蜀永系列茶树品种多酚氧化酶的等电聚集研究

本文用等电聚焦电泳技术，分离蜀永系列茶树品种的多酚氧化酶。结果表明：在等电状态下，多酚氧化酶能保持活力，在所测试的９个品种中，分离出多酚氧化酶同工酶多达１５条。结合品种主要性状，分析了同工酶酶谱与品种形态、生理生化特征的关系，认为从同工酶遗传变异的角度，可根据酶谱组成来预测品种主要性状，进行茶树品种性状的早期鉴定。     

四川主栽茶树品种的多酚氧化酶活性

为了实现控制PPO酶,提高四川红、绿茶加工品质,对四川主要产荼区具代表性的5个茶树栽培品种鲜叶的多酚氧化酶(PPO)进行粗提,测定并比较不同品种的酶活特性.结果表明,当底物邻苯二酚的量为0.3～1.2 mL时,各个品种的酶活力随浓度增加而升高,而超过1.2 mL时,酶活力下降;在25～45℃范围内,各品种的酶活力随温度...     

植物多酚氧化酶的研究进展

植物多酚氧化酶是一类含铜的金属蛋白,催化单元酚和二元酚等多元酚到联苯酚以及联苯酚到醌的脱氢反应。植物多酚氧化酶被认为是许多果实等农产品有害褐变的主要原因,同时被认为与病原体或虫害相互作用有关,只是目前仍缺少直接的证据。就植物多酚氧化酶的功能、发生和基因及其表达等方面进行了简要的综述了探讨。     

草菇多酚氧化酶基因的克隆与表达分析

【目的】解析草菇多酚氧化酶基因家族序列信息,明确其特征和表达模式。【方法】通过转录组测序找出含有酪氨酸酶结构域的基因,并根据搜索得到的序列设计引物,以不同发育时期的草菇 v26 菌株,以及草菇蛋形期外菌膜、菌盖、菌柄等不同组织为材料提取 RNA,经反转录为 cDNA,扩增获得草菇多酚氧化酶基因序列。采用在线生物信息学网站预测草菇多酚氧化酶的理化性质。采用 RT-PCR 的方法,检测草菇不同发育时期和不同组织部位多酚氧化酶的表达模式。【结果】获得 4 个草菇多酚氧化酶基因家族的 CDS 序列,依次命名为 VvPPO1、VvPPO2、VvPPO3、VvPPO4,其中 VvPPO1 CDS 全长 1 596 bp、编码 531 个氨基酸,VvPPO2 CDS 全长 2 685 bp、编码 894 个氨基酸,VvPPO3 CDS 全长 1 593 bp、编码 530 个氨基酸,VvPPO4 CDS 全长2 067 bp、编码 688 个氨基酸。生物信息学分析表明,4 个基因编码的蛋白均含有 2 个铜离子结合区,为亲水性蛋白;RT-PCR 结果显示,4 个基因在草菇发育的菌丝期、原基期、蛋形期、成熟期均有表达,VvPPO1、VvPPO3 和VvPPO4 的表达量在子实体时期高于菌丝期,在蛋形期 VvPPO1 和 VvPPO4 在外菌膜的表达量比在菌柄和菌盖中的表达量高。【结论】在草菇中搜索得到 4 个多酚氧化酶基因,均含有 2 个铜离子结合区,4 个基因在各个发育时期均有表达。     

香蕉多酚氧化酶基因编码序列的电子克隆 和生物信息学分析

用电子克隆方法获得香蕉多酚氧化酶（polyphenol oxidase,PPO）基因编码序列。采用生物信息学方法,对此序列编码的蛋白质从氨基酸组成、理化性质尧疏水性/亲水性、亚细胞定位、高级结构及功能域等方面进行了预测和分析。结果表明：香蕉PPO 基因编码序列全长1602bp,包含1 602 bp开放阅读框（open reading frame, ORF）,含有PPO功能域和酪氨酸酶功能域,在序列组成、高级结构及活性位点等方面,与小麦等其他植物的PPO 基因具有高度的相似性。     

