水稻WRKY16基因分析及其转化拟南芥研究

通过酵母单杂交方法从水稻中获得编码转录因子的WRKY16基因.序列分析表明,WRKY16蛋白属于WRKY转录因子家族第二类别.利用根癌农杆菌进行WRKY16基因的拟南芥转化,GUS组织化学染色和PCR检测证明WRKY16基因已经转入拟南芥中,RT-PCR检测进一步证明该基因已在转基因植株得到表达.     

拟南芥热激转录因子AtHsfA6a的克隆与细胞定位分析

【目的】研究拟南芥热激转录因子AtHsfA6a在植物细胞中的定位及其作用机制。【方法】用RT-PCR方法从野生型拟南芥总RNA中,扩增获得了849 bp的拟南芥热激转录因子AtHsfA6acDNA片段,经过测序,结果与公布的序列完全相同。将该片段与绿色荧光蛋白(GFP)基因的cDNA重组,并克隆到表达载体pCHF3上,经PCR与酶切检测表明构建的表达载体正确。按照Clough等的方法转化拟南芥,经Kanamycin筛选和PCR检测,得到转基因植株;用激光共聚焦扫描荧光显微镜观察转基因植株幼苗的根部。【结果】在正常条件下,融合蛋白存在于细胞质中。【结论】在正常条件下拟南芥热激转录因子AtHsfA6a在细胞质中表达。     

梭梭NAC转录因子HaNAC38功能及特性分析

从梭梭干旱转录组中获得与干旱相关的NAC转录因子基因HaNAC38，为了研究其功能，以过表达HaNAC38基因拟南芥纯合株系作为对象，比较转基因株系与野生型间的差异，并利用酵母单杂交技术对HaNAC38转录因子可能结合的DNA核心序列进行验证。结果表明，在自然干旱和模拟盐胁迫条件下，过表达HaNAC38基因拟南芥株系生长状况显著优于野生型拟南芥。过表达HaNAC38基因拟南芥株系的种子发芽率、幼苗叶片脯氨酸含量及过氧化氢酶活性均显著高于野生型拟南芥株系，丙二醛含量和过氧化氢含量显著低于野生型拟南芥。由此表明HaNAC38显著增强了拟南芥对于干旱和盐胁迫的耐受能力。酵母单杂交试验结果表明，HaNAC38转录因子可以在酵母体内特异性结合TTGCGT核心序列，并激活下游报告基因的表达。以上结果为明确梭梭HaNAC38转录因子的功能及其调控网络奠定了基础。     

棉花GhSEDEG38基因调控棉花耐盐性的功能分析

基于棉花体细胞胚胎再生不同时期表达谱中筛选出一系列差异表达转录因子,通过RT-PCR和qRT-PCR分析这些转录因子在不同逆境处理下的表达,发现GhSEDEG38基因(somatic embryogenesis differencially expressed gene 38)的表达受盐胁迫诱导明显上调;序列分析发现GhSEDEG38编码bZIP型转录因子,与拟南芥bZIP53基因同源。为进一步验证该基因的功能,构建了该基因的RNAi干涉载体并转化棉花,通过分子检测获得了表达量显著降低的转基因棉花株系。通过对萌发期和三叶期转基因材料和对照材料进行盐处理发现,干涉GhSEDEG38基因降低棉花在萌发期及苗期对盐胁迫的抗性,盐处理后转基因植株的MDA含量和活性氧含量显著高于对照材料,而可溶性糖含量显著低于对照材料。综上,GhSEDEG38参与棉花对盐胁迫的应答。     

