油菜基因BnWRI1的克隆及RNAi对种子含油量的影响

 【目的】阐明油菜基因BnWRI1对其种子含油量的影响。【方法】采用RT-PCR技术从油菜中克隆到BnWRI1基因编码区内384 bp的片段,将该片段正反向插入干扰载体pGΩ4ARi中,构建成RNAi表达载体pGΩ4ARi-WRI1,通过花粉管通道法将其转入油菜受体品种中双9号中,【结果】获得3棵转基因植株,PCR扩增和基因组Southern杂交证实外源片段已整合在受体油菜基因组中。利用半定量RT-PCR和改进的索氏提取法分别检测转基因T1代植株的BnWRI1基因表达量和种子含油量,结果表明：与非转基因对照相比,转基因植株的BnWRI1基因均受抑制,种子含油量有所降低。【结论】采用RNAi技术可使油菜内源基因BnWRI1沉默,表明油菜基因BnWRI1能有效调控种子含油量。     

柑橘黄龙病病原DNA提取方法比较

【目的】筛选出一种快速高效获取柑橘黄龙病病原DNA的提取方法,为黄龙病亚洲种病原的检测奠定基础。【方法】选取5份疑似黄龙病症状柑橘叶片样品,分别采用4种试剂盒（快捷型基因组DNA提取系统、新型植物基因组DNA提取试剂盒、植物基因组DNA提取试剂盒、快速DNA提取扩增套装）及CTAB法提取柑橘叶脉基因组DNA,并用柑橘黄龙病亚洲种的16SrDNA特异引物fD1／fD2和01I／012c进行PCR扩增,DNA提取产物及PCR扩增产物在1％琼脂糖凝胶电泳上检测。【结果】快捷型基因组DNA提取系统获得的DNA质量最好,植物基因组DNA提取试剂盒和CTAB法提取DNA方法提取得到的DNA质量较好,新型植物基因组DNA提取试剂盒所获得的DNA质量较差,快速DNA提取扩增套装所获得的DNA质量最差。除陕速DNA提取扩增套装外,其余4种DNA提取方法均扩增出黄龙病亚洲种病原。【结论】快捷型植物基因组DNA提取系统试剂盒操作简单快捷,耗时短,提取的DNA效果较好,能够满足黄龙病病原PCR检测的要求。     

柑橘黄龙病病原DNA提取方法比较

【目的】筛选出一种快速高效获取柑橘黄龙病病原DNA的提取方法,为黄龙病亚洲种病原的检测奠定基础。【方法】选取5份疑似黄龙病症状柑橘叶片样品,分别采用4种试剂盒（快捷型基因组DNA提取系统、新型植物基因组DNA提取试剂盒、植物基因组DNA提取试剂盒、快速DNA提取扩增套装）及CTAB法提取柑橘叶脉基因组DNA,并用柑橘黄龙病亚洲种的16S rDNA特异引物fD1/fD2和OI1/OI2c进行PCR扩增,DNA提取产物及PCR扩增产物在1%琼脂糖凝胶电泳上检测。【结果】快捷型基因组DNA提取系统获得的DNA质量最好,植物基因组DNA提取试剂盒和CTAB法提取DNA方法提取得到的DNA质量较好,新型植物基因组DNA提取试剂盒所获得的DNA质量较差,快速DNA提取扩增套装所获得的DNA质量最差。除快速DNA提取扩增套装外,其余4种DNA提取方法均扩增出黄龙病亚洲种病原。【结论】快捷型植物基因组DNA提取系统试剂盒操作简单快捷,耗时短,提取的DNA效果较好,能够满足黄龙病病原PCR检测的要求。     

