大肠杆菌肠毒素STI、STII、LTB融合基因植物表达载体的构建

产肠毒素性大肠杆菌(ETEC)LT和ST是导致人和动物腹泻的主要病原菌。利用PCR方法分别从pGEM-5Zf( )-STI、K88ab(LT ,ST )质粒中扩增到了STI、STII基因,然后通过三引物PCR实现了STI、STII基因的融合,再与LTB基因融合,并置同一阅读框。LTB基因的5′位于STII基因的3′端,并在ST基因和LTB基因之间插入7个氨基酸的连接肽。将融合基因STI-STII-LTB构建到带有核基质结合区序列(MARs)的植物表达载体pBI121-MARs中,并通过冻融法导入根癌农杆菌EHA105。     

产肠毒素大肠杆菌K88ac-STⅡ-LTA2/LTB融合基因在苜蓿中的表达

为提高农杆菌介导的苜蓿遗传转化效率,获得转K88ac-STⅡ-LTA2/LTB基因苜蓿植株,以苜蓿下胚轴为外植体,对影响遗传转化的预培养时间、农杆菌菌液浓度、筛选方式等进行研究.结果表明,苜蓿下胚轴预培养3 d,菌液浓度为OD6000.5,筛选剂Kan浓度第一阶段和第二阶段分别为30和50 mg/L ,延迟筛选7 d时转化效率最高.对转基因苜蓿进行PCR和PT-PCR检测,初步证实目的基因已经整合到苜蓿基因组中,转化率达28.4%.     

产肠毒素大肠杆菌k88ac基因原核融合表达载体的构建

利用PCR技术扩增出菌毛K88ac基因片段,并将其插入到原核表达载体pET32a( )的多克隆位点上。测序结果表明:与Genbank中序列比对同源性达到99%以上,成功构建了原核表达载体。为进一步的研究工作,奠定了基础。     

猪源大肠杆菌志贺样毒素2型突变体B亚基与LTB基因的融合与表达

猪水肿病的主要毒力因子是志贺样毒素的2型突变体(Stx2e),毒素的A亚基是有毒的酶活性单位,B亚基无毒,介导毒素与受体的结合。为了增加B亚基的免疫原性,采用重叠PCR将猪源志贺样毒素Ⅱ型突变体B亚单位(Stx2e B)连接至热敏肠毒素的B亚单位(LTB)成熟肽N末端,获得Stx2e B与LTB相连的融合蛋白基因Stx2e B-LTB。融合基因克隆到表达载体pQE30中,在IPTG的诱导下,融合基因在大肠杆菌中获得表达,表达量占细菌总蛋白的8%。融合蛋白的获得为猪水肿病基因工程亚单位疫苗的制备、猪水肿病的预防奠定了基础。     

利用重组PCR技术构建大肠杆菌肠毒养LTB—STI融合基因

利用重组PCR技术将从原始菌种中扩增得到的LTB、STI基因片段连续起来，构建了LTB-STI融合基因。并将其克隆到pUCm-T载体上，转化到大肠杆菌DH5a中，得到克隆T-LS，序列分析表明该克隆具有正确的基因序列和阅读框，具有起始密码子ATG和终止密码子TAA，可以插入到原核表达载体中进行表达。     

仔猪产肠毒素大肠杆菌疫苗的研究进展

仔猪腹泻仍然是困扰世界养猪业的重要疾病之一,产肠毒素大肠杆菌（ETEC）是引起仔猪腹泻的重要病原菌。在饲料中添加抗生素、喂服特异性抗体、膳食调节、利用遗传育种选育等多种方法被用来预防和治疗ETEC引起的感染。相比其他预防措施,疫苗接种是防制ETEC引起仔猪腹泻的最经济和最有效的手段。就目前猪用ETEC疫苗的最新研究进展进行综述,并分析了ETEC疫苗研究中面临的挑战,提出了高效疫苗的研究策略,旨在为ETEC新型、安全、高效和广谱疫苗的研发提供依据。     

K88^＋产肠毒素大肠杆菌贵州分离株的生物学特性

应用溶血性试验,故Ｄ－甘露糖微量血凝试验（ＭＲＭＨ）,玻板凝集,体外细胞粘附试验透射电镜和兔肠结扎试验,首次对大肠杆菌贵州分离株的生物学特性进行了全面研究。结果表明,该细菌是一株血清型为Ｏ６０：Ｋ８８,不溶血,产肠毒素的大肠杆菌;其所产Ｋ８８菌毛抗原,在电镜下呈纤细短小,密布于细菌表面,能介导细菌粘附于仔猪离体肠上皮细胞,使细菌能凝集豚鼠和鸡的红细胞,其凝集作用不被Ｄ－甘露糖抑制。     

表达大肠杆菌耐热性肠毒素Ⅰ融合蛋白工程菌株的免疫原性研究

对已构建的重组质粒ｐＸＳＴ１进行了核苷酸序列分析和免疫原性研究。序列分析结果表明，该粒中含有２个正向串联在一起的ＳＴ１基因，且融合在ＬａｃＺ基因的上游，具有正确的阅读框架。免疫实验结果表明，构建的ＤＨ５α重组菌株安全无毒。     