小麦转录因子基因TaWRKY33的耐盐性分析

【目的】WRKY转录因子是植物转录调节因子家族之一,参与调控植物病原菌的防御、生长发育和抗逆应答等多种生理过程。小麦WRKY转录因子基因TaWRKY33可以提高转基因拟南芥对干旱和高温的抗性。通过分析TaWRKY33的耐盐性,检测TaWRKY33转录因子的转录活性,深入分析转录因子基因TaWRKY33的功能,以解析其耐盐调控机制。【方法】以盐胁迫处理的小麦cDNA为模板,利用实时荧光定量PCR检测TaWRKY33在盐胁迫条件下的表达模式;将TaWRKY33的CDS序列插入带有CaMV35S启动子的pCAMBIA1302表达载体中,构建表达载体pCAMBIA1302-TaWRKY33,转入农杆菌,侵染野生型拟南芥获得转基因株系;同时利用pWMB110-TaWRKY33双元载体创建了过表达小麦株系。用转TaWRKY33的拟南芥和小麦进行耐盐性鉴定。构建诱饵载体pGBKT7-TaWRKY33,通过单转法将诱饵载体pGBKT7-TaWRKY33重组质粒和文库质粒逐步转化到酵母AH109感受态细胞。通过SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade和X-α-gal显蓝反应筛选得到阳性克隆,进行测序和BLAST分析。制备小麦原生质体,通过瞬时表达试验共转化报告子和效应子质粒,计算相对荧光值分析转录因子的转录活性。【结果】实时荧光定量PCR结果显示,TaWRKY33受盐胁迫的诱导表达。双荧光素酶瞬时表达试验表明TaWRKY33在小麦细胞中可以激活相应荧光素酶的活性。从功能分析,在正常生长条件下转基因拟南芥和野生型拟南芥没有明显差异;在盐处理条件下,转基因拟南芥的根长大于野生型拟南芥的根长;过表达拟南芥的鲜重大于野生型,呈显著性差异。重要的是,在盐处理下,鲜重、相对电导率和Na+含量表明,过表达TaWRKY33的小麦较其受体对照有更好的耐盐性。对TaWRKY33候选互作蛋白分析表明,这些候选互作蛋白主要参与植物体的信号转导或免疫过程,表明TaWRKY33在植物的逆境信号转导、基因转录调控过程中发挥着重要作用。【结论】小麦TaWRKY33受盐胁迫的诱导表达,具有潜在的转录激活活性,提高了转基因拟南芥和小麦的耐盐性;TaWRKY33可能需要其他蛋白共同作用提高小麦耐盐性。     

甘蓝型油菜BnaSOT12a基因的抗性作用研究

磺酸转移酶(SOT,EC2.8.2.–)催化的磺酸化反应在植物的生长发育和植物抗逆过程中起着重要的作用。甘蓝型油菜BnaSOT12a基因是与拟南芥中AtSOT12基因同源的一个磺酸转移酶基因。为探寻BnaSOT12a基因的抗性相关功能,对其在油菜中不同部位的表达和在拟南芥中过表达情况下对转基因植株的影响进行了分析。结果显示:BnaSOT12a基因在甘蓝型油菜的根、叶、花芽和花中都有表达,其在花中的表达量最高,而在茎与果荚中没有表达;甘蓝型油菜BnaSOT12a基因在拟南芥中的过表达,能提高转基因植株在发芽和根生长方面对NaCl胁迫的耐受能力,但在盐胁迫下,BnaSOT12a的磺酸化作用并不影响拟南芥中抗病途径的信号传导,与抗病途径无关。     

不结球白菜BrCDF1的功能研究

[目的]本文旨在研究不结球白菜Br CDF1基因的功能,验证其与CO启动子之间的调控关系,以及其在植物抽薹开花中所起的作用。[方法]以不结球白菜‘苏州青’为材料,采用酵母单杂交技术,验证Br CDF1转录因子与CO启动子是否能够结合;构建过表达载体p Early Gate101-Br CDF1,利用农杆菌介导法将过表达载体导入拟南芥中,筛选阳性苗,同时对阳性苗进行Western blot检测,观察转基因植株的表型变化;采用RT-q PCR技术,检测Br CDF1、CO、FT基因在转基因和野生型植株中不同时间点的相对表达量。[结果]酵母单杂交和β-半乳糖苷酶试验分析结果显示,Br CDF1转录因子和CO启动子之间具有较高的结合活性。Western blot检测结果表明:转基因拟南芥植株中的Br CDF1蛋白成功表达。RT-q PCR结果表明,Br CDF1基因在转基因植株中的相对表达量比野生型植株高;CO、FT基因在转基因植株中的相对表达量比野生型低,同时Br CDF1过表达植株较野生型开花晚。[结论]Br CDF1转录因子能与CO启动子结合,从而抑制CO、FT基因的表达,进而影响不结球白菜光周期开花途径。     

