耐热β-木糖苷酶的可溶性表达及其应用

紫杉醇作为一种具有突出药用价值的天然抗癌药物,其在红豆杉属植物中的含量极少,且已有的紫杉醇制备方法难以满足商业需求,因此酶法制备紫杉醇的研究受到越来越多的关注.通过β-木糖苷酶水解紫杉醇类似物7-木糖-10-去乙酰基紫杉醇(7-XDT)得到10-去乙酰基紫杉醇(10-DT),再进一步被乙酰基转移酶催化变成紫杉醇,此双酶...     

β-木糖苷酶的研究进展

综述了β-木糖苷酶的性质、结构、催化机制和基因工程等方面的研究进展,并展望了该研究在能源工业、造纸工业和医药工业上的应用前景.     

Penidiella sp.HEY-1β-葡萄糖苷酶的分离纯化及其酶学性质

通过Penidiella sp.HEY-1发酵豆渣可制备产胞外β-葡萄糖苷酶(BGL).粗酶液经过乙醇沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析和Sephadex G-100凝胶过滤层析等步骤后获得了凝胶电泳均一的BGL.通过SDS-PAGE测得其分子质量为65.5 ku.该酶反应的最适温度为6...     

Penidiella sp. HEY-1β-葡萄糖苷酶的分离纯化及其酶学性质

通过Penidiella sp. HEY-1发酵豆渣可制备产胞外β-葡萄糖苷酶(BGL)。粗酶液经过乙醇沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析和Sephadex G-100凝胶过滤层析等步骤后获得了凝胶电泳均一的BGL。通过SDS-PAGE测得其分子质量为65.5 ku。该酶反应的最适温度为60~70℃,最适pH值为3.0,在70℃以下及pH值2.0~8.0范围内均能保持稳定。Mn2+对酶有激活作用,而Na+对酶有抑制作用,其他金属离子对酶的活性影响不大。底物专一性实验表明,该酶可作用于对硝基苯-β-D-葡萄糖苷(p-NPGlu)、邻硝基苯-β-D-半乳糖苷(o-NPG)。作用于p-NPGlu和o-NPG的米氏常数(Km)值分别为0.434和0.411 mmol/L,酶促反应的最大速度(vmax)分别为1.0×10-3和3.3×10-4mol/(L.min)。     

β-葡萄糖苷酶的制备及在纤维素辅助水解上的应用研究

研究了固体发酵法制备β-葡萄糖苷酶及其在纤维素水解上的应用.黑曲霉NL02以玉米芯和麸皮为碳源固体发酵制备β-葡萄糖苷酶,培养5d,酶活力达到225.43IU/g(以干曲计).粗β-葡萄糖苷酶酶液经硫酸铵沉淀、离子交换层析、凝胶过滤层析纯化,获得单一β-葡萄糖苷酶组分,酶活回收率和比活力分别为69.34%和133.88IU/mg.底物质量浓度为100g/L的稀硫酸预处理玉米秸秆,经酶用量为20FPIU/g(以纤维素计)的里氏木霉纤维素酶和4IU/g(以纤维素计)的β-葡萄糖苷酶水解48h,水解糖液中纤维二糖和葡萄糖质量浓度分别为1.12和42.68g/L,纤维素水解得率和可发酵性糖的比例分别为62.85%和97.44%.     

重组木聚糖酶的诱导表达及其定向制备低聚木糖的研究

为降低酶法制备低聚木糖的成本并提高产品纯度,围绕重组木聚糖酶的诱导表达条件和酶水解木聚糖的工艺参数进行研究,考察了诱导剂浓度、诱导温度、诱导光密度(OD₆₀₀)值和诱导时间等因素对重组大肠杆菌(pTrc99A-podoxyn11-DE3)产重组木聚糖酶的影响,针对酶水解过程中酶用量、酶水解时间及产物分布情况进行了探讨。结果表明:在诱导剂浓度5 mmol/L,诱导温度32℃,诱导OD₆₀₀值1.2,诱导时间8 h的最佳诱导条件下,重组酶酶活力可达5.72 U/mL。玉米芯木聚糖质量浓度20 g/L,温度45℃,pH值5.5,重组木聚糖酶用量为60 U/g条件下水解12 h,酶解率可达49.90%,低聚木糖得率21.75%。杨木木聚糖质量浓度20 g/L,温度45℃,pH值5.5,重组木聚糖酶用量35 U/g条件下水解14 h,酶解率可达79.50%,低聚木糖得率73.30%。重组酶水解两种木聚糖的主要产物均为木二糖和木三糖,几乎不产生木糖。     

桑树景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶基因的克隆、原核表达与植物表达载体的构建

景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶(SBPase)是卡尔文循环过程中的关键酶.利用RACE技术得到景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶基因全长cDNA,命名为MSBPase(GenBank登录号;DQ995346).MSBPase全长为1 527 bp,该序列含有1个1 179 bp的完整开放读码框,编码393个氨基酸,蛋白质理论分子质量约为42.6 ku,等电点为5.85,其氨基酸序列与其他植物中已分离的SBPase有很高的同源性.对MSBPase编码的蛋白质(命名为MSBPase)进行结构预测分析表明,该蛋白富含无规卷曲(coil),高达64.29%,其次是α-螺旋(helix),为22.19%,而β-折叠(strand)只有13.52%.将MSBPase编码区插入原核表达载体pET30a( ),并转化到大肠杆菌菌株 BL21中,经过IPTG诱导,MSBPase融合蛋白在BL21菌株中成功表达.将得到的MSBPase编码区插入植物表达载体pBI121中,构建了MSBPase植物表达载体pBI121.SBP.     

