口蹄疫病毒WFL株基因组全长cDNA的克隆及序列分析

根据口蹄疫病毒基因组的结构特点以及GenBank上公布的全序列，用DNAMAN分别设计了涵盖整个基因组序列的3对引物，从接种口蹄疫病毒WFL株的细胞培养液中提取了病毒基因组RNA，采用RT-PCR方法和RACE法分别扩增了3条基因片段，并将扩增片段分别与T载体连接，在体外分别进行了5-半分子和3’半分子的构建。最后将5’半分子和3’半分子连接成基因组全长cDNA分子。经PCR鉴定、酶切鉴定及全长cDNA测序，证实成功构建了口蹄疫病毒wFL株基因组全长eDNA分子。序列分析结果表明，供试口蹄疫病毒基因组全长为8155nt，5＇UTR长1059nt；具有一个大的读码框，其核苷酸长度为6969nt。包括201aa的前导蛋白基因和2122aa的聚合蛋白基因；3＇UTR长127nt，包括34nt的polv（A）。     

中国猪瘟兔化弱毒全基因组cDNA文库的构建和序列分析

根据已发表的猪瘟病毒（CSFV）序列设计并合了26条覆盖全长基因组的套式和半套式PCR引物。应用RT－PCR、Nested PCR和Half-nested PCR技术从试验感染的兔脾中成功地扩增出了各相应的cDNA重叠片段，分别克隆和测序，构建了C株全基因组cDNA文库，采用DNAstar软件对全基因组的核苷酸和氨基酸序列进行了同源性比较分析。CSF C株全基因组cDNA文库的构建为进一步构建全长感染性cDNA奠定了基础。     

猪瘟病毒石门株基因组全长cDNA的克隆与序列分析

参照已发表的猪瘟病毒基因组序列设计合成了9对引物，通过RT-PCR从感染猪瘟病毒的猪全血中扩增得到了覆盖猪瘟病毒石门株基因组全长的9个cDNA片段，将所得片段分别克隆至pOK12载体和pMD18-T载体，经测序和拼接后，获得了猪瘟病毒石门株基因组全序列。序列分析表明，猪瘟病毒石门株基因组全长12297个碱基，含有一个大的开放阅读框架，编码1个由3898个氨基酸残基组成的聚合蛋白，其5’非编码区（5＇UTR）和3’非编码区3’（UTR）分别由373和227个碱基组成，与已发表的2个猪瘟病毒石门株的全序列相比，核苷酸同源性分别为99．4％和99，6％，氨基酸同源性分别为99．4％和99．7％，在3’末端第12133位T碱基发生缺失。比较了27个猪瘟病毒全序列的3’UTR，结果提示12133位碱基T缺失区域可能是猪瘟病毒的高变异区。     

口蹄疫病毒全长cDNA克隆的快速构建

利用RT—PCR和3’cDNA末端快速扩增(RACE)技术分别扩增出包含口蹄疫病毒(FMDV)全基因组的2个重叠cDNA片段，将其分别插入到载体pcDNA3．1zeo( )和pGEM—T—Easy中，然后利用片段本身单一酶切位点将FMDV全长cDNA克隆至pcDNA3．1zeo( )载体，经PCR扩增、酶切鉴定和序列测定。结果表明，重组质粒(pcDNA3．1／FMDV)携带了FMDVOH／99基因组全长cDNA序列。     

猪瘟兔化弱毒疫苗株基因组的遗传变异分析

参照已发表的猪瘟病毒基因组序列设计了9对引物，用RT-PCR从猪瘟兔化弱毒疫苗株细胞培养物中扩增得到了覆盖猪瘟病毒基因组全长的9个cDNA片段，将所得cDNA片段分别克隆至pMD18-T载体中，经测序和拼接后，获得了猪瘟兔化弱毒疫苗株基因组全序列。序列分析表明，猪瘟兔化弱毒疫苗株基因组全长12310个碱基，其5’非编码区（5＇-NCR）和3＇-NCR分别由373和239个碱基组成，在3’末端有富含T的碱基插入，其间为1个大的开放阅读框架，编码3898个氨基酸残基的多聚蛋白，与国内外已发表的另外7个猪瘟兔化弱毒疫苗株基因组全序列相比，核苷酸同源性为98．7％～99．9％，氨基酸同源性为98．6％～99．9％。基因组全序列比较显示，猪瘟兔化弱毒疫苗株基因组在遗传上相当稳定。     