甘蓝型油菜R2/R3型MYB转录因子BnPAP2a介导花青素累积研究

【目的】探讨甘蓝型油菜R2/R3型MYB转录因子BnPAP2a对花青素累积的作用,为富含花青素油菜的培育提供理论指导。【方法】在全基因组水平系统鉴定甘蓝型油菜PAP1、PAP2亚家族R2/R3型MYB转录因子同源基因。利用BnTIR网站、BRAD网站和GSDS等软件对鉴定所得基因的结构、蛋白序列和组织表达谱进行分析。采用RT-PCR方法从“中双11”cDNA中扩增BnPAP2a基因,并构建35S启动子驱动的植物表达载体35S-pHZM27-BnPAP2a-mGFP,将其转染拟南芥,用显微成像法进行转基因株系种子与幼苗花青素累积表型分析;采用分光光度法测算转基因株系幼苗花青素水平;采用荧光成像技术考察转基因株系中BnPAP2a的亚细胞定位。【结果】成功地在甘蓝型油菜中鉴定到9个PAP1、PAP2亚家族R2/R3型MYB转录因子同源基因,分别为BnPAP1a,BnPAP1b,BnPAP1c,BnPAP1d,BnPAP1e,BnPAP1f,BnPAP1g,BnPAP2a,BnPAP2b。基因结构分析结果显示,拟南芥、白菜、甘蓝和甘蓝型油菜的MYB转录因子同源基因大都含有3个外显子和2个内含子。基因组织表达谱分析表明,BnPAP2a在叶片、花、花蕾、果荚中均有表达但其表达水平不高。成功构建了35S-pHZM27-BnPAP2a-mGFP载体,转染后获得了转基因拟南芥植株。过量表达BnPAP2a基因可使拟南芥种皮由黄褐色转变成紫黑色,幼苗叶片由绿色变为紫色,花青素含量极显著增加。激光共聚焦显微镜下观察发现,过表达BnPAP2a植株GFP荧光信号主要集中在细胞核中。【结论】BnPAP2a为功能性的细胞核定位R2/R3型MYB转录因子,具有促进花青素形成的作用,可利用其培育富含花青素的油菜新材料。     

小麦RF2类bZIP转录因子TabZIP3参与植物盐胁迫反应

植物bZIP类转录因子数目众多,功能多样,但有关RF2类bZIP转录因子的报道并不多见。以普通小麦(Triticum aestivum L.)中国春叶片总RNA为模板,利用RT-PCR结合RACE(rapid amplication of c DNA end)技术,获得了TabZIP3的cDNA序列。TabZIP3基因的开放阅读框(ORF)长1 020 bp,编码339个氨基酸残基,保守结构域预测TabZIP3编码RF2类bZIP转录因子。系统发育分析表明,TabZIP3与水稻中的RF2b亲缘关系最近; GFP-TabZIP3融合蛋白在烟草表皮细胞中定位于细胞膜。RT-PCR分析以及对TabZIP3promoter:Gus转基因拟南芥植株的Gus染色结果均表明,TabZIP3受Na Cl和PEG6000处理的诱导表达。为了研究TabZIP3的功能,构建了TabZIP3的过量表达载体并将其转化拟南芥Col-0。与野生型相比,过量表达TabZIP3的拟南芥株系的子叶在含150 mmol/L NaCl的MS培养基上更绿,且脯氨酸含量显著增加,但丙二醛含量显著下降。上述结果表明小麦RF2类bZIP转录因子TabZIP3受盐/干旱诱导表达,其过量表达提高了转基因拟南芥的耐盐性。     

二穗短柄草DREB1G基因表达模式分析和在拟南芥中的异源过量表达

CBF/DREB基因是一类植物特异性转录因子,通过调控下游抗逆相关基因的表达,在植物逆境胁迫应答过程中发挥重要作用。为了研究新型的禾本科模式植物二穗短柄草DREB基因的功能,克隆BdDREB1G的cDNA序列,分析该基因在各种非生物胁迫条件下的表达,构建过表达载体,获得转基因拟南芥。结果表明:高温、低温和水杨酸胁迫处理显著诱导BdDREB1G的表达,暗示该基因响应高温和低温胁迫。初步观察结果说明,该与野生型拟南芥相比,转基因植株生长发育迟缓。这些为研究该基因响应非生物胁迫的功能奠定基础。     