黑曲霉发酵豆渣产酸性β-葡萄糖苷酶及其水解京尼平苷的性质

利用单因素、正交试验考察了黑曲霉L菌株发酵豆渣产β-葡萄糖苷酶的条件和酶解京尼平苷的特性.结果表明:2%豆渣适宜作为实验菌株液体发酵产酶培养基,当培养基中接种孢子浓度大于每毫升2 x 105个时,菌株产酶受发酵温度、装液量的影响显著,而不受接种量、摇床转速的影响,培养基初始pH值1.5时,菌株仍能正常产酶;优化的产酶培...     

超滤和丙酮沉淀法回收纤维二糖水解液中β-葡萄糖苷酶的研究

分别利用超滤和有机溶剂沉淀法对纤维二糖水解液中β-葡萄糖苷酶的回收可行性及其工艺进行了研究.利用膜技术回收时,选用截流分子质量 30 ku 膜比较适宜.连续超滤回收不同批次的纤维二糖酶解液中β-葡萄糖苷酶,第1轮的酶回收率和平均膜通量分别为 99.6 % 和 118.6 L/(m2·h);第20轮回收的β-葡萄糖苷酶为初始加酶量的 90 % 以上,且平均膜通量为 79.2 L/(m2·h).利用丙酮沉淀回收时,丙酮与纤维二糖水解液的体积比值在0.75～1.0比较适宜;温度和沉淀时间对酶的回收率影响很大.用 -20 ℃丙酮沉淀 2 h,酶回收率为 95.7 %,连续沉淀回收不同批次的纤维二糖酶解液中β-葡萄糖苷酶时,第15轮的酶回收率仍能维持在 50 % 左右,可节省所需酶量的 79 %.     

黑曲霉发酵豆渣产酸性β-葡萄糖苷酶及其水解京尼平苷的性质

利用单因素、正交试验考察了黑曲霉L菌株发酵豆渣产β-葡萄糖苷酶的条件和酶解京尼平苷的特性。结果表明:2%豆渣适宜作为实验菌株液体发酵产酶培养基,当培养基中接种孢子浓度大于每毫升2×105个时,菌株产酶受发酵温度、装液量的影响显著,而不受接种量、摇床转速的影响,培养基初始pH值1.5时,菌株仍能正常产酶;优化的产酶培养基组成为豆渣1%、米糠1%和Tween 800.1%,初始pH值5.5;菌株在发酵温度28℃、装液量50 mL(250 mL摇瓶)、摇床转速150 r/min的发酵条件下发酵120 h,发酵液酶活为(200±10)U/mL。所产β-葡萄糖苷酶水解京尼平苷的最适温度为55℃、最适pH值2.5、最佳水解时间15 min;在该条件下酶的表观米氏常数(Km)为1.35 g/L,最大水解速率(Vmax)为26.45 g/(L.min.mg),酶活半衰期为15 min,50℃时大于60 min;酶的水解活性受Na+、Ca2+的显著激活,受Mg2+、Ba2+、Cu2+、Fe2+、Hg+、Zn2+、Mn2+等离子(10 mmol/L)和葡萄糖、乙醇的抑制。     

β-甘露聚糖酶基因的克隆表达及酶学性质

以能水解魔芋葡甘聚糖的野生筛选菌种枯草杆菌A 33为材料,通过PCR技术从A 33基因组中扩增出β-甘露聚糖酶基因编码序列.经过克隆、测序及BLA ST比对分析,证实该基因编码β-甘露聚糖酶,属于β-甘露聚糖酶家族中的一员,该基因已注册G enBank.将该基因克隆到原核表达载体pRSET-A中并转入大肠杆菌表达系统BL 21(DE 3)pLysS,经过诱导获得了此酶的高效表达.其表达量达到37.78 U/mL,酶学特性分析表明其作用的最适pH为5.0,最适温度为60℃.     

黑曲霉胞外耐高糖β-葡萄糖苷酶的分离纯化及部分特性研究

采用硫酸铵盐析、Phenyl Sepharose CL-4B疏水层析、DEAE-Sepharose阴离子交换层析、Sephacryl S-200凝胶过滤层析等步骤,从黑曲霉的发酵液中获得了凝胶电泳均一的两种β-葡萄糖苷酶。其中一种为耐高糖的β-葡萄糖苷酶,葡萄糖抑制系数(Ki)为41.01 mmol/L,纯化倍数和得率分别为56.7倍和22.66%。耐高糖β-葡萄糖苷酶单亚基分子质量为114.6 ku,以对硝基苯酚-β-D-葡萄糖苷(pNPG)为底物时,米氏常数(Km)值和酶促反应的最大速率(vmax)分别为0.904 mmol/L和1.08μmol/min。该酶最适反应温度60℃,最适反应pH值为4.0;在60℃以下及pH值3~7范围内均能保持稳定。所测定的化学试剂中,Ag 对酶具有较强的抑制作用,其它金属离子及乙二胺四乙酸对酶的活性影响不大。甲醇、正丁醇有明显激活酶活性的作用,但乙腈、丙酮对酶的抑制作用明显。