实时荧光定量PCR检测感染小鼠肠道内容物的LT肠毒素基因

构建LT-PMD19质粒标准品,进行SYBR Green荧光定量PCR检测产肠毒素大肠杆菌(ETEC)LT基因,以确定该方法的特异性和灵敏度,绘制标准曲线;通过腹腔注射0.2mL ETEC菌液建立小鼠腹泻模型,分别于感染后4h、15h、2d、7d和14d各处死2只,通过建立的荧光定量PCR方法对小肠液中的ETEC的LT基因进行定量检测。研究结果显示,用建立的荧光定量PCR检测LT基因无非特异性扩增,标准曲线呈良好的线性关系(R2=0.999),标准品的熔解曲线均呈单峰,灵敏度为8.18×103拷贝数/μL;小鼠感染4h后LT毒素含量最高,剖检可见小肠肿大,充满黄绿色的内容物,感染后7d、14d均未检测出LT毒素,肠道未见明显病变,表明LT肠毒素在肠道内的生成规律与肠道病变损伤呈正相关。     

内蒙古部分地区致犊牛腹泻产肠毒素大肠杆菌的调查研究

为了阐明内蒙古部分地区致犊牛腹泻产肠毒素大肠杆菌的流行情况,该研究以内蒙古自治区乌兰察布和鄂尔多斯地区部分牛场腹泻病例为研究对象,采集患病犊牛样本,采用PCR方法检测产肠毒素大肠杆菌（Enterotoxigenic E. coli, ETEC）的ST和LT基因进行ETEC菌株鉴定。研究结果显示,乌兰察布地区ETEC检测总阳性率为11.71%,鄂尔多斯地区ETEC总阳性率为9.44%,其中0～2月龄阳性率为21.49%, 2～6月龄阳性率为5%, 6～18月龄阳性率为0。由此可知,乌兰察布地区ETEC检测总阳性率高于鄂尔多斯地区,两个地区ETEC的流行情况和感染情况均以0～2月龄犊牛为主,为进一步开展犊牛腹泻疾病的防控提供了依据。     

K88菌毛基因的克隆及ST表位序列在菌毛基因上的融合

[目的]为了建立用于细胞表面展示的载体系统。[方法]利用PCR技术,以大肠杆菌质粒为模板扩增K88菌毛操纵子的结构基因faeC~faeH,并克隆到pBR322质粒载体中。合成一段替换序列,在菌毛抗原基因的超变区引入酶切位点ApaI和NcoI,合成耐热肠度素STII表位编码序列,并引入菌毛抗原基因的超变区。[结果]经PCR鉴定和限制性内切酶酶切证明,重组质粒pBR-fae插入片断大小为6.6kb,与预期相符。核苷酸序列分析证明,所得faeC~faeH序列正确。PCR筛选和测序验证证明,构建了K88菌毛-耐热肠度素STII的融合基因。[结论]试验成功获得了重组质粒pBR-fae-ST。     

GST-LRF融合蛋白在大肠杆菌中表达条件的优化及纯化

优化GST-LRF融合蛋白在大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中的表达条件,并对其表达产物进行纯化。通过改变诱导温度、诱导时间及诱导剂浓度等条件,SDS-PAGE电泳分析以确定GST-LRF融合蛋白表达的最佳条件。并通过Glutathione Sepharose 4B亲和层析柱和电洗脱法纯化目的蛋白。结果表明:重组质粒转化菌E.coliBL21(DE3)在37℃、0.1 mmol/L IPTG诱导5 h时,GST-LRF融合蛋白表达量最高,经电洗脱法纯化得到了GST-LRF融合蛋白。已确定GST-LRF融合蛋白在大肠杆菌的最佳表达条件,并纯化得到目的蛋白,为进一步制备抗LRF的单克隆抗体及LRF功能的研究奠定了基础。     

人基质蛋白酶2(MMP-2)血红素结合蛋白样结构域原核表达、复性及生物学活性验证

用RT-PCR从人神经胶质瘤U87细胞扩增人基质金属蛋白酶-2(MMP-2)血红素结合蛋白样结构域(PEX)基因,克隆到pMD18-T载体然后测序;将PEX定向克隆到PET-25b(+)中构建原核表达载体PET-PEX,转化大肠杆菌BL21(DE3),诱导表达产生表达量近40%的包涵体蛋白,表达蛋白分子量大小约28.0 KD,与预期大小相符.包涵体经优化洗涤,8 mol/L尿素变性,采用透析法进行复性.鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)试验显示复性后的PEX蛋白能显著抑制鸡胚新生血管生成(P<0.05),并且其抑制作用表现出一定的剂量依赖性.     