不结球白菜硝酸还原酶基因BcNR的克隆及其在拟南芥中的转化

 【目的】克隆不结球白菜硝酸还原酶基因（BcNR ）,并转化拟南芥做初步的功能鉴定。【方法】采用分段RT-PCR及3′RACE和5′RACE技术克隆了BcNR基因的全长cDNA,利用生物信息学方法进行序列分析和蛋白结构分析。构建pCAM-BcNR植物过量表达载体,通过农杆菌介导的真空渗透法将其转入野生拟南芥中,经抗性筛选及PCR验证获得T0代转基因植株,用Real-time PCR方法对30 mmol?L-1 KNO3溶液处理的转基因拟南芥的硝酸还原酶基因表达进行检测,并测定转基因植株的硝酸还原酶活性。【结果】获得了编码不结球白菜硝酸还原酶基因(BcNR )的cDNA全序列3 049 bp,包含有2 733 bp的开放阅读框,编码910个氨基酸。其氨基酸序列与拟南芥、烟草、甘蓝型油菜、马铃薯等编码的氨基酸序列具有较高同源性。蛋白质结构域分析表明,所推导的氨基酸序列具有完整的硝酸还原酶结构,同时证明从不结球白菜中克隆的这条基因属于NADH-NR型。GenBank登录号为EU662272。转基因拟南芥T0代植株进行GUS基因PCR检测,证明重组质粒已整合到转基因植株基因组中。硝酸盐处理后的转基因植株硝酸还原酶基因的表达比野生型显著提高,且硝酸还原酶活性有不同程度的提高。【结论】本研究首次从不结球白菜中克隆获得BcNR基因的全长cDNA序列,揭示了其序列特征并对其进行了初步的功能鉴定,为进一步利用该基因开展蔬菜硝酸盐含量的基因调控研究奠定了基础。     

3种植物Ran基因的克隆及序列分析(摘要)(英文)

[目的]研究洋葱、大蒜和油菜中Ran基因与拟南芥Ran2基因的同源性,以确定3种植物材料能否作为拟南芥的替代材料研究Ran定位。[方法]采用RT-PCR方法,以拟南芥Ran2的引物分别从洋葱、大蒜和油菜分裂细胞提取的总RNA中扩增出相应片段DNA(AcRan,AsRan,BnRan),经凝胶电泳回收相应PCR产物,克隆到pMD18-T载体上,转化到DH5α中,抽提质粒,经酶切、PCR鉴定确定阳性克隆,将阳性克隆的菌体进行测序、比对分析。[结果]洋葱、大蒜和油菜的Ran基因开放阅读框分别为666、663和666bp;分别编码221、220和221个氨基酸,分子量约24.3kD;与拟南芥AtRan2氨基酸序列同源性分别为99.1%、100%(除末端缺少1个天冬氨酸D外)和96.4%;进化树分析显示洋葱和大蒜Ran基因与拟南芥进化关系更近,其根尖可代替拟南芥根尖研究Ran基因的定位或相关生物学功能。将该实验克隆的3种植物Ran基因序列与收集的14种植物的Ran序列共28种进行氨基酸同源性比对及进化树分析表明,高等植物Ran基因绝大多数在进化树中处于同一位置,同源性高达90%以上(拟南芥AtRan4和水稻OsRan4例外),因此,它们可能在植物细胞分裂过程中起着相似的作用;且3种植物在受动结合域(EBD)和酸性末端(AT)存在不同;而拟南芥AtRan4缺少这2个功能域,可能与AtRan1～3具有不同的作用。[结论]为进一步研究植物Ran基因的生物学功能奠定了基础。     

芥蓝(Brassica alboglabra)苯丙氨酸解氨酶基因BaPAL的克隆、表达与序列分析

根据NCBI数据库中拟南芥、甘蓝型油菜和菘蓝的苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonialyase,PAL)基因序列设计简并引物,从芥蓝叶片cDNA中克隆到1个PAL基因,定名为BaPAL.BaPAL编码区全长2 145 bp,编码714个氨基酸,在NCBI的登录号为FJ849059.半定量RT-PCR结果表明,BaPAL基因在茎、叶、花蕾、开放花朵和嫩角果中均有表达,而且以开放花朵的表达量最大,根中未能检测到.BaPAL与其他植物PAL序列比对的结果表明:芥蓝与甘蓝型油菜、白菜的关系最为接近,与同科的菘蓝和拟南芥的关系稍远,但它们都处于同一进化分支;跟蕨类植物的同源性最低,亲缘关系最远.     

不结球白菜BrCOR14基因cDNA全序列克隆及结构特征分析

通过设计保守的基因特异引物,运用RT-PCR、RACE技术从不结球白菜中获得1个抗寒相关基因,命名为BrCOR14,登录号为DQ192529,cDNA全长549 bp,含有387 bp的完整开放阅读框,编码128个氨基酸.该基因编码的氨基酸序列与油菜、拟南芥、荠菜编码的氨基酸序列有极高的同源性.     

花分生组织决定基因APETALA1转化油菜

拟南芥的APETALA1(AP1)是花分生组织的决定基因,同时也是萼片和花瓣正常发育的控制因子.本研究构建了含有AP1基因的植物表达载体PCAP,启动子为CaMV 35S,通过农杆菌侵染法转化油菜.用PCR方法对转基因植株进行了DNA和RNA水平上的分子检测,证明AP1基因已经整合到转基因植株的基因组中,并且得到了有效的表达.获得的转基因植株也表现出提前开花的特性.试验结果表明,AP1基因在促进成花方面的关键作用不具有种属特异性,利用基因工程可以快速高效地进行油菜早熟性的遗传改良.     