猪瘟弱毒C81株全基因组测序及分子结构预测

参照已发表的猪瘟病毒弱毒株的序列,设计7对覆盖全长基因纽的引物,通过RT-PCR从感染猪瘟病毒弱毒株的PK-15细胞中扩增得到7个cDNA片段,分别克隆到pMD18-T载体并测序,利用DNASIS软件获得猪瘟病毒C81株全基因组序列（GenBank：AY665656）。C81株基因组全长12310nt,只有一个大的开放阅读框,编码3898个氨基酸的聚蛋白。序列分析表明,c81株开放阅读框与其它各毒株核苷酸和氨基酸序列的同源性变化较大,分别为84．4％～99．6％和91．6％～99．4％。同时,我们绘制了26株CSFVORF的进化树,比较了CSFV5’非翻译区核苷酸序列并推测其二级结构,发现不同毒株之间存在较大的差异,另外对C81株聚蛋白的功能域和三维结构进行了预测。     

一步法扩增IBDV上海株全长基因组cDNA

为了研究鸡传染性法氏囊病病毒（IBDV）上海株的全部核苷酸序列，应用蛋白酶K消化、割胶纯化获得了高纯度的dsRNA，应用随机引物合成了cDNA的第一链。参照基因库中相关IBDV毒株的基因序列，设计合成了两对引物，一步扩增出IBDV上海株全长基因组cDNA的A片段和B片段。为了验证获得的A片段和B片段的正确性，以扩增出的A片段为模板，成功扩增出的IBDV的VP2基因，并应用T载体进行了克隆和测序，测序结果显示，其与国内外数株IBDV毒株的同源性很高，表明醉建立的扩增IBDV全长基因组cDNA的一步法正确、可行。     

6株猪O型口蹄疫病毒VP1基因的克隆与序列分析

根据口蹄疫病毒（FMDV）VP1基因的序列，设计并合成了2对用于扩增VP1基因的引物。从组织中提取总RNA，首先用P1、P2引物对6株猪。型口蹄疫病毒进行RT—PCR扩增，获得1000bp的片段；再用P3、P4引物进行巢式PCR扩增，结果获得850bp的片段。将850bp的片段克隆到pMD18—-T载体中，通过PCR鉴定，将阳性重组质粒进行测序并分析。结果发现6株FMDV的核苷酸同源性为80．2％～99．4％，其推导的氨基酸序列同源性为86．9％～99．5％；构建遗传发生树，发现6株FMDV属于两个不同的基因型，其中的Shunde00、Sihui01、Shenzhen99、Fushan01株属一个基因型（与Hongkong93、广东86分离株属同一基因型）；Guangzhou99、Shenzhen00株属另一个基因型（与UKG-12—2001株、JPN2000株属同一基因型）。通过对口蹄疫病毒VP1基因的测序与分析，了解其变异情况，为科学地防控FMD提供分子水平的依据。     

1型鸭肝炎病毒基因组全长cDNA克隆的构建

参考1型鸭肝炎病毒基因组序列,设计7条引物,用RT—PCR方法扩增出覆盖整个病毒基因组三个忠实性片段,并按顺序组装进载体pBR322中,获得全长cDNA克隆。测序结果表明,该克隆与母本毒序列同源性达99．6％,并且5’端的T7启动子和3’端的Mlu I线性化位点均成功引入。     