猪瘟病毒石门株NS3基因在大肠杆菌中的表达

采用PCR技术,扩增了猪瘟病毒石门株NS3基因的丝氨酸蛋白酶、NTPase、RNA解螺旋酶活性功能区长度为2 000 bp的片段,将其克隆到pET-32a中,构建了原核表达载体pET-NS3,并将其在大肠杆菌Rosetta(DE3)中进行了表达,同时对表达产物进行了SDS-PAGE和Western blotting检测。结果表明,IPTG诱导表达得到的pET-NS3融合蛋白的相对分子质量约为97 ku,与预期结果一致,且该重组蛋白能被CSFV阳性血清所识别。     

谷胱甘肽硫转移酶与hEGF在大肠杆菌中的融合表达及活性研究

为了得到具有生物学活性的人表皮生长因子(hEGF),将含有人表皮生长因子基因的原核表达载体pGEX-4t-1(+)-hEGF转化入BL21-CodonPlusTM-RP表达宿主菌进行大量表达,SDS-PAGE分析表明,融合蛋白主要以包涵体的形式存在。收集包涵体,用氧化复性的方法,加入还原型的谷胱甘肽进行复性,之后通过GlutathioneSepharoseTM4B纯化柱,分离纯化得到复性的融合蛋白。以兔抗人EGF单克隆抗体为一抗,进行Western blotting鉴定,证明分离纯化得到的融合蛋白含有目的蛋白hEGF。最后对复性的融合蛋白进行了活性分析,表明该融合蛋白具有良好的hEGF生物学活性。     

大肠杆菌k88ac菌毛蛋白亚基因的克隆、表达及亲和层析纯化

利用PCR技术,从E.coli C83902中扩增出不含信号肽序列的K88ac菌毛蛋白亚基基因片段,将其克隆到表达载体pQE-30中,构建了原核表达载体pQE30-K88ac,并转入E.coli XL1-Blue中。经IPTG诱导后,由T5启动子调控表达了氨基端带6个连续组氨酸残基的以包涵体形式存在的K88ac蛋白,在变性条件下对目的蛋白进行纯化,并获得了高纯度的融合蛋白。     

鼠疫杆菌YscF抗原基因在大肠杆菌中的表达及鉴定

为了克隆表达鼠疫耶尔森氏菌的YscF抗原基因,并对其免疫原性进行初步研究,将PCR扩增的YscF基因连接到pMD-18T载体,测序正确后再将YscF基因连接到表达载体PET32a,构建PET32a-YscF重组质粒,并在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达;诱导表达蛋白采用Ni2+亲和层析法纯化,Western blot检测其免疫原性。结果显示,28 ku的PET32a-YscF融合蛋白能被兔抗鼠的多抗识别,说明表达产物具有良好的抗鼠疫抗原特异性。     

葡萄卷叶伴随病毒ⅢCP基因在E.coli中的表达

将葡萄卷叶伴随病毒 的 CP基因克隆到表达载体 p ET- 30 a中 ,转化大肠杆菌 BL2 1,筛选得到阳性克隆 GB- 1,用 IPTG诱导使其表达。SDS- PAGE电泳分析表明 ,该 CP基因在大肠杆菌 BL2 1中得到大量表达。用该病毒的 CP抗血清通过间接 EL ISA证明所表达的蛋白具有很好的抗原性     

大肠杆菌不耐热肠毒素A、B亚单位基因双价植物表达载体的构建

不耐热肠毒素LT是肠产毒性大肠杆菌（Enterotoxigenic E．coli，ETEC）分泌的一种热不稳定性肠毒素，由A、B两种亚单位组成的AB5型杂六聚体蛋白，是目前人们发现的最强有力的粘膜免疫原和粘膜免疫佐剂之一。本研究利用基因工程技术，从强致病菌株K88ac中，分别克隆了LTA和LTB基因，并利用高效植物表达载体pBI121、pBLG和pCAMBIA2300成功构建了带有内质网滞留信号RDEL／KDEL不耐热肠毒素A、B哑单位基因双价植物表达载体pCAMBIA2300-LTA—LTB。为研究LT全毒素在植物中的正确组装及进一步构建带有保护性抗原类全毒素嵌合植物疫苗奠定基础。     

南芥菜花叶病毒外壳蛋白的克隆表达及抗血清的制备

依据报道的ArMV外壳蛋白基因(coat protein,cp)序列设计引物,通过RT-PCR扩增得到长约990bp的ArMV cp基因亲水基团部分片段,将目的片断克隆到原核表达载体pEGX-6p-1中,构建ArMV cp基因与GST蛋白融合表达载体pEGX-cp,重组载体化大肠杆菌BL21,经IPITG诱导后,融合蛋白GST-cp得到了特异表达。用12%的SDS-PAGE分析结果表明,表达产物大小为63.2 kDa主要以包含体的形式存在。用冰冷的KCl显色,分离表达的蛋白质特异条带制备抗体,免疫家兔后得到特异性较强的抗血清,经酶联免疫法检测效价为1∶100 000。