天祝白牦牛Lfcin基因克隆及生物信息学分析

利用PCR技术从天祝白牦牛基因组DNA中获得乳铁蛋白素(Lactoferricin,Lfcin)基因序列,将Lfcin基因连接于pGEM-T easy载体进行测序后,与奶牛的Lfcin基因序列进行比对;对牦牛、奶牛、人、小鼠等物种的Lfcin蛋白序列进行比对和进化树分析.结果表明:克隆获得了含天祝白牦牛乳铁蛋白第二外显子的DNA序列,共778 bp,其中Lfcin基因编码区长75 bp,编码25个氨基酸;序列分析显示,克隆获得的牦牛DNA序列与奶牛该序列存在9个碱基的变异,其中Lfcin基因编码区内有1个变异,为同义突变;牦牛和奶牛的Lfcin蛋白质序列完全相同,各物种Lfcin蛋白具有较高的同源性.     

天祝白牦牛金属硫蛋白基因的克隆及表达

运用RT-PCR和RACE(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术获得天祝白牦牛金属硫蛋白(MT-2)基因全长cDNA序列,对其生物学进行分析,并通过荧光定量PCR双标准曲线法和2-ΔΔct法建立检测MT-2基因表达的方法.结果表明:扩增获得的天祝白牦牛MT-2基因全长为410bp(GenBank登录号:KF888633),ORF长185bp,编码61个氨基酸.该基因无跨膜结构,为非分泌型蛋白.构建系统进化树结果显示,天祝白牦牛MT-2基因在不同物种以及进化的过程中具有高度保守性,与黄牛和羊的亲缘关系最近.荧光定量PCR结果表明,双标准曲线法特异性强、灵敏度高、稳定性好,对天祝白牦牛MT-2的定量检测具有重要意义.     

牦牛POMC基因的克隆及生物信息学分析

为探讨工布江达牦牛POMC基因的分子结构特征,通过分子克隆技术获得工布江达牦牛POMC基因全序列,采用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白的基本理化性质、疏水性、信号肽、二级结构等进行预测与分析。结果表明,工布江达牦牛POMC基因包含1个798bp的开放阅读框,编码265个氨基酸,其编码蛋白属于亲水性蛋白,具有明显的信号肽,二级结构主要以无规卷曲和α-螺旋为主。以POMC基因构建的邻接系统发育树表明,工布江达牦牛POMC与野牦牛、普通黄牛、水牛和羊等品种的POMC遗传距离较近,具有高度同源性。     

天祝白牦牛MSTN基因编码区克隆及生物信息学分析

为探讨天祝白牦牛MSTN基因的分子结构特征,通过PCR扩增和测序技术以及生物信息学分析工具对天祝白牦牛MSTN基因进行克隆、测序及相关生物信息学分析。结果表明,天祝白牦牛MSTN基因编码区序列全长1 128 bp,编码375个氨基酸残基;天祝白牦牛MSTN基因编码蛋白分子量42.55 ku,理论等电点为6.14;生物信息学预测发现,天祝白牦牛MSTN蛋白是不稳定的亲水蛋白,mRNA二级结构的最小自由能为-1 135.16 k J·mol~(-1),蛋白质二、三级结构均是以无规卷曲和延伸链为主的混合型蛋白。天祝白牦牛MSTN基因的成功克隆为进一步研究牦牛MSTN的遗传特性和生理机制奠定了基础。     

甘南牦牛CYGB基因的克隆及生物信息学分析

【目的】探讨甘南牦牛CYGB基因的分子结构特征及生理功能。【方法】提取甘南牦牛血样基因组DNA,以其为模板PCR分段扩增后拼接得到CYGB基因,测序后进行生物信息学分析。【结果】克隆出甘南牦牛CYGB基因,其长度为8 484bp,含有4个外显子和3个内含子,外显子长度分别为143,232,164和34bp,内含子长度分别为5 175,280和2 379bp,可编码190个氨基酸残基,氨基酸编码存在明显的密码子偏倚现象。与普通牛相比较,甘南牦牛CYGB基因存在73处核苷酸变异位点,其中2处发生在外显子2区域,氨基酸序列未发生改变;71处发生在内含子区域。甘南牦牛CYGB拥有"three-over-three"类型的螺旋"三明治"折叠结构。系统发育树分析表明,甘南牦牛CYGB与黄牛、绵羊等物种之间存在较高的同源性。【结论】成功克隆了甘南牦牛CYGB基因,为进一步研究牦牛CYGB的遗传特性和生理机制奠定了基础。     