玉米根部特异性启动子的克隆及功能分析

【目的】从玉米幼根基因组DNA中克隆β-葡萄糖苷酶基因根部特异性启动子序列ZmGLU1P,并对其功能进行分析。【方法】利用PCR技术从玉米品种P138幼根基因组DNA中克隆玉米根部特异性启动子片段ZmGLU1P,将其与GUS基因融合,构建植物表达载体pCAMBIA121-ZmGLU1P,转化到EHA105根癌农杆菌中,通过根癌农杆菌介导法转化烟草NC89,对转化烟草植株进行PCR和Southern杂交检测。采集PCR和Southern杂交检测为阳性的转基因烟草的根、茎、叶,进行GUS活性的组织染色检测。【结果】克隆获得了ZmGLU1P片段,其长度为1 846 bp,与已报道的序列同源性达99%以上。转基因烟草植株的PCR和Southern杂交结果显示,成功地获得了转基因阳性植株;GUS活性检测表明,根中GUS活性最强,而在茎和叶等组织中GUS活性甚微,表明ZmGLU1P片段具有根部特异性启动子功能。【结论】玉米β-葡萄糖苷酶基因上游1 846 bp的片段ZmGLU1P具有根部特异性启动子功能,为根部特异性启动子。     

一种快速、简便提取大豆油DNA的方法及转基因大豆油的检测

【目的】DNA的提取是GMO（Genetically modified organism）作物检测中重要步骤，DNA的质量关系到GMO检测的成败。【方法】本研究以大豆油为材料，探索出一种快速、简便的提取大豆油DNA的方法。【结果】该方法能从10 ml大豆油中提取0.4 μg高纯度DNA，可用于PCR检测。提取市场上出售的十几种精练大豆油的DNA, 针对 35S、Nos、EPSPS和Lectin 基因进行了PCR检测，分别扩增出不同的目的片段。【结论】大豆油中有残存的DNA碎片，在转基因大豆油中能扩增出外源基因的片段。本研究为大豆油的外源基因的检测提供了可行方法。     

蝴蝶兰2种病毒的同步检测及其CP融合反义表达载体构建

【目的】建兰花叶病毒(CyMV)和齿兰环斑病毒(ORSV)是侵染蝴蝶兰最主要的2种病毒,给蝴蝶兰产业造成巨大经济损失。本文建立了快速检测这2种病毒的方法,并为培育同时抗CyMV和ORSV的蝴蝶兰新品种奠定基础。【方法】根据2种病毒CP基因序列设计了2对特异性引物,运用RT-PCR方法同时检测这2种病毒,利用反义RNA技术构建2种病毒CP基因的融合表达载体。【结果】利用设计的特异性引物检测12株蝴蝶兰样品,有25%同时检测出2种病毒,在同一PCR反应体系中,扩增出2个目的条带清晰无杂带。从感病蝴蝶兰叶片总RNA中克隆出CyMV CP基因的125 bp片段和ORSV CP基因的164 bp片段。将CyMV的CP基因片段以3’→5’方向与表达载体p CAMBIA1300连接,命名为p CAMBIA1300-CyMV,经酶切及菌落PCR鉴定可获得125 bp的小片段;再将ORSV的CP基因片段以3’→5’方向与p CAMBIA1300-CyMV连接,命名p CAMBIA1300-CyMV-ORSV,经酶切及菌落PCR鉴定可获得289 bp的片段。【结论】所设计的2对特异性引物能够在同一PCR体系中快速高效地检测出CyMV和ORSV,含2种病毒CP基因的反义融合表达载体构建成功。     