茶树多酚氧化酶同工酶的分离纯化

以龙井43号茶树鲜叶为材料,通过硫酸铵分级沉淀、离子交换层析、凝胶过滤层析等方法对茶树多酚氧化酶同工酶进行分离纯化,最终分离出1个单一同工酶(PPO V),该同工酶亚基大小约为80ku。     

茶树紫黄素脱环氧化酶基因的cDNA克隆及其生物信息学分析

根据GenBank中已登录的植物紫黄素脱环氧化酶（VDE）基因序列，以其高度保守的氨基酸序列设计一对简并引物，采用RT-PCR与3′/5′-RACE相结合的方法，从茶树（Camellia sinensi)中克隆出VDE的全长cDNA，长度为1632bp，分析表明，该序列的5′-端和3′-端的非编码序列长度分别为61bp和140bp，开放阅读框为1422bp，编码473个氨基酸。其转运肽长度为132个氨基酸。成熟蛋白的氨基酸序列与拟南芥，莴苣，菠菜及烟草的同源性分别为83.5%。82.7%,82.1%和83.6%。且有3个特殊的结构域；半胱氨酸富集区，脂肪结合蛋白特征区和由谷氨酸富集的高电荷区，分析表明，茶树VDE具有热稳定性。     

碱蓬多酚氧化酶基因的克隆及序列分析

多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)是一类植物体内广泛存在的由核基因编码的能与铜结合的金属蛋白酶,是碱蓬甜菜红素合成的第一关键酶.以盘锦红海滩碱蓬(盐地碱蓬)为研究材料,采用同源克隆法,根据植物中已克隆出的PPO序列进行引物设计,利用RT-PCR和RACE技术,从碱蓬中克隆出的PPO基因cDNA全长为1830bp,编码609个氨基酸.序列分析表明,与其他植物PPO核苷酸序列的相似性为69％～87％,氨基酸的相似性为49％～62％.碱蓬多酚氧化酶基因的成功克隆,为碱蓬甜菜红素的研究和利用打下了坚实的理论基础.     

烟草多酚氧化酶基因的克隆与序列分析

多酚氧化酶(PPO)在高等植物中广泛存在,其利用分子氧催化氧化酚类物质为醌,对植物的抗虫和抗病起着一定的作用,同时它介导的酶促反应也是烤制中烟草褐变的主要原因。本文采用RT-PCR,成功地从野生烟草(Nicotiana tabacum)叶片中克隆出了PPO c DNA序列。序列分析表明,烟草PPO基因ORF长为1773 bp,编码590个氨基酸,基因登陆号为KC540916,烟草与其他物种PPO的核苷酸序列与氨基酸序列同源性达80%以上,并包含两个高度保守的铜离子结合区域。烟草PPO基因的克隆为烟草的抗性研究和褐化反应的控制研究提供了良好的理论基础。     

橡胶树乳管表达多酚氧化酶基因HbPPO1的克隆与分析

根据EST序列设计引物,应用RACE和RT-PCR技术从橡胶树的胶乳（乳管细胞的胞质成分）中分离到1条长2102bp的cDNA,该序列包含1个1803bp的开放读码框（ORF）,81bp的5’UTR和218bp的3’UTR;ORF预测编码600个氨基酸,其理论分子量为6788kDa,等电点为856,质体定位;蛋白含有多酚氧化酶特有的Tyrosinase、PPO1_DWL和PPO1_KFDV结构域;蛋白与木薯、蓖麻、麻疯树和胡杨中同源蛋白的相似性分别为852%、820%、798%和782%,将基因命名为HbPPO1。结果表明,在所分析的胶乳、树皮和叶片组织中,基因在胶乳中的表达丰度最高,且其表达水平受乙烯利显著抑制。     

花粉管通道法对茶树进行dsTCS基因转化的初步研究

以祁门槠叶群体种茶树植株为受体材料,采用花粉管通道法将茶树咖啡碱合成酶dsRNA (dsTCS)注射到茶花子房中.试验共处理茶花500朵,收获T0种子43粒,加温催芽后出苗38棵,随机选取15棵处理后的茶株和5棵对照茶株,剪取相同部位幼叶,用HPLC测定其咖啡碱含量.检测结果为,处理后的15棵茶株,其平均咖啡碱含量均低于对照茶株,初步表明经花粉管通道法导入的dsTCS部分抑制了茶树体内咖啡碱的合成.     