天祝白牦牛IGF-1基因克隆、生物信息学及差异表达分析

旨在获得天祝白牦牛 IGF-1基因序列,分析其分子结构特征及在牦牛毛囊发育周期中的表达规律,为解析白牦牛毛囊发育及被毛生长提供理论依据。以天祝白牦牛体侧皮肤为试验材料,通过PCR扩增及测序技术克隆 IGF-1基因CDS区序列,并与黄牛序列比对,进行生物信息学分析;采用实时荧光定量PCR(qPCR)技术检测天祝白牦牛毛囊发育不同时期 IGF-1基因的mRNA表达水平。结果表明,天祝白牦牛 IGF-1基因的CDS区长465 bp,编码154个氨基酸; IGF-1基因编码蛋白的分子质量为17 065. 81 ku,理论等电点为9.36;蛋白质二级结构以无规卷曲(57.79%)和α-螺旋(27.27%)为主,序列分析表明,天祝白牦牛IGF-1蛋白为不稳定亲水蛋白;qPCR检测结果表明, IGF-1基因在牦牛毛囊发育的生长期、退行期和休止期均有表达,生长期和退行期表达量显著高于休止期。     

天祝白牦牛LF基因克隆及分子特征

 【目的】哺乳动物乳铁蛋白（Lactoferrin,LF）在抗菌、抗病毒、抗肿瘤、调节免疫等方面起着重要作用。本试验对天祝白牦牛乳铁蛋白基因的编码区进行克隆和分子特征分析。【方法】以处于干乳期的天祝白牦牛乳腺组织为材料,通过RT-PCR克隆了包含LF基因编码区的cDNA序列（GenBank收录号为EU547252）;将克隆获得的天祝白牦牛LF基因的cDNA与奶牛相应序列进行比对;对天祝白牦牛LF蛋白（GenBank收录号为ACB29795）与其它物种LF蛋白进行序列比对和进化树分析;对牦牛LF蛋白的特性和结构进行预测。【结果】克隆获得天祝白牦牛LF基因cDNA片段长度为2 344 bp,其中LF基因编码区全长2 124 bp,编码708个氨基酸;序列分析显示,克隆获得的牦牛cDNA序列与奶牛该序列存在15个碱基的变异,其中位于LF基因编码区的变异有12个,这些突变造成4个氨基酸变异;天祝白牦牛LF蛋白与奶牛、人、小鼠、山羊、绵羊、猪、狗、马、骆驼、猩猩、鸡LF蛋白氨基酸相似度分别为99.4%、69.5%、63.5%、92.4%、91.5%、72.9%、69.1%、72.6%、75.3%、69.5%和50.9%;各物种LF蛋白进化树符合物种进化规律;同源建模预测LF 3D模型显示,LF为多肽链在二级结构基础上折叠形成2个极相似的、对称的球状叶,即N叶和C叶,中间由1段对蛋白酶敏感的α-螺旋连接,呈“二枚银杏叶型”结构。【结论】从天祝白牦牛克隆获得LF基因编码区全长序列并揭示了其分子特征,为牦牛LF蛋白基因工程和蛋白质功能的研究奠定了基础。     

天祝白牦牛饲草致病菌分析

以天祝白牦牛的饲草为对象,定量研究了天祝县石门、炭山岭、松山、西大滩、抓喜秀龙 5 个地点的白牦牛饲草(夏秋牧草、冬春牧草)中志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、病原性大肠艾希氏菌、沙门氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、空肠弯曲菌 7 种消化道致病菌的污染情况,并分析了造成白牦牛饲草料污染的 7 种致病菌。夏秋牧草中各种消化道致病菌检出率顺序为:志贺氏菌(41.24 %)>金黄色葡萄球菌(12.19 %)>沙门氏菌(7.32 %)>病原性大肠艾希氏菌(4.88 %),而小肠结肠炎耶尔森氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、空肠弯曲菌未检出;冬春牧草中致病菌的检出率顺序为:志贺氏菌(10.25 %)>金黄色葡萄球菌(7.69 %),而病原性大肠艾希氏菌、沙门氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、空肠弯曲菌均未检出。5 个采样点中,夏秋牧草中 7种消化道致病菌总体污染程度为石门(100.00%)>炭山岭(62.5%)>松山(60.00%)>西大滩(14.28%)>抓喜秀龙(0);冬春牧草总体污染程度为炭山岭(33.33 %)>石门(28.57 %)、松山( 25.00 %)>西大滩(0)、抓喜秀龙(0)。致病菌污染夏秋季高于冬春季。天祝白牦牛饲草已经存在轻度致病菌污染.     