四川番茄黄化曲叶病病原分子鉴定及变异分析

 【目的】明确引起四川番茄黄化曲叶病（Tomato yellow leaf curl disease,TYLCD）的病原。【方法】对采自四川攀枝花市田间表现矮化、黄化和曲叶症状的番茄植株SC64-67,通过PCR、克隆及测序等技术获得病毒及卫星DNA的全基因组序列,并对序列进行变异分析。【结果】利用双生病毒简并引物PA/PB从4个样品中均扩增得到约500 bp的片段,随机选择SC65进行DNA-A全基因组扩增和序列测定,该DNA分子全长为2 732 nts,系统进化分析表明,其与已报道的中国番茄黄化曲叶病毒（Tomato yellow leaf curl China virus, TYLCCNV）来自云南元谋的菜豆分离物（TYLCCNV-Bean-YM）的核苷酸序列相似性最高,为96.0%。检测发现,所有分离物均伴随有卫星DNAβ分子。全序列测定表明SC65 DNAβ全长1 338 nts,与分离自云南楚雄番茄上的TYLCCNV-Y25伴随的卫星DNAβ亲缘关系最近,核苷酸序列相似性为77.5%。【结论】研究表明四川番茄黄化曲叶病样品均受到TYLCCNV/DNAβ病害复合体的侵染,但其病毒DNA-A和卫星DNAβ分子来源于TYLCCNV的不同分离物。     

柑橘衰退病毒基因p23 RNAi载体的构建及转化

【目的】构建柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus,CTV)含p23的RNAi载体,以获得具有抗性的柑橘转基因植株。【方法】基于转化病毒基因介导抗性,根据NCBI公布的CTV基因组序列,查找p23保守序列,设计并克隆两条不同长度的片段。对两条片段和植物表达载体p BI 121进行双酶切和连接来构建RNAi载体。初步预测所构建的载体发生RNAi抗病毒的可行性。利用农杆菌介导的瞬时表达技术将含RNAi载体的农杆菌注射入CTV指示植物墨西哥莱蒙的叶片,利用GUS组织化学染色法观察叶片中载体发生瞬时表达的情况。发生瞬时表达的叶片接种CTV T36基因型,利用酶联免疫反应(ELISA)检测病毒含量。同时,提取叶片的RNA并反转录为c DNA,利用实时荧光定量PCR(q-PCR)检测CTV p20,通过该基因的表达量反映叶片中的病毒含量。通过农杆菌介导的遗传转化将RNAi载体转入大红甜橙实生苗上胚轴节间茎段,抗生素筛选得到的芽嫁接至枳橙实生试管苗。提取大红甜橙叶片的DNA,通过PCR扩增确定其是否为转基因阳性;目的基因检测为阳性的植株二次嫁接至温室保存的酸橙实生苗;根据插入的p23基因序列设计q-PCR引物,检测转基因植株中p23的表达情况。取CTV T36基因型寄主的带皮芽,用腹接法接种大红甜橙转基因植株。取接种后新萌发枝梢上的叶片,用检测瞬时表达叶片同样的方法分析植株的抗病性。对于第1次接种后未检测出病毒感染的植株,进行第2次接种并检测分析。【结果】克隆得到CTV p23 513 bp的长片段和291 bp的短片段,与载体p BI121连接后成功构建含发夹结构的来自病原且能靶向目的基因的RNAi载体,命名为p23-RNAi。注射p23-RNAi的墨西哥莱蒙叶片经GUS染色后能够产生蓝色斑点,表明农杆菌p23-RNAi可以在叶片中发生瞬时表达;接种CTV后第15和30天,瞬时表达p23-RNAi的墨西哥莱蒙叶片ELISA检测结果均为阴性,同时q-PCR检测结果显示其CTV p20的积累水平和增加速度明显低于对照植株,表明瞬时表达的p23-RNAi在一定时间内可以对CTV的侵染产生抑制。p23-RNAi经农杆菌介导遗传转化大红甜橙获得抗性芽,通过普通PCR的扩增结果证明得到7个转基因植株;q-PCR检测结果进一步表明7个转基因植株间p23的含量呈现一定差异,植株E的含量最高,其次是C、F、H、A、B和G。接种CTV后,p20的表达量在7个转基因植株间也表现出一定差异,表达量最高的是植株A,其次是G、F、E、B、H、C,且与对照植株相比,呈现不同程度的抗病性。转基因植株对病毒的抗性与外源基因的表达水平没有相关性,外源基因表达水平最高的植株E并没有表现强的CTV抗性。经过两次病毒接种,转基因植株C在接种后具有完全抗性。【结论】p23-RNAi载体能引起植物抗柑橘衰退病毒;瞬时表达技术可快速鉴定RNAi载体的抗病性,有利于筛选高效率的RNAi载体。     