提取高质量茶树总RNA的方法研究

由于茶树富含多糖、多酚,从茶苗组织中尤其是从茶苗的根中提取高质量的RNA较为困难,试用了多种方法都未能获得高质量的RNA.为此,作者借鉴多年生的草本植物RNA提取方法-CTAB法,并在此基础上进行了改进,首次提取茶苗嫩根中的总RNA.电泳检测显示,该方法提取的总RNA 28S和18S条带清晰且28S较18S条带亮,紫外光谱分析显示A260/A280的比值为1.93.用于RT-PCR反应,成功克隆了492 bp的谷氨酰胺合成酶基因片段.说明用该方法提取的RNA纯度和完整性好.试用该方法从营养成分丰富的茶籽胚中提取总RNA,效果同样很好.     

茶树叶片抗氧化系统对土壤水分胁迫的响应

采用盆栽试验研究了土壤水分胁迫下茶树铁观音和福鼎大白茶2年生幼苗抗氧化系统的响应.结果表明,在土壤水分胁迫下,茶树叶片O2.-的产生速率加快,细胞膜透性增大,MDA含量上升;铁观音SOD、POD、CAT、APX和GR的活性以及AsA和GSH的含量在轻度、中度水分胁迫下上升,在重度水分胁迫下下降;而福鼎大白茶的保护酶活性和抗氧化剂含量在轻度水分胁迫下上升,在中度、重度水分胁迫下下降.在正常供水或水分胁迫下,铁观音均表现出更强的抗氧化能力,表明生长在同一生境中的铁观音对土壤水分的生态适应能力高于福鼎大白茶.     

茶树CHS基因结构及编码区单核苷酸多态性分析

【目的】通过试验获得茶树CHS基因（CsCHS）gDNA序列,以进一步确定CsCHS基因结构;研究CsCHS编码区单核苷酸多态性,并结合茶树多酚含量进行关联分析,寻找基因中可能存在的与茶多酚含量存在显著或极显著相关关系的SNP位点。【方法】根据NCBI数据库中已有CsCHS序列设计特异性引物,再分别以基因组DNA和cDNA为模板进行PCR扩增,经克隆、测序获得CsCHS1、CsCHS2、CsCHS3三个基因的gDNA和cDNA全长序列,通过序列比对方法确定CsCHS结构。利用Compute pI/Mw、SOPMA等软件对所得序列进行生物信息学分析,预测和比较CsCHS1、CsCHS2和CsCHS3三者蛋白质结构。以茶多酚含量差异较大的57份茶树品种为材料,分别以57份材料的cDNA为模板,用特异性引物进行PCR扩增,然后利用PCR产物直接测序法筛查CsCHS编码区序列的单核苷酸多态性。结合CsCHS编码区序列单核苷酸多态性和57份材料多酚含量,利用软件TASSEL进行关联分析,筛选基因中可能与茶多酚含量存在显著或极显著相关关系的SNP位点。【结果】试验获得CsCHS1、CsCHS2和CsCHS3的cDNA序列长度分别为1 277、1 320和1 242 bp,各自均包含一个长度为1 170 bp的开放阅读框;CsCHS1、CsCHS2和CsCHS3的gDNA序列长度分别为1 600、1 330和1 607 bp。通过gDNA序列和cDAN序列比对,结合真核生物内含子GT-AG法则,确定CsCHS1、CsCHS3分别包含2个外显子和1个内含子,内含子大小分别为323和356 bp,CsCHS2可能没有内含子。根据CsCHS1、CsCHS2和CsCHS3 cDNA序列推导三者对应氨基酸序列,比较三条氨基酸序列发现三者氨基酸同源性较高,达到92.6%-95.4%,CHS蛋白亚家族中的特征性保守位点在这三条序列中都能找到,生物信息学分析结果显示CsCHS1、CsCHS2和CsCHS3三者蛋白质结构高度相似。CsCHS1编码区序列中共发现71个SNP位点,SNP出现频率为1SNP/16.48 bp,无Indel,基因核苷酸多样性（π）值为0.01088;CsCHS2编码区序列中共发现55个SNP位点,SNP出现频率分别为1SNP/21.27 bp,CsCHS2核苷酸多样性（π）值（0.00530）明显低于CsCHS1;因扩增CsCHS3 cDNA序列的PCR反应成功率低,未对该基因遗传多样性进行分析。通过关联分析分别从CsCHS1和CsCHS2中找到2个和4个与茶叶多酚含量相关的SNP位点。【结论】CsCHS1和CsCHS3属于保守型CHS基因,且CsCHS1、CsCHS2和CsCHS3蛋白质结构高度相似,推测三者可能在茶树的不同部位或不同生长阶段发挥类似作用;CsCHS1和CsCHS2活跃,二者编码区内可能存在突变热点区。     