麦洼牦牛NPM1基因的克隆及生物信息学分析

采用分子克隆技术获得麦洼牦牛NPM1基因编码区序列,并通过普通PCR法检测NPM1基因在麦洼牦牛各组织中的表达分布,同时采用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白的基本理化性质进行预测分析。结果表明:麦洼牦牛NPM1基因包含一个长度为885bp的开放阅读框,编码294个氨基酸,与普通牛NPM1基因序列的的同源性为99.4%,且与家犬(93.1%)、人(93.2%)也有较高同源性。根据DNAStar翻译出氨基酸序列,发现麦洼牦牛NPM1基因编码氨基酸序列第239位和261位发生了突变,分别由R变为K和L变为P;所编码的蛋白属于亲水性蛋白,二级结构主要有α-螺旋和无规卷曲;Interpro在线工具对牦牛NPM1基因编码蛋白进行结构域预测,第12~118位间有完整的核质蛋白核心结构域。系统进化树表明麦洼牦牛与黄牛、家犬及人遗传距离最近。     

牦牛MT-3基因生物信息学分析

利用生物基因组学数据库,对牦牛金属硫蛋白3基因进行生物信息学分析,从而预测MT-3基因编码产物的理化性质以及功能结构域,并构建MT-3同源基因的系统进化树。结果表明,牦牛MT-3基因含有1个513 bp的ORF,编码170个氨基酸。MT-3蛋白分子质量约为17 556.37 Da,理论等电点为5.68。MT-3编码产物的二级结构主要以β折叠和无规则卷曲为主,推测是非酶类蛋白质。MT-3具有神经生长抑制活性,通过清除自由基和NO,从而起到保护脑细胞的作用。     

麦洼牦牛Toll样受体1基因的克隆及生物信息学分析

【目的】克隆并分析高原牦牛Toll样受体1基因(TLR1)的特点。【方法】提取麦洼牦牛脾脏RNA,反转录合成cDNA,以其为模板分段扩增后拼接获得麦洼牦牛TLR1基因编码区序列,采用相关分析软件对基因进行序列分析,并对其编码的蛋白质进行基本理化性质分析及预测。【结果】分段扩增获得了TLR1基因1 484bp的上游序列和823bp的下游序列,拼接后获得2 287bp的cDNA序列。TLR1基因系统进化树及同源性比对结果表明,TLR1基因极其保守,牦牛TLR1基因与黄牛、绵羊等哺乳动物遗传距离很近。预测TLR1基因含有1个2 184bp的开放阅读框,编码727个氨基酸,其编码蛋白的分子质量为83.148 7ku;预测TLR1蛋白在第500~600位氨基酸区域含有1个疏水区域,结合跨膜区预测认为该疏水区域可能是TLR1蛋白的一个跨膜区,TLR1蛋白二级结构主要以α-螺旋及自由卷曲为主。【结论】TLR1基因在高原牦牛与平原哺乳动物之间存在较高的同源性,这可能与TLR1蛋白重要的生理功能相关。     

甘南牦牛H-FABP基因CDS区多态性及生物信息学分析

应用PCR产物混合样本DNA池法检测甘南牦牛心脏型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)基因CDS区多态性,并应用生物信息学方法分析甘南牦牛H-FABP蛋白质特性.结果表明:甘南牦牛H-FABP基因CDS区序列与九龙牦牛相同,而与普通牛对比在第3外显子存在*76G>A的同义突变;甘南牦牛H-FABP氨基酸序列没有明显的疏水性区域,也未形成跨膜螺旋区及信号肽,推测其主要在细胞质中发挥生物学作用;甘南牦牛H-FABP基因编码产物二级结构是以α-螺旋和β-折叠为主的mixed型;氨基酸序列与普通牛、山羊、马、人、小鼠、大鼠、鸡、草雀及绿鸭9个物种间同源性较高,与其实际亲缘关系远近一致.     