番茄SlN-like的克隆、表达与抗病毒功能

【目的】番茄(Solanum lycopersicum)作为重要的蔬菜作物,其生长受到包括害虫、真菌、细菌和病毒等各种生物因素的危害。明确番茄抗性基因SlN-like的抗病毒功能与机制,为番茄的抗病毒育种与抗病毒药剂的靶向开发提供理论依据。【方法】从茄科植物基因组数据库Solanaceae Genomics Network中获得SlN-like的全长,并将其分为4段,利用融合聚合酶链式反应(fusion PCR)扩增获得SlN-like的序列全长;通过生物信息学分析SlN-like的进化关系、蛋白特征、保守结构域、亚细胞定位以及互作关系;通过实时荧光定量PCR分析SlN-like在番茄根、茎、叶、花和果实中的表达情况及其在烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus,TMV)侵染后的叶片表达量;借助烟草脆裂病毒(tobacco rattle virus,TRV)介导的基因沉默技术(virus induced gene silencing,VIGS)沉默番茄内源SlN-like,摩擦接种TMV-GFP于沉默植株,明确SlN-like对病毒侵染的影响。实时荧光定量PCR分析沉默植...     

单粒精米的DNA磁珠法高效率提取技术研究

【目的】文章研究了利用磁珠法高效率提取单粒精米DNA的技术方法。【方法】以4份市售大米为材料,利用磁珠吸附法从单粒精米样品中提取基因组DNA并进行PCR扩增,进行提取效率的检测。【结果】提取的20份基因组DNA条带整齐、无弥散、质量高,浓度均在1 ng/μl以上;进一步,以提取液为模板,利用SSR引物RM247和RM282进行PCR扩增,电泳检测后分别得到180和120 bp的目标条带。【结论】利用磁珠法提取的单粒精米DNA可以直接用于PCR反应;结果为特殊目的或稀缺材料的微量DNA提取检测提供技术支持。     

乙肝病毒表面抗原基因转化番茄

将乙肝病毒表面抗原 (HBs Ag)基因与 Ca MV3 5 s启动子及 nos终止子构建植物表达载体 p1 3 0 1 HBs,直接法转入根癌农杆菌 EHA1 0 5 (Agrobacterium tumefaciens) ,以该菌株介导叶盘法转化番茄 ,得到抗潮霉素的再生植株 .抗性苗总 DNA经 PCR、Southern斑点杂交证实目的基因已整合到番茄基因组中 ,EILSA检测证明在番茄中正确表达了乙肝表面抗原蛋白 .     

安徽淮北番茄曲叶病的病原鉴定初报

采用分子手段鉴定了安徽淮北番茄曲叶病的病原.从安徽淮北番茄温室采集番茄叶片样本,用CTAB法从番茄叶片中提取总DNA.利用简并引物PA、PB进行PCR扩增,从大部分样本中扩增出双生病毒500 bp特异性条带.将扩增片段克隆并测序,该片段序列全长541 bp,与我国报道的番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)各个分离物序列相似性均很高,达到95.9%～99.4%,可以初步明确侵染安徽淮北番茄的双生病毒为番茄黄化曲叶病毒(TYLCV).安徽淮北TYLCV 500 bp片段序列与山东TYLCV相似性最高,达99.4%,而且从构建的系统关系树也可以看出,安徽淮北TYLCV与山东TYLCV的亲缘关系最近,推测安徽淮北番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)可能来源于山东.     