一株诺如病毒的3’RACE扩增及基因序列分析

诺如病毒是严重危害人类健康的重要食源性病原。作者应用3’RACE(rapid amplification of cDNA 3’ends） 技术对一株诺如病毒分离株的基因组3’末端进行扩增，并对其核苷酸序列进行比较分析，从而可为该病的分子生物学检测提供阳性物质，并从分子水平上推测该病的来源。经过提取病毒总RNA、以3’RACE锚定引物进行反转录、用特异引物进行3’RACE，琼脂糖凝胶电泳检测结果表明成功扩增了诺如病毒基因组约3282 bp的基因片段，测序及序列BLAST分析证实该分离株属GⅡ 4型，与日本分离株同源。3’RACE扩增序列为诺如病毒的实验室检测及深入研究奠定了基础。     

用3''RACE方法扩增并克隆口蹄疫病毒基因组3''末端序列

应用3’RACE方法扩增并克隆了口蹄疫病毒(FMDV)0H99株基因组3’端真实序列。测序结果表明,所扩增的目的基因片段长1500nt,包括3D基因部分序列、3’端非编码区(Non—Coding Region,NCR)和Poly(A)尾巴,其中3’NCR位于终止密码子TAA之后,长93nt,Poly(A)尾序列至少含有56个A。与参考毒株进行序列比较,结果显示,OH99株与0TY TW／97株的核苷酸同源性较高,为91．4％,而与O1K、CHINA99、A12等毒株的核苷酸同源性较低,其同源性分别为68．1％、71．0％、70．2％。3’NCR的末端存在保守性较高的基序：CCCTCAGATG,TTTTCCC—CGCTTCCT。本研究为进一步研究FMDV基因组的功能、构建OH99株的反向遗传操作系统奠定了基础。     

口蹄疫病毒Asial/JS/China/2005株基因组全长感染性克隆的构建

利用长距离RT-PCR技术扩增病毒基因组3'端覆盖口蹄疫病毒Asial/JS/China/2005株近全长的3个片段(共约7.5 kb),并利用单一酶切位点将其分别克隆到pBlueseriptSK+载体上.利用融合PCR扩增到基因组5'端含有15个C碱基的基因片段(约700 bp),并将其连接至pGEM-T载体.最后将这4个片段的阳性克隆装配至剔除T7启动子的低拷贝载体pcDNA3.1/Zeo(+)中构建该病毒株的全长cDNA克隆.以构建的FMDV Asial/JS/China/2005株全长cDNA为模板,使用TTRNA聚合酶在体外转录得到病毒RNA,通过脂质体将其导入BHK细胞获得拯救病毒.对收获的病毒分别用RT-PCR、间接免疫荧光、电子显微镜观察和乳鼠致病性分析结果证实,通过体外转录获得了具有感染性的口蹄疫病毒.该株感染性克隆的构建为深入研究口蹄疫病毒的致病机制及研制新型疫苗等奠定了基础.     

鸡传染性支气管炎病毒H120疫苗株全长cDNA感染性克隆的构建

根据鸡传染性支气管炎病毒(IBV)H120疫苗株的全基因组序列设计引物,采用RT-PCR方法对其基因组分10个片段进行扩增,并克隆至pMD19-T载体中进行测序。经BsaⅠ限制性内切酶酶切后,采用优化的连接策略将各DNA片段进行连接,获取H120株的基因组全长cDNA,其5′端具有完整的T7RNA聚合酶启动子的核心序列,3′端具有polyA尾巴结构。通过T7RNA聚合酶体外转录系统合成病毒基因组RNA,转染BHK-21细胞并进行病毒拯救。采用RT-PCR、测序及鸡胚传代对拯救出的病毒株进行鉴定。结果表明成功地从H120株的基因组全长cDNA拯救出病毒H120-R株,为进一步开展该病毒的分子致病机理研究、新型疫苗的研制等奠定了基础。     