大通牦牛TLR2基因SNP位点筛选及生物信息学分析

采用DNA混合池扩增后直接测序的方法,对大通牦牛TLR2基因CDS区的SNP位点进行筛选,估算各SNP位点等位基因频率,并通过生物信息学软件预测突变对TLR2 mRNA和蛋白质结构的影响。结果表明,大通牦牛TLR2基因CDS区存在2个SNP位点,分别为G⁶⁷⁷A和G¹⁵⁸⁷A,其中G⁶⁷⁷A为错义突变,导致半胱氨酸(Cys)转变为酪氨酸(Tyr)。生物信息学分析结果表明,G⁶⁷⁷A和G¹⁵⁸⁷A位点均降低了mRNA二级结构的稳定性,且蛋白二、三级结构组成也发生了改变。     

羊绒生长期、休止期陕北白绒山羊皮肤组织中KAP9.2和Hoxc13基因的表达

【目的】研究角蛋白相关蛋白9.2基因(KAP9.2)和Hoxc13基因在羊绒生长不同阶段皮肤组织中的表达量对产绒量的影响,为羊绒生长的调控机理研究奠定基础。【方法】以陕北白绒山羊为研究对象,以奶山羊作为对照,利用qRT-PCR方法,检测羊绒生长期和休止期高产、低产绒量陕北白绒山羊皮肤组织中KAP9.2和Hoxc13基因的表达量。【结果】 对于KAP9.2基因,在羊绒生长期高产绒量陕北白绒山羊的相对表达量极显著低于低产绒量陕北白绒山羊（P＜0.01）,而在羊绒休止期高产绒量陕北白绒山羊的相对表达量却显著高于低产绒量陕北白绒山羊和奶山羊（P＜0.05）;对于Hoxc13基因,在羊绒休止期高产和低产绒量陕北白绒山羊的相对表达量极显著高于奶山羊（P＜0.01）。高产和低产绒量陕北白绒山羊皮肤组织中KAP9.2和Hoxc13基因在生长期、休止期平均相对表达量的变化趋势相似,均表现为生长期极显著低于休止期（P＜0.01）。【结论】KAP9.2对绒毛生长有抑制作用;Hoxc13对KAP9.2基因的表达可能具有调控作用。     

牦牛C1H21orf62基因的克隆、生物信息学及表达分析

应用RT-PCR方法克隆牦牛C1H21orf62基因并进行生物信息学分析,利用实时荧光定量PCR方法检测C1H21orf62基因在有角牦牛和无角牦牛角芽组织的mRNA表达.结果表明,C1H21orf62基因编码区全长662 bp,编码161个氨基酸.C1H21orf62是一种亲水性蛋白,含有13个潜在的磷酸化位点,但无跨膜域和信号肽.C1H21orf62基因mRNA在无角牦牛角芽组织的表达水平极显著高于有角牦牛.     

天祝白牦牛放牧牧草的重金属污染分析

在天祝县炭山岭、抓喜秀龙、松山、西大滩、石门 5个试验区采样,分析天祝白牦牛牧草中重金属污染程度,结果表明:夏秋牧草 Pb、As、Cd 未超标,综合污染顺序为炭山岭(3.646)>石门(2.572) >松山(1.248) >抓喜秀龙(0.714)>西大滩(0.588), Pb、Cd 存在显著相关(P<0.05),炭山岭、石门牧草质量为二级,牧草污染残留较多。冬春牧草 Pb、As、Cd 未超标,综合污染顺序为松山(2.754)>炭山岭(2.719)>石门(2.716)>西大滩(2.568)>抓喜秀龙(2.547),Pb、As、Cd 之间相关性小,牧草质量等级为二级,牧草污染残留物较多。牧草污染冬春季高于夏秋季。     

牦牛SPAG11基因克隆与生物信息学分析

【目的】克隆牦牛(Bos grunniens)精子相关抗原11(Sperm-Associated Antigen 11,SPAG11)基因,并了解其分子结构特征,为进一步研究牦牛SPAG11生物学功能奠定基础。【方法】从牦牛睾丸中提取总RNA,RTPCR扩增并克隆SPAG11C、SPAG11 D和SPAG11E基因,测序后进行生物信息学分析。【结果】克隆出牦牛SPAG11基因3个亚型:SPAG11C、SPAG11 D和SPAG11E,序列大小分别是351,408和261bp,分别编码117,129和80个氨基酸,其中SPAG11 D和SPAG11E序列包含1个完整开放阅读框(ORF),SPAG11C序列包含部分ORF。牦牛SPAG11C、SPAG11 D和SPAG11E核苷酸序列与黄牛(Bos taurus)相应序列相似性最高,而与黄牛β-防御素1相似性较低(50%)。3个蛋白亚型均具有β-防御素家族基本特性,生物信息学分析显示其均含有磷酸化位点。【结论】成功克隆牦牛SPAG11C、SPAG11 D和SPAG11E基因,明确了其编码蛋白的分子结构特征。