不结球白菜BrCBF基因cDNA全序列克隆及结构特征分析

运用RT-PCR和RACE技术从不结球白菜中克隆到1个抗寒相关基因,命名为BrCBF,基因登陆号为DQ402470.其cDNA全长1 003 bp,含有648 bp的完整开放阅读框,编码216个氨基酸,该基因编码的蛋白序列与拟南芥、荠菜、甘蓝型油菜编码的氨基酸序列有极高的同源性,且具有CBF典型的保守结构域AP2.     

甘蓝型油菜生物节律钟输出基因BnGI的克隆和表达分析

利用同源克隆的方法,以拟南芥GIGANTEA基因为种子序列,在甘蓝型油菜中克隆得到GI基因,命名为BnGI。序列分析结果表明:该基因编码区全长为3 516bp,编码1 171个氨基酸,与白菜GI基因序列同源性达99%,与拟南芥GI基因同源性达87%。成熟蛋白的等电点为6.59,分子量为127.15kDa,亚细胞定位预测在细胞核定位。荧光半定量检测结果表明:BnGI基因在根、茎、顶端分生组织、叶、花等中均有表达,但表达水平具有组织特异性。     

苎麻NAD7基因的克隆与分析

线粒体中泛醌氧化还原酶的7亚基基因(NAD7)是与植物呼吸代谢和植物细胞质雄性不育相关的重要基因之一。本研究利用NAD7的保守序列设计引物,用RT-PCR方法克隆了苎麻(Boehmeria nivea)NAD7的cDNA片段,其长度为969 bp,编码322个氨基酸。序列比对表明该cDNA序列及预测的蛋白序列与拟南芥、油菜有98%的同源性。聚类分析表明苎麻NAD7基因的进化处在很古老的地位。为深入研究苎麻雄性不育的分子生物学机理提供依据。     

甘蓝型油菜BnEIN3基因克隆及菌核病诱导表达

[目的]探讨甘蓝型油菜EIN3（BnEIN3）基因与菌核病抗性的关系。[方法]根据GenBank中已公布的拟南芥EIN-3基因的保守区及甘蓝型油菜EST序列,设计特异性引物,分别进行基因组PCR和RT-PCR扩增,克隆BnEIN3基因。对菌核病不同抗性的3个油菜品种中BnEIN3的表达进行荧光定量PCR检测分析。[结果]克隆得到1947bp的基因片段,与拟南芥EIN3一致性高达82%,有完整的开放阅码框,编码614个氨基酸,其中包含1个EIN3结构域,初步认定该片段为油菜BnEIN3基因。在高抗品种（D083）中,菌核病在侵染后期快速诱导BnEIN3上调表达,且显著高于中抗（中双9号）及高感品种（84039）中该基因的表达水平。在中抗及高感品种中,菌核病均抑制BnEIN3的表达,且中抗品种BnEIN3表达量一直大于高感品种。[结论]BnEIN3可能与油菜对菌核病抗性相关。     

甘蓝型油菜ADC基因片段的克隆及序列分析

[目的]克隆甘蓝型油菜精氨酸脱羧酶(ADC)基因的cDNA片段,为进一步获得ADC基因全长及研究其的生物学功能奠定基础.[方法]以甘蓝型油菜(Brassica napus L.)品种中双6号的花蕾为材料,设计简并引物,采用同源克隆法扩增ADC基因的cDNA片段.[结果]成功扩增获得8个不同的ADC基因拷贝,按长度将其分为1011、999、981 bp 3类,8个拷贝核苷酸序列之间的同源性为81%~99%,其推导氨基酸序列之间的同源性为86%~99%.1011 bp片段包含3种不同的序列S1 ~S3,序列间存在9个单核苷酸多态性(SNP)位点.999 bp序列包含S4和S5,具有3个SNP位点,两个区段出现连续碱基缺失.981 bp序列包含S6~S8,发现14个SNP位点,且第67位核苷酸出现无义突变,4个区段发生碱基缺失.序列S4~S8共同缺失第632~634、642~650位的核苷酸小片段.氨基酸同源比对和系统进化分析结果表明,8个不同ADC基因拷贝与芥菜(Brassica juncea L.)、拟南芥(Arabidopsis thaliana L.)、盐芥(Thellungiella halophila L.)等物种的ADC基因同源性高,亲缘关系近.[结论]所获得的8个基因拷贝即为来自于甘蓝型油菜ADC基因的片段.