一种基于变性高效液相色谱技术筛选单核苷酸多态性并估算基因频率的方法

选取生产性能具有明显差异的4个鸡品种(莱航鸡、隐性白洛克鸡、丝羽乌骨鸡和杏花鸡)为材料,利用变性高效液相色谱(DHPLC)技术检测鸡生长激素基因部分序列(518bp)的多态性,快速筛查到5个可能与生产性能相关的单核苷酸多态性(SNPs)．根据DHPLC杂合谱型与测序基因型一一对应的关系,介绍了当所检测目的DNA片段中含有多个SNPs时基因频率估算的简单方法,比较估算的和PCR-RFLP统计的基因频率,发现差异不显著,证明该估算方法有一定的可行性．     

信阳水牛PRL基因单核苷酸多态性与生长性状的相关性

以50头信阳水牛为材料,以GenBank公布的牛PRL基因序列(NC_007324)作为参照序列,设计PCR引物,对PRL基因的第2、4、5外显子进行变异检测,并将其多态性与部分生长性状进行相关分析.结果表明:试验牛群体中,每一外显子的PCR扩增产物经SSCP分析均出现不同带型；试验牛PRL基因第2、4、5外显子各存在...     

茶(Camellia sinensis)花粉及其蜂粮中花粉粒的显微结构

采用光学显微镜和扫描电镜观察茶蜂花粉及其不同酿制时间的蜂粮中花粉粒的外部形态和萌发沟,未发现花粉壁和花粉粒结构被破坏的迹象.通过体外模拟消化试验,采用光学显微镜和透射电镜观察,发现经模拟消化的蜂粮中花粉粒内含物外吐的数量比蜂花粉多,而且随着酿制时间的延长,其内含物外吐的花粉粒所占的比例增加.结果提示,同种粉源的蜂粮比蜂花粉更易于被消化.     

茶树的RAPD标记向SCAR标记转化的研究

SCAR标记是在RAPD技术的基础上发展起来的一种新型分子标记技术,相对其他分子标记,它具有开发成本低,稳定性高,单位点多态等特点,将为茶树分子育种开辟一条新的有效途径。通过将随机引物在不同茶树品种基因组DNA中扩增得到的特异性片段,经回收、克隆、测序后重新设计1对特异性引物,将RAPD标记成功转化成SCAR标记,提高了分子鉴定的稳定性。     

茶树扦插生根过程中3种氧化酶活性及多酚含量变化研究

对3个国家茶树品种扦插生根情况以及扦插过程中3种氧化酶活性和茶多酚含量变化进行研究。结果表明,不同品种间扦插繁育能力存在差异,扦插成活率排序为：皖茶91>舒茶早>石佛翠。在扦插过程中,PPO活性均呈上升→下降→上升趋势,扦插15 d时达到高峰且皖茶91高于舒茶早和石佛翠;POD活性与扦插生根呈负相关,除石佛翠呈上升趋势外,其他2个品种均先降后升;IAAO活性除石佛翠基本无变化外,其他2个品种均呈上升→下降→上升趋势,皖茶91变化幅度比舒茶早大;这3种氧化酶与茶树扦插成活率具有明显的相关性。插穗叶片中茶多酚含量的增加也有利于插穗成活率的提高。