长度为1 701 bp的cDNA,命名为CmEF1a,GeneBank登录号:MH310443。结果表明,CmEF1a包含1个ORF,大小为1 344 bp,编码447个氨基酸,理论分子大小约为49.30 kD, 蛋白质等电点为9.14。Wolf Psort分析发现, CmEF1a蛋白亚细胞定位于细胞质基质中;Motif Scan分析显示, CmEF1a蛋白质的氨基酸序列2~432位和322~430位分别为EF1结构域和EF1的C端保守结构域。同源性分析表明, CmEF1a基因编码的蛋白质与同为葫芦科的中国南瓜、甜瓜和黄瓜同源蛋白的相似性达到99%,具有高度的保守性。在此基础上设计了1对RT-qPCR引物, 该引物具有较高的特异性和扩增效率, 在印度南瓜不同组织和不同胁迫处理下均能稳定表达, 适合作为内参基因应用于印度南瓜基因表达研究。本研究结果为印度南瓜重要功能基因的表达分析及相关分子调控机制的研究奠定了一定的理论基础。     

黄瓜抗西瓜花叶病毒性状的序列特征性扩增区域(SCAR)标记

以抗西瓜花叶病毒 (Watermelon mosaic virus, WMV)的黄瓜（Cucumis sativus）品种秋棚和感该病毒的欧洲八号为亲本,构建了120个F6重组自交系群体。根据苗期抗病接种鉴定结果进行遗传分析,发现黄瓜抗WMV的基因是由隐性单基因控制。利用集团分离分析法和相关分子标记技术,获得的特异片段E-ACT/M-CTT-427与WMV的抗性基因连锁,连锁距离为8 cM。双亲差异片段测序结果显示感病亲本目标片段存在6个T碱基的缺失。根据测序结果设计了1对与目的基因遗传距离为8 cM的序列特征性扩增区域(SCAR)引物,该引物可用于黄瓜抗WMV病毒的分子标记辅助育种。     

宏基因组漆酶基因片段的克隆与分析

漆酶(Laccase,EC1.10.3.2)是一种含铜的多酚氧化酶,能够有效降解木质素物质,在环境碳素循环中占有重要的地位。近年来以环境宏基因组DNA为模板,设计简并引物及PCR扩增方法研究环境微生物基因来监测环境微生物已成为土壤微生物多样性研究的新方法[1]。如Luis等[2]通过对森林土壤微生物中漆酶基因的研究来监测该地区的微生物多样性;Lyons等[3]通过对高盐度沼泽地土壤微生物中漆酶基因的研究来监测该地区的微生物多样性;张桂敏等[4]通过对土壤微生物中木聚糖酶基因的研究来监测该地区的微生物多样性。但是,国内尚无研究环境微生物漆酶基因多样性及监测环境微生物功能的报道。同时漆酶在化工染料     

白沙蒿肌动蛋白基因核心片段的克隆和序列分析

本研究以荒漠植物白沙蒿总RNA为模板,运用RT-PCR方法扩增出肌动蛋白基因核心序列。将获得的片段克隆到T载体后进行测序,序列分析表明：白沙蒿肌动蛋白基因核心片段长599bp,编码198个氨基酸。将该序列在GenBank中注册,并与多种植物肌动蛋白序列进行同源性比较,发现该片段的核酸序列同源性在75％以上,氨基酸序列同源性在85％以上,具有高度保守性。     

山药PAL基因全长cDNA序列的克隆、表达与分析

为了阐明苯丙氨酸解氨酶(PAL,EC4.3.1.5)基因在山药地下块茎酚类物质积累过程中的分子机理,本研究运用普通PCR、RACE和TAIL-PCR技术从大薯(Dioscorea alataL.)’Zixiao’地下块茎中克隆到同一个PAL基因的3个片段,即长度分别为1 145bp、1 151bp和424bp的中间片段、3’端和5’端的cDNA序列;将3段cDNA序列拼接后获得大小为2 376bp的PAL基因全长cDNA序列,该序列含有一个1986bp的最大开放阅读框(ORF),一个28bp的5’端非翻译区,一个362bp含25 nt的Poly(A+)尾的3’端非翻译区,最大ORF可推测编码一个包括PAL酶活性中心的特征序列(GTITASGDLVPLSYIA)在内的661个氨基酸的多肽,分子量为71.974kDa,等电点6.310;大薯地下块茎的PAL基因分别在核苷酸与氨基酸水平上和GenBank中所选已知其他物种的同源性为73%~77%和76%~82%,说明PAL基因在系统进化上相对保守;RT-PCR分析表明该基因仅在地下块茎中表达,而且表达丰度在收获前逐渐降低。     

甜瓜EIN3/EILs基因家族全基因组鉴定与进化分析

以拟南芥的EIN3/EILs蛋白保守结构域为探针序列,对甜瓜全基因组的蛋白质数据库进行搜索,搜索后获得4个EIN3/EILs蛋白序列。对甜瓜EIN3/EILs基因家族的系统进化、序列相似性、基因结构进行了分析。通过对所有甜瓜的EIN3/EILs基因的表达谱分析得知该基因家族在各组织中均有表达,其中在果实以及愈伤组织中高丰度特异表达,不同基因之间的表达模式差异明显。     