猪源副黏病毒JL-1株全基因获得及遗传变异分析

利用本实验室分离保存的猪源副黏病毒JL-1株来提取病毒基因组RNA.参考GenBank发表的相关禽副粘病毒Ⅰ型(Avian paramyxovirus serotype 1,APMV-1)基因组序列,设计了8对特异性引物,RT-PCR法分别特异性的扩增出病毒各基因片段,并将各目的基因片段回收纯化,将纯化后的PCR产物进行测序.测定结果得到NP、P、M、F、HN、La、Lb、Lc 8段基因序列,利用DNAMAN软件进行拼接得到基因组全长cDNA序列(GenBank登录号:EU546165).序列分析结果表明,PPMV JL-1株与各地代表株核苷酸同源性87.85%～99.78%,与鹅源新城疫(GPMV)ZJ-1、NA-1株核苷酸同源性分别为83.31%、83.46%,同时根据各毒株F基因开放阅读框前389个核苷酸序列绘制出系统发育进化树,结果表明PPMV JL-1株与LaSota同属于基因Ⅱ型,不同于基因Ⅶ型的ZJ-1和NA-1株的鹅源毒株.     

用3′RACE方法扩增并克隆口蹄疫病毒基因组3′末端序列

应用 3′RACE方法扩增并克隆了口蹄疫病毒 ( FMDV) OH99株基因组 3′端真实序列。测序结果表明 ,所扩增的目的基因片段长 15 0 0 nt,包括 3D基因部分序列、3′端非编码区 ( Non- Coding Region,NCR)和 Poly( A)尾巴 ,其中 3′NCR位于终止密码子 TAA之后 ,长 93nt,Poly( A)尾序列至少含有 5 6个 A。与参考毒株进行序列比较 ,结果显示 ,OH99株与 OTY TW/ 97株的核苷酸同源性较高 ,为 91.4 % ,而与 O1K、CHINA99、A12等毒株的核苷酸同源性较低 ,其同源性分别为 6 8.1%、71.0 %、70 .2 %。 3′NCR的末端存在保守性较高的基序 :CCCTCAGATG,TTTTCCC-CGCTTCCT。本研究为进一步研究 FMDV基因组的功能、构建 OH99株的反向遗传操作系统奠定了基础。     

内源性绵羊肺腺瘤病毒全基因组序列测定与序列分析

参照内源性绵羊肺腺瘤病毒株enJSRV-20全基因组序列设计合成3对引物,应用PCR技术扩增内源性绵羊肺腺瘤病毒基因片段分别连接pMD-18T载体并测序,完成了内源性绵羊反转录病毒基因组序列测定。分析结果显示,测定序列全长7519bp,与内源性绵羊肺腺瘤病毒代表株enJSRV-20核苷酸同源性为99．4％,与外源性绵羊肺腺瘤病毒代表株AF357971．1的核苷酸同源性为90．4％。基于全基因组序列核苷酸的系统进化发生树分析结果显示,扩增序列与enJSRV-20的亲缘关系最近。     

应用Gibson Assembly方法构建狂犬病病毒SRV9株重组感染性cDNA克隆

应用Gibson Assembly连接法精确快速构建狂犬病病毒SRV9株重组感染性cDNA克隆,为狂犬病病毒感染性cDNA克隆的构建提供新的方法。应用Gibson Assembly连接法在同一反应体系内,将多个片段和经限制性内切酶线性化的载体,按设计的顺序进行连接,实现多个片段的一步组装。设计带有20bp~30bp重叠序列的PCR引物,扩增得到带有重叠序列的狂犬病病毒5个结构蛋白基因和增强型荧光蛋白基因。扩增的片段和线性化的载体经胶回收纯化后,与Gibson连接液混合后,50℃反应60min,连接产物转化Stbl3感受态细胞,提取重组质粒,经PCR、酶切和测序鉴定,缺失了病毒伪基因Ψ区和糖蛋白基因的跨膜区并且将增强型荧光蛋白基因插入糖蛋白基因终止密码子前,构建了全长17 600bp的重组质粒,完成了重组全长感染性cDNA克隆的构建。