细胞和个体水平沉默效应的差异

[目的]研究3种不同长度的四联shRNA载体及其在细胞与个体水平的沉默效应差异。[方法]以EGFP为靶标基因,用hU6、mU6、h7SK、hH1 4种启动子,构建21、27、29 bp的3种四联沉默载体,通过转染Vero细胞和注射小鼠肌肉,以实时荧光定量PCR的方法检测绿色荧光蛋白基因的mRNA水平。[结果]3种载体都有很强的沉默效应,其在细胞水平上的沉默效应远高于个体水平上,可以通过未成年鼠的肌肉注射进行转基因。[结论]多位点串联表达shRNA是一种可以达到较好干扰效果的方法,肌肉注射将是一个简便的转基因途径。     

一种用于转基因水稻快速检测的DNA提取方法

[目的]建立一种快速筛选转基因水稻的DNA提取方法。[方法]对试剂盒法和快速法2种DNA提取方法进行比较,并分别用转Ta NADP-ME1和Ta NADP-ME2基因的转基因水稻进行验证。[结果]用快速法提取得到的DNA进行PCR扩增,可分别得到约1 700 bp的Ta NADP-ME2基因和约1 900 bp的Ta NADP-ME1基因,且条带清晰明亮,与试剂盒法相比无显著差异。[结论]该研究中快速提取DNA的方法经济、简便、快捷,适合用于对大量转基因样品进行检测。     

木薯细胞壁酸性转化酶MeCWINCV5基因启动子的克隆和序列分析

[目的]了解MeCWINCV5在植物生长发育、激素调节和逆境胁迫应答中的功能.[方法]采用PCR方法从木薯基因组中分离MeCWINCV5基因启动子序列,考察MeCWINCV5对植物生长发育、激素调节和逆境胁迫应答的影响.[结果]分析显示启动子的长度为1170bp,合有TATA box和CAAT box等多个典型的真核生物启动子基本元件元件,还存在大量逆境胁迫诱导相关的顺式调控元件,如HSE、MBS、SARE、GARE-motif和TATC-box等多个与植物逆境胁迫相关的元件.[结论]MeCWINCV5基因启动子与逆境胁迫有关,在木薯抵御逆境胁迫的生理过程中具有重要作用.     

2022 年 2 期目录

  目的  SPL（SQUAMOSA promoter binding protein-like）是植物特有的转录因子,参与植物幼年期向成年期的转变、营养生长向生殖生长的转变、花发育、孢子发生、叶片和根发育、逆境响应等多个过程,在植物的生长发育过程中起着非常重要的作用。探究白桦中BpSPL6基因启动子区的顺式作用元件,以及该启动子在正常和胁迫条件下的表达模式,可为进一步研究BpSPL6基因的功能提供参考,也可为了解白桦的抗逆机制提供依据。  方法  以本实验室组培白桦的总DNA为模板,经PCR克隆了BpSPL6基因上游1 703 bp的启动子序列,用PLACE和Plant CARE在线软件分析启动子区的顺式作用元件。构建BpSPL6基因启动子驱动GUS报告基因的植物表达载体并转化拟南芥,探究其组织表达特性和胁迫条件下的表达模式。  结果  PCR成功克隆了BpSPL6基因上游1 703 bp的启动子序列,对启动子区的顺式作用元件预测发现除了含有核心启动元件TATA-box、CAAT-box外,还包括2种特异组织表达元件（根、花粉）,10种激素响应元件（生长素、赤霉素、水杨酸、脱落酸）,4种脱水响应元件等。对转基因拟南芥进行GUS染色结果表明,BpSPL6基因启动子驱动的GUS基因在转基因拟南芥中的表达具有时空特异性。在拟南芥的整个发育过程中,BpSPL6基因启动子驱动GUS基因在真叶叶片中表达,但是表达部位不同。随着叶片的生长,首先在叶片的顶端表达,随后扩展到叶片的叶脉并直至整个叶片,并且表达量逐渐升高。同时BpSPL6基因启动子驱动的 GUS 基因在拟南芥营养生长时期的根部都有表达。并且经氯化钠和甘露醇胁迫后其表达量降低。对比两种胁迫,受到氯化钠胁迫后GUS基因的表达量变化更大,说明对氯化钠胁迫的响应更加强烈。  结论  BpSPL6基因可能参与了植物的叶片、根发育以及对盐和干旱胁迫的响应。      