笋瓜韧皮部蛋白基因启动子的克隆及其功能初探

笋瓜韧皮部蛋白ＰＰ２是一种特的结合几个丁质的凝集素,具有韧皮部组织特异性。为了研究该基因启动子在转基因植物中的表达特性,探索其在植物基因工程中潜在的应用价值,根据发表的序列,用ＰＣＲ方法从笋 瓜基因组中扩增得到了ＰＰ２基因启动子片段。     

番茄乙烯信号转导相关基因EIN3（Le-EIL）的克隆和表达

摘要：根据拟南芥?穴Arabidopsis thaliana ?雪、烟草?穴Nicotiana tabacum ?雪EIN3基因保守区序列设计简并引物，采用RT-PCR扩增从番茄(Lycopersicon esculentum )果实中得到一个486 bp的同源片段。以此片段作为探针，从番茄果实cDNA文库中分离到一个拟南芥EIN3的同源基因的cDNA克隆,命名为Le-EIL。该克隆含有一个1 845 bp的开放阅读框，编码615个氨基酸。经同源分析，它与烟草TEIL基因的同源性为79%，与拟南芥EIN3、EIL1、EIL2和EIL3的同源性分别为59%、56%、52%、46%。Le-EIL基因表达与番茄果实的成熟及乙烯生成情况具有较强的相关性。在普通番茄果实的不同成熟时期Le-EIL基因都有表达，并且随着成熟度的增加基因表达有明显的增强，在转色期和粉红期Le-EIL基因的表达最强, 在全红期后减弱。在转反义ACS基因的转基因番茄果实中，只有开花后60 d的果实中Le-EIL基因有微弱的表达，在其它成熟时期均没有表达。     

番茄乙烯信号转导相关基因剧EIN3（Le-EIL）的克隆和表达

根据拟南芥（Arabidopsis thaliana)、烟草(Nicotiana tabacum)EIN3基因保守区序列设计简并引物，采用RT—PCR扩增从番茄(Lycopersicon esculentum)果实中得到一个486bp的同源片段。以此片段作为探针，从番茄果实cDNA文库中分离到一个拟南芥EIN3的同源基因的cDNA克隆，命名为Le-EIL。该克隆含有一个1845bp的开放阅读框，编码615个氨基酸。经同源分析，它与烟草TEIL基因的同源性为79％，与拟南芥EIN3,EIL2和EIL3的同源性分别为59％、56％、52％、46％。Le-EIL基因表达与番茄果实的成熟及乙烯生成情况具有较强的相关性。在普通番茄果实的不同成熟时期Le—EIL基因都有表达，并且随着成熟度的增加基因表达有明显的增强，在转色期和粉红期Le-EIL基因的表达最强，在全红期后减弱。在转反义ACS基因的转基因番茄果实中，只有开花后60d的果实中Le-EIL基因有微弱的表达，在其它成熟时期均没有表达。     

甘薯茎线虫乙酰胆碱酯酶基因ace-3全长cDNA的克隆和序列分析

利用RT- PCR结合RACE技术克隆了甘薯茎线虫（Ditylenchus destructor）乙酰胆碱酯酶基因cDNA,Dd-ace-3,提交GenBank登录号EF583057。该cDNA序列5’端存在反式剪接引导序列SL1,全长2517bp ,包含一个1836bp的开放阅读框;在推导出的611个氨基酸残基的前体蛋白中, N 端的前21个氨基酸残基为信号肽, C-28的位置存在糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定位点,除此之外的562个氨基酸残基是成熟的乙酰胆碱酯酶序列,其预测的分子量为64396.81D。在一级结构中,形成催化活性中心的3个氨基酸残基 (Ser232 ,Glu360 和His479) ,以及在亚基内形成二硫键的6个半胱氨酸完全保守;在电鳐乙酰胆碱酯酶分子的催化功能域中存在14个保守的芳香族氨基酸残基,其中11个在甘薯茎线虫乙酰胆碱酯酶中完全保守。该酶的氨基酸序列与秀丽小杆线虫（Caenorhabditis elegans）ACE-3和ACE-4的同源性达56.1%和50.0%。与其它线虫和物种乙酰胆碱酯酶的聚类分析显示,甘薯茎线虫的乙酰胆碱酯酶与Ш型乙酰胆碱酯酶ACE-3同属一个支系。     

斑马鱼干扰素(zIFN)cDNA分子克隆与序列分析

Stephen(2003)等首次报道了低等脊椎动物一斑马鱼干扰素基因(zIFN)，揭示了zIFN氨基酸序列与脊椎动物干扰素的同源性为14％～23％。为了证实zIFN基因的存在以及进一步利用干扰素基因，本实验参照zIFN基因序列设计了引物对，采用RT-PCR法克隆了AB品系斑马鱼干扰素基因，并发现zIFN存在变异、可分为亚型。