cNHX1基因转化草莓的研究

[目的]探讨将完整的含柑橘cNHX1基因转化为草莓植株。[方法]以弗吉尼亚草莓品种为试材构建了含柑橘cNHX1基因的植物表达载体,并进行了酶切鉴定,然后将表达载体导入农杆菌EHA105中,获得了工程菌株;利用农杆菌转化法,把cNHX1基因转化成草莓植株,并利用PCR方法鉴定了转化植株。[结果]利用农杆菌转化法获得了转cNHX1基因,通过进一步利用含Kam的平板进行筛选,获得了纯合的转基因植株;对获得的转基因草莓植株提取叶片DNA,利用引物F01和R02进行扩增,结果在草莓基因组中可以扩增出1.63kb的目的条带,证明cNHX1基因已经整合到草莓基因组。[结论]为获得耐盐程度显著提高的转基因草莓奠定了初步基础。     

菊花CmAP1基因克隆及其植物表达载体构建

[目的]克隆菊花CmAPETALA1基因(CmAP1)并构建植物表达载体,为该基因功能的遗传改良打下研究基础.[方法]采用同源克隆及RT-PCR从菊花叶片中克隆CmAP1基因,运用在线生物信息学分析工具对其核苷酸及氨基酸序列进行分析,利用实时荧光定量PCR对该基因的组织表达差异进行分析,并用双酶切法将目的基因与pCAMBIA1300载体连接,构建植物表达载体.[结果]克隆获得的CmAP1基因(GenBank登录号KU872999)编码区开放阅读框(ORF)长741 bp,编码246个氨基酸;CmAP1蛋白属亲水性蛋白,分子质量约28.3 kD、理论等电点(pI)为8.76,预测该蛋白内含10个磷酸化位点和2个潜在的N-糖基化位点;蛋白氨基酸序列比对和系统发育进化分析结果表明,CmAP1蛋白与CDM111蛋白的同源性达98%,属MADS-box基因家族A类基因的euAP1分支;实时荧光定量PCR分析结果表明,CmAP1基因在花蕾中表达量极高,在舌状花和筒状花中表达量较低,而在营养器官中仅痕量表达.将CmAP1基因连接到pCAMBIA1300载体上,可成功构建植物表达载体pCAMBIA1300-CmAP1.[结论]CmAP1基因在花的发育及形成过程中发挥重要作用,成功构建获得的植物表达载体pCAMBIA1300-CmAP1可为后期利用基因工程手段改变菊花花形态结构、调控花期及遗传改良打下基础.     

猪NCOA1基因PCR-RFLP多态性分析（摘要）（英文）

[目的]研究猪NCOA1基因的PCR-RFLP多态性,为猪的分子育种和标记辅助选择提供理论依据。[方法]以81头山东寿光六和原种猪场的长白猪为研究对象,采取常规酚-氯仿抽提法从猪耳组织提取基因组DNA,以基因组DNA为模板进行PCR扩增获得440 bp的NCOA1基因目的片段,利用限制性内切酶RsaⅠ对PCR产物进行酶切和琼脂凝胶电泳检测,并计算各等位基因频率和基因型频率。[结果]琼脂糖电泳检测酶切产物出现3种基因型：AA型（1条带：440 bp）、AB型（3条带：440、282、158 bp）、BB型（2条带：282、158 bp）;基因型频率分别为0.54、0.43和0.03;A和B 2个等位基因的基因频率分别为0.76和0.24。[结论]该研究猪群中,A为优势等位基因,AA基因型频率较高。     

上海地区番茄烟粉虱传双生病毒PCR检测

番茄黄化曲叶病毒属于双生病毒,根据其基因序列设计引物COPR、AV494和COPR、COPL,进行PCR检测,结果发现:从感病的DNA中扩增出了356 bp和570 bp目的片段,而健康植株和抗原材料DNA中无此扩增带,表明上海地区番茄黄化曲叶病毒属于烟粉虱传双